CN109504625A - 一株蜡状芽孢杆菌dif1及其生产的微生物菌剂和应用 - Google Patents

一株蜡状芽孢杆菌dif1及其生产的微生物菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株蜡状芽孢杆菌DIF1及其生产的微生物菌剂和应用，该菌株已于2018年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018274。本发明所述蜡状芽孢杆菌DIF1具有较强的异化还原Fe(III)的还原功能，可以高效的还原可溶性Fe(III)和固态Fe(III)，同时，这株蜡状芽孢杆菌DIF1具有较强的六价铬还原能力和产电能力。本发明揭示了蜡状芽孢杆菌的新性质及其功能方面的应用研究，为异化铁还原菌在环境污染物的治理方面提供了新的材料。

Description

一株蜡状芽孢杆菌DIF1及其生产的微生物菌剂和应用
技术领域
本发明涉及环境生物修复，尤其涉及一株蜡状芽孢杆菌DIF1及其生产的微生物菌剂和应用。
背景技术
铁是地球上分布最广的元素之一，是地壳中丰度第四高的元素，是重金属迁移转化以及其它有机污染物运移等地质过程及环境变化的关键因子之一。微生物是地表铁循环的核心参与者，以细菌胞外发生铁氧化或还原反应为特征的异化作用是铁循环的重要驱动力。以胞外铁氧化物为末端电子受体的微生物异化Fe(Ⅲ)还原有可能是最早的微生物代谢形式。
异化铁还原菌是指一类能够以Fe(III)作为唯一电子受体、Fe(III)被还原、同时氧化有机碳源，并从中获取能量供自身生长的一类微生物的统称。异化铁还原菌在细菌呼吸和生长过程中能够还原多种金属离子，去除有机物和重金属,通过胞外电子转移机制将胞内有机物代谢的电子传递到胞外的电子受体，例如固态金属氧化物，使金属氧化物还原。因而，异化铁还原菌在金属元素的地球化学循环和能源的回收利用等方面发挥重要作用。
铬污染是目前最为普遍的重金属污染物之一，一定浓度的Cr(VI)会威胁生命健康。铬主要用于金属加工、电镀、制革等行业，工业生产过程中常加入铬酸盐以防止循环水对设备的腐蚀。而工业部门排放的废水和废气，是环境中铬的人为来源。虽然工业废水中的铬主要呈现为三价形态，但排放到自然环境中的三价铬在环境影响下会转变成毒性更强的六价铬。水体环境中铬一般以Cr(VI)和Cr(III)的形式存在，Cr(VI)具有很强的流动性，长期暴露在六价铬环境中会慢性中毒引发癌症。将Cr((VI)还原为Cr(III)会降低毒性。还原铬的方法有化学还原、吸附、离子交换、膜分离、生物修复和电化学修复。其中生物修复技术为铬污染区提供了一种无二次污染的手段。
发明内容
发明目的：本发明目的在于提供一株蜡状芽孢杆菌DIF1，其对铁离子和铬离子具有还原作用，可应用于铁的回收利用和修复重金属离子引起的环境污染。本发明的蜡状芽孢杆菌DIF1具有较好的产电能力，可用于微生物燃料电池。
为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种蜡状芽孢杆菌DIF1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年5月15日，保藏号为CCTCCNO：M2018274。
本发明所述的蜡状芽孢杆菌DIF1，其为革兰氏阳性菌，细菌呈杆状，末端方，菌落呈灰白色圆形，其最适生长温度为30℃，最适生长pH值为7。
第二方面，本发明提供了蜡状芽孢杆菌DIF1在异化还原Fe(III)方面的应用。
第三方面，本发明提供了蜡状芽孢杆菌DIF1在六价铬还原方面的应用。
第四方面，本发明提供了蜡状芽孢杆菌DIF1生产的微生物菌剂，所述微生物菌剂由蜡状芽孢杆菌DIF1发酵产生。
上述发酵培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基包括NaCl 8-12g/L，优选为10g/L，酵母提取物4-6g/L，优选为5g/L，蛋白胨8-12g/L，优选为10g/L，pH为6.8-7.2，优选pH为7.2。
第五方面，本发明提供了蜡状芽孢杆菌DIF1的培养方法，所述方法包括将蜡状芽孢杆菌DIF1接种于LB液体培养基中振荡培养。
所述振荡培养的温度为28-32℃，优选为30℃，转速为100-300rmp，优选为120rpm。
第六方面，本发明提供了蜡状芽孢杆菌DIF1或蜡状芽孢杆菌DIF1制备的微生物菌剂在微生物燃料电池中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明分离得到蜡状芽孢杆菌DIF1，该菌具有较强的异化还原Fe(III)的还原功能；蜡状芽孢杆菌DIF1还能够有效还原Cr(VI)离子；蜡状芽孢杆菌DIF1能够应用在微生物燃料电池中作为产电菌；本发明拓宽了人们对蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)在其功能方面的应用研究思路，为异化铁还原菌在环境污染物的治理方面提供了新的材料，具有较强的实际应用价值。
附图说明
图1为蜡状芽孢杆菌DIF1的菌落电镜图片；
图2为蜡状芽孢杆菌DIF1的16SrDNA电泳图；
图3为蜡状芽孢杆菌DIF1的菌落图；
图4为基于16SrDNA序列的蜡状芽孢杆菌DIF1的***发育树；
图5为蜡状芽孢杆菌DIF1在还原柠檬酸铁的实验中铁还原率曲线图；
图6为蜡状芽孢杆菌DIF1在还原氧化铁的实验中铁还原率曲线图；
图7为蜡状芽孢杆菌DIF1在还原Cr(VI)的曲线图；
图8为蜡状芽孢杆菌DIF1在微生物燃料电池中的时间功率曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作出进一步说明。
实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定
1.1实验用品
实验样品取自梅山铁矿地下铁矿土。
DM培养基：NaHCO3 2.5g/L、CaCl2 0.08g/L、NH4Cl 1.0g/L、MgCl2·6H2O 0.2g/L、NaCl 10g/L、HEPES 7.2g/L、酵母提取物0.5g/L、乳酸0.9g/L、Wolfe's维生素溶液(Wolfe'svitamin solution)1mL/L、Wolfe's矿物质溶液(Wolfe's mineral solution)10mL/L，pH7.2，Wolfe's维生素溶液和Wolfe's矿物质溶液均通过灭菌滤膜加入高温灭菌后的DM溶液。
LB液体培养基：NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH 7.2。
LB固体培养基：NaCl 10g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、琼脂15g/L，pH7.2。
电池阴极室电解液：铁***50mmol/L、磷酸二氢钾40mmol/L、磷酸氢二钾60mmol/L。
1.2双室微生物燃料电池(MFC)组装和启动
按以下步骤组建双极室微生物燃料电池：
(1)将配置完毕的DM培养基、处理好的碳片电极和质子交换膜、报纸紧密包好的定制双极室玻璃瓶和橡胶塞放入高压灭菌锅灭菌，121℃灭菌30min；
(2)灭菌完毕的实验材料放入超净工作台紫外杀菌20min；
(3)用硅橡胶和质子交换膜将两个电极室连接起来，铁夹夹住防止脱落；
(4)阴极室倒入50mmol/L铁***溶液100mL，阳极室装填20g细密铁矿土并倒入100mL的DM培养液；
(5)阳极室装入电极，用橡胶塞和封口膜将阳极室密封，阴极室留一个小孔以便氧气的通入，电池用锡纸包裹；
(6)组装完毕的双极室放入恒温培养箱中，温度设为25℃。电池外接5kΩ电阻，采用北京瑞博华公司的30通道USB数据采集卡采集电池的输出电压。每周定期更换DM培养基和铁***溶液，使电池稳定运行，时间间隔为一个运行周期。
1.3菌株的分离筛选
在无菌操作台上，从成功启动的电池中取出电极，用挑菌棒从细菌密集处挑取细菌，在配置好的固体LB培养基上涂布划线，放入30℃恒温培养箱，过夜培养。选取LB固体培养基表面单独生长的菌落，在新的LB固体培养基上划线，过夜培养。如此重复多次，直至细菌生长形态稳定，如图3所示。将纯化得到的菌株进行鉴定(见下文)，为蜡状芽孢杆菌，于2018年5月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2018274。
将稳定的培养皿置于4℃冰箱保存备用，同时，用LB液体培养基摇菌(30℃，120rpm)得到的菌液与60％灭菌甘油1:1混合，放入负80℃冰箱冻存。
1.4菌株特性及鉴定
(1)菌株的菌落形态为：在LB固体培养基中生长，菌落呈灰白色、圆形，见图3，用革兰氏染色显示细菌呈杆状，末端方，见图1，为革兰氏阳性菌，其最适生长温度为30℃，最适生长pH值为7。
(2)对菌株进行16SrDNA基因分子的鉴定：以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1418bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图2所示，PCR产物经纯化后，测定其全序列。结果如SEQID No：1所示，16SrDNA基因序列长度为1418bp，采用BLAST分析法将16SrDNA基因序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与Bacillus cereus的亲缘关系最接近，同源性高达99％以上，命名为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1，基于16SrDNA基因序列的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)DIF1的***发育进化树见图4所示。
实施例2：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在还原Fe(III)方面的应用
2.1蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1还原柠檬酸铁实验：
配置DM溶液，溶液中加入2mmol/L柠檬酸铁，高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，按照2.1部分的接种浓度，放入菌液密封，接种浓度为107/L，对照实验不加入蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1菌液，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铁还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的Fe2+浓度变化及细菌生长曲线(OD600)，结果见图5，结果表明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在120h铁还原能力约为0.55mmol/L，而对照实验仅有微量Fe2+产生。
2.2蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1还原氧化铁实验：
配置DM溶液，溶液中加入100mg/100ml氧化铁。高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，按照2.1部分的接种浓度，放入菌液密封，对照实验不加入蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)DIF1菌液，置于30℃恒温培养箱中暗光培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，利用紫外分光光度计分别检测样品的Fe2+浓度变化及细菌生长曲线(OD600)，结果见图6，结果表明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在96h铁还原能力约为0.62mmol/L，而对照实验仅有微量Fe2+产生，说明蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)DIF1具有异化铁还原能力。
从以上的实验结果可看出，本发明的蜡状芽孢杆菌高效的还原柠檬酸铁和氧化铁中的Fe(III)，表明本发明的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1具有较强的异化还原Fe(III)的还原功能。
实施例3：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在六价铬还原方面的应用
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1对Cr(VI)还原能力验证实验：
配置DM溶液，溶液中加入2mmol/L无水铬酸钠，高温灭菌后加入无菌的100ml血清瓶中，按照2.1部分的接种量，放入蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1菌液密封，对照实验不放入菌液，置于30℃恒温培养箱中暗培养。每隔12h，在无菌操作台中提取一次样品，按照测铬还原标准曲线的方法，利用紫外分光光度计分别检测样品的Cr6+浓度变化及细菌生长曲线(OD600)，结果如图7所示显示，0～24h之间，Cr6+浓度降低迅速，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在96h铬还原能力约为1.44mmol/L，对照实验Cr6+浓度几乎没有变化，说明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1具有较好的铬还原能力。
实施例4：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1在微生物燃料电池中的应用
将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1按照2.1部分的浓度接种，置于本发明1.2部分构建的双室微生物燃料电池阳极，测定功率密度曲线，微生物燃料电池的输出功率密度是该装置输出功率与采用的电极面积之比，是衡量微生物燃料电池产电效率的重要指标。本实验采用北京瑞博华公司的30通道USB数据采集卡采集各MFC装置的闭路电压，每隔1h记录一次每个电池装置的闭路电压。由欧姆定律及相关电学公式得出输出功率密度的计算公式：
其中P闭合表示输出功率密度，E表示电池装置的输出电压，R外接表示电池装置的外接电阻，S电极表示碳片电极的面积。已知外接电阻为5kΩ，电极面积为4cm2。所得功率密度曲线如图8所示，说明蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)DIF1具有较好的产电能力，可以用于微生物燃料电池。
从以上结果可以看出，本发明从梅山铁矿中分离得到蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)DIF1，并发现其较强的Fe(III)和Cr(VI)离子还原功能，且本发明的蜡状芽孢杆菌DIF1还可作为产电菌应用于微生物电池，这拓宽了人们对蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)DIF1在其功能方面的应用研究思路，并为铁还原菌在环境污染物的治理方面提供了新的材料，具有较强的实际应用价值。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一株蜡状芽孢杆菌DIF1及其生产的微生物菌剂和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1418
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌 DIF1(Bacillus cereus DIF1)
<400> 1
gcagtcgagc gaatggatta agaagcttgc tcttatgaag ttagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120
gataacattt tgaaccgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg cttcggctgt cacttatgga 180
tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagtg ctagttgaat 420
aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480
cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggtg 540
gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg gagggtcatt ggaaactggg 600
agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660
atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt aactgacact gaggcgcgaa 720
agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780
aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac gcattaagca ctccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaaa 960
accctagaga tagggcttct ccttcgggag cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080
gccatcatta agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt 1200
acaaagagct gcaagaccgc gaggtggagc taatctcata aaaccgttct cagttcggat 1260
tgtaggctgc aactcgccta catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag gagtttgtaa 1380
cacccggaaa gtcggtgggg taaacctttt ggagccag 1418

Claims (7)

1.一株蜡状芽孢杆菌DIF1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2018年5月15日，保藏号为CCTCCNO：M2018274。
2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌DIF1，其特征在于，其为革兰氏阳性菌，细菌呈杆状，末端方，菌落呈灰白色圆形。
3.根据权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌DIF1在异化还原Fe(III)方面的应用。
4.根据权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌DIF1在六价铬还原方面的应用。
5.一种利用权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌DIF1生产的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂由蜡状芽孢杆菌DIF1发酵产生。
6.如权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌DIF1的培养方法，其特征在于，所述方法包括将蜡状芽孢杆菌DIF1接种于LB液体培养基中振荡培养。
7.根据权利要求1或2所述的蜡状芽孢杆菌DIF1或如权利要求5所述的微生物菌剂在微生物燃料电池中的应用。
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