CN109496237A - 用于稳定化蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开的特征在于通过在培养细胞、表达产物和/或回收产物时在一个或多个步骤降低表达产物的细胞的温度来增加细胞代谢产物(例如蛋白质)的量的方法和组合物。

Description

用于稳定化蛋白质的方法
相关申请
本申请要求2016年6月10日提交的美国序列号：62/348595的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开涉及用于抑制在培养细胞中表达的细胞产物(例如多肽)的解离的方法和组合物。
发明背景
细胞产物如重组治疗性蛋白质通常在细胞表达***，例如哺乳动物细胞表达***中表达。数百种市场批准的生物药物在哺乳动物细胞系中表达。然而，与其生产相关的高成本促成增加全球健康成本。产物解离事件可以导致从细胞培养物中生长的细胞表达的蛋白质或多肽的低于预期的稳定性或活性。通过非还原性SDS电泳测定法检测这些事件，所述测定揭示多肽产物的解离的存在，其中完整产物的具有低丰度。其他质量控制测试未揭示多肽解离事件。
此外，产物解离事件可以损害表达的蛋白质的功能和稳定性。因此，需要开发和生产用于抑制在培养细胞中表达的多肽的解离的方法。
发明概述
本公开部分基于以下发现：下文鉴定的许多措施可以抑制表达的产物(例如多肽)的解离。
在一方面，本发明的特征在于生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
在另一方面，本发明的特征在于生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
在另一方面，本发明的特征在于生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
在所述生产阶段的结束时将所述生产培养物冷却至T收获温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从生产培养物中分离细胞和收集上清液，将所述DOT增加至大于40％至小于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
在另一方面，本发明的特征在于生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
(i)以从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述方法包括：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度T生产，所述温度T生产是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，其是低于T生产的温度，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质，或稳定化的产物例如稳定化的蛋白质的制剂。
在另一方面，本发明的特征在于通过本文所述方法生产的稳定化的蛋白质或稳定化的蛋白质的制剂。
在另一方面，本发明的特征在于包含通过本文所述方法生产的稳定化的蛋白质或稳定化的蛋白质的制剂的药物组合物。
能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
在另一方面，本发明的特征在于能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
在另一方面，本发明的特征在于能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
在所述生产阶段的结束时将所述生产培养物冷却至T收获温度，所述T收获温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从所述生物反应器中除去所述生产培养物，将所述DOT增加至大于40％至小于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
在另一方面，本发明的特征在于能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
(i)以从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述生物反应器进一步能够：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，所述温度低于T生产。
在实施方案中，本文公开的方法包括并且本文公开的生物反应器能够，维持许多条件中的任一个，例如，进料/补充物或物理化学条件的存在，以促进生产培养物中更有利的氧化还原电位，例如，在生长阶段期间，例如在指数生长阶段期间。通常，例如，至少部分地在后期阶段，例如在收获或收获后阶段，维持该条件。举例来说，当细胞进入收获阶段和收获后阶段以优化稳定化的产物(例如稳定化的蛋白质)的生产的水平维持条件，并且任选地维持直至产物与背景工艺和细胞杂质分离。
在实施方案中，进料或补充物包含例如在以下水平的Zn2+、Mn2+和Cu2+盐：在生产培养物中分别提供范围为200至400μM的残留浓度的Zn2+离子和范围为10至100μM的残留浓度的Mn2+和Cu2+离子。
在实施方案中，生产培养物的溶解氧张力(DOT)维持在至少40％和70％的空气饱和度之间。
在实施方案中，最初在第一温度(例如36℃至37℃)维持生产培养物，并在例如在预先确定的点，例如一旦生产开始退出生长阶段转换为第二(通常更低)温度(例如30℃至33℃)。在实施方案中，最初控制生产培养物的温度在36℃至37℃，但然后一旦生产培养物开始退出生长阶段(通常是15天生产期间的第5天至第7天)将温度控制在30℃至33℃。
在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够将生产培养物的氧化还原电位维持向相对更氧化的电位，例如通过使用一个或多个如上所述的条件，例如使稳定化的产物的生产增加例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的氧化电位。另外的方法也可以用于修改氧化还原电位向更氧化的电位，并且这些包括影响培养基组分的其他氧化还原电位或细胞代谢的改变以提高促氧化代谢物，如脱氢抗坏血酸/抗坏血酸、谷胱甘肽/谷胱甘肽-SH和半胱氨酸/胱氨酸，与温度和DOT的组合。
在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够使用氧化还原电位指示标记(例如染料或分子探针)以感测生产培养物内细胞的氧化还原电位的变化以影响适当的工艺变化以防止细胞表达的后续产物解离。在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够使用氧化还原电位管线内监测探针，例如如本文所述的Mettler Toledo。
在实施方案中，方法包括使用分析方法以探测酶活性(例如谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶)和/或参与产物解离反应并由细胞系表达的辅因子和相关代谢产物(例如与磷酸戊糖途径相关的辅因子和相关代谢产物，例如葡萄糖-6-磷酸、NADPH、NADP+、6-膦酰基葡萄糖内酯(6-phosphonoglucolactone)、6-磷酸葡萄糖酸盐或核酮糖-5-磷酸)的丰度。在一个实施方案中，探测酶活性以及辅因子和相关代谢产物的丰度用于选择细胞系和克隆，其具有降低的或所需水平的细胞因子，所述细胞因子在进一步加工期间不促进产物解离。
在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够将培养的细胞冷却至15±3℃，然后使用深度过滤或离心和深度过滤步骤将它们与含有产物的上清液分离。
在实施方案中，一旦生产培养物已达到目标温度以启动收获步骤，方法包括或者生物反应器能够例如通过工艺控制确保所有可能拮抗生产培养物的充氧的元素最小化。在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够：如果激活则抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制碱控制，如果激活则按需抑制CO2气流控制，或如果激活则抑制进料应用。
在实施方案中，一旦生产培养物已达到目标温度以启动收获步骤，方法包括或者生物反应器能够例如通过工艺控制确保所有可能促进生产培养物的充氧的元素最大化。在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够以下的一项或多项：如果未激活则激活喷射的空气流；如果未激活则激活喷射的氧气流；如果未激活则激活顶部空间压力；如果未激活则激活顶部空间空气和/或氧气流；确保细胞培养物在收获操作期间排出时保持充分混合和曝气；确保设计生物反应器收获线与内孔尺寸和壁强度有关，以在收获操作期间抵抗坍塌和阻碍所需的流速；优化深度过滤面积，以避免过滤器澄清步骤期间过滤器的堵塞和结垢，从而增加过滤器外壳内细胞培养物的停留时间；以及确保在充分曝气和混合的收集容器(钢或单次使用的)中收集无细胞上清液。在实施方案中，设计用于方法的收获容器以确保其通过以下一项或两项促进良好的表面充氧：通过设计指向容器壁的内部喷嘴将收集的滤液冲击到容器壁表面上，迫使滤液沿容器壁向下倾泻；以及用于在收集滤液之前用气体或任何给定的空气和氧气的混合物组成的气体环境填充收集容器的能力，以促进收集的滤液的充氧达到大于>40％空气饱和度和≤500％空气饱和度。
在实施方案中，建议用氧化还原、DOT和pH传感器监测生物反应器和细胞澄清步骤之间以及细胞澄清步骤和上清液收集容器(例如收获容器)之间的流动路径。另外，可以调节生物反应器中的参数以改变两个流动路径或上清液收集容器(例如收获容器)内的氧化还原、DOT和pH。
在一个方面，本公开的特征在于用于通过细胞生产产物(例如多肽，例如重组多肽)的方法，包括提供包含所述细胞并包含编码所述多肽的多核苷酸序列的细胞系。在允许表达产物(例如多肽)的条件下培养生产培养物，将生产培养物冷却至30℃至33℃，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度，以从而制备产物，例如多肽。将生产培养物进一步冷却至T收获温度，例如15℃，在生产阶段结束时进行。
在实施方案中，产物是包含超过一个半胱氨酸残基的多肽，例如第一、第二、第三和第四或更多个半胱氨酸残基。在实施方案中，天然形式的多肽包含第一和第二半胱氨酸残基之间的巯基键。在实施方案中，多肽包含第三和第四半胱氨酸残基之间的巯基键。在实施方案中，T收获足够低以减少培养物中溶解氧的消耗，使得上清液中可获得足够的溶解氧以防止细胞因子(酶和代谢物两者)的激活并抑制二硫键的解离。在实施方案中，与参照(例如获得自其他未冷却至T收获的类似工艺的解离的水平)相比，T收获足够低以防止二硫键的解离至少10、20、30、40、50、60、70、80或90％。
在实施方案中，方法包括从在T收获下的培养细胞中分离表达的多肽。
在实施方案中，方法包括当表达多肽的细胞系冷却至T收获时纯化表达的多肽。
在实施方案中，将细胞系在第一温度T培养下培养，并随后在指数生长阶段后冷却至温度T生产(例如30℃至33℃)，并在生产阶段的结束进一步冷却至收获温度T收获(例如12℃-18℃)。在实施方案中，T培养大于T生产。在实施方案中，T生产大于T收获。
在实施方案中，将通常在37℃的T培养下培养的细胞置于低于35℃、34℃、33℃、32℃、31℃或30℃的T生产。在实施方案中，将培养物进一步冷却至29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、5℃或4℃，或低于15℃，低于环境温度和/或低于室温的T收获。在实施方案中，T收获低于6-24℃。在实施方案中，T收获是15+/-3℃。
例如，在实施方案中，T生产比T培养低至少1℃、3℃或6℃。
例如，在实施方案中，T收获比T生产低至少2℃、5℃或8℃。
在实施方案中，在T收获下从上清液分离培养的细胞。
在实施方案中，进行分离步骤，在T收获下从上清液的另一组分分离多肽。
在实施方案中，在T收获下将多肽，例如作为上清液的组分施加至滤器。
在实施方案中，将生物反应器的内容物冷却至T收获。
在实施方案中，在适于使所述细胞培养物达到T收获的温度下，通过与包含流体例如水的构件例如冷却夹套接触来冷却所述细胞培养物。
在实施方案中，方法进一步包括在T培养期间提供营养物或氧。
在实施方案中，在T培养、T生产和/或T收获期间搅动细胞培养物。
在实施方案中，方法进一步包括回收表达的多肽。
在实施方案中，在T收获下细胞或其产物在收获容器中。
在实施方案中，多肽是表1和2中提供的多肽之一，或其变体。
在实施方案中，多肽是抗体，例如单克隆抗体，例如IgG1抗体，或编码抗体的多核苷酸。在实施方案中，多核苷酸编码的抗体中的一个或多个半胱氨酸由另一种氨基酸取代。在一些实施方案中，该一个或多个半胱氨酸由一个或多个丝氨酸残基取代。
在实施方案中，细胞系衍生自哺乳动物细胞。
在一个方面，本公开的特征在于用于在细胞中生产本文所述的产物的方法。在实施方案中，产物是多肽，例如重组多肽。
可以使用本文所述的任何方法或组合物生产的产物的实例包括重组产物，或其中至少一个部分(portion)或部分(moiety)是基因工程化的结果的产物。本文所述的重组产物可用于诊断或治疗目的。在一个实施方案中，产物包含多肽，例如抗体分子(例如，双特异性或多形式抗体分子)、融合蛋白或蛋白质缀合物。本文所述的方法和组合物可以特别地用于难以生产的产物，例如，大量或具有足够的质量用于商业或治疗用途，例如下一代生物制剂(例如，融合蛋白、双特异性或多形式抗体分子、多聚体蛋白质和糖基化蛋白质)。在一个实施方案中，如本文所述的细胞(例如用于生产产物)表达产物。在一个实施方案中，细胞包含编码本文所述产物(例如选自表1、2、3或4的多肽)的外源核酸。产物的另外的实例在标题为“产物”的小节中描述。
在此类实施方案中，可以通过与不具有修饰的细胞比较来确定细胞的任何上述特征的增加或减少。
与未经受降低的温度的细胞相比，本文所述的方法和生物反应器导致产物的生产增加。生产的增加可以通过由细胞生产的产物的增加的量(amount)、产量或数量(quantity)和/或增加的生产率来表征，其中生产率等于产物随时间的量。在一个实施方案中，例如如与由未经受降低的温度的细胞的生产相比，产物(例如重组多肽)的生产增加1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
与未经受降低的温度的细胞相比，本文所述的方法和生物反应器还可以导致产物质量的改善。产物质量的改善可以通过以下的一项或多项来表征：解离(例如减少多肽解离成活性较低的形式)；聚集(例如减少聚集体或聚集)；适当的折叠或组装(例如减少错误折叠或展开的产物；或部分组装或分解的产物)；翻译后修饰(例如增加或减少糖基化异质性，更高百分比的所需或预先确定的翻译后修饰)；破碎(fragmentation)(例如减少破碎)；二硫键扰乱(disulfide bond scrambling)(例如减少由于二硫键扰乱导致的不希望的同种型或结构)。在一个实施方案中，例如如与由未经受降低的温度的细胞的质量相比，产物(例如重组多肽)的质量增加例如1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍。
在实施方案中，用于生产如本文所述的产物的方法可以用一个或多个另外的步骤进行，以增强多肽的稳定性或活性。这些包括但不限于：向细胞引入改善ER加工能力(ER扩张)或分泌的修饰；从细胞或细胞的后代，或从由细胞或细胞的后代调节的培养基获得产物；从至少一种细胞或培养基组分分离产物；和/或分析产物，例如，分析活性或结构部分的存在。在一个实施方案中，方法进一步包括用于通过引入编码PD1、BiP、ERO或XBP1的核酸来改善ER加工能力(或ER扩张)的步骤。在一个实施方案中，方法进一步包括用于通过调节SNARE机制或分泌途径中涉及的其他机制，例如通过引入编码SNARE组分的核酸来改善分泌能力或分泌率的另外的步骤。
产物
适于本文所述方法的产物包括多肽，例如重组蛋白质；核酸分子，例如DNA或RNA分子；多聚体蛋白质或复合物；脂质包裹的颗粒，例如病毒样颗粒、囊泡或外排体；或其他分子。在实施方案中，产物是多肽，例如重组多肽。例如，重组多肽可以是难以表达的蛋白质或具有复合和/或非天然结构的蛋白质，例如下一代生物制剂，例如双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白质。
在本文所述的任何方法中，用于生产产物的方法进一步包括向细胞中引入编码产物(例如多肽，例如重组多肽)的外源核酸。
在本文所述的任何组合物、制剂、生物反应器或方法中，产物(例如重组多肽)是治疗性多肽或抗体分子，例如抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体分子是双特异性抗体分子，例如BiTE(双特异性T细胞衔接)、DART(双重亲和重新靶向或重定向T细胞)。
在一个实施方案中，产物，例如重组多肽，选自表1、表2、表3或表4。
在实施方案中，产物由细胞稳定表达。在一个实施方案中，将编码产物(例如重组多肽)的外源核酸整合到细胞的染色体基因组中。或者，产物由细胞瞬时表达。在一个实施方案中，编码产物(例如重组多肽)的外源核酸未整合到细胞的染色体基因组中。
宿主细胞
本文提供了用于生产本文所述产物的细胞和工程化此类细胞的方法。
在本文所述的任何组合物、制剂或方法中，细胞是真核细胞。在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、藻类细胞或植物细胞。在一个实施方案中，细胞是啮齿动物细胞。在一个实施方案中，细胞是CHO细胞。CHO细胞的实例包括但不限于，CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHODXB11、CHOZN或CHO衍生的细胞。
在本文所述的任何组合物、制剂或方法中，细胞选自下组：HeLa、HEK293、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、EB66、C127、Lcell、COS(例如COS1和COS7)、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN。
在一个实施方案中，细胞是哺乳动物细胞以外的真核细胞，例如昆虫、植物、酵母或藻类细胞。在一个实施方案中，细胞是原核细胞。
在本文所述的任何方法或细胞(例如，工程化的细胞)中，细胞表达或包含产物，例如重组产物，例如选自下组的下一代生物制剂：双特异性抗体、融合蛋白或糖基化蛋白质。
在本文所述的任何方法或细胞(例如，工程化的细胞)中，细胞是选自下组的CHO细胞：CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11、CHOZN或CHO衍生的细胞。
组合物和制剂
在一个方面，本公开的特征还在于通过本文描述的方法制备的本文所述的产物的制剂。在一个实施方案中，制剂中至少70、80、90、95、98或99％(重量或数量)的产物适当地折叠或组装。在一个实施方案中，制剂中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物聚集。在一个实施方案中，制剂中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物是产物的片段。
在一个方面，本公开的特征在于包含本文所述细胞的混合物，例如细胞和由细胞生产的产物。在一个实施方案中，混合物包含比不具有公开的工艺参数时所见的更高浓度的产物，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30％更高的浓度(重量或数量)。在一个实施方案中，混合物中至少70、80、90、95、98或99％(重量或数量)的产物适当地折叠或组装。在一个实施方案中，混合物中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物聚集。在一个实施方案中，混合物中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物是产物的片段。
在一个方面，本公开的特征在于经受本文所述的降温修饰的细胞物的条件培养基的制剂。在一个实施方案中，产物以比不具有修饰时所见的更高浓度存在于制剂中，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30％100％更高的浓度(重量或数量)。在一个实施方案中，制剂中至少70、80、90、95、98或99％(重量或数量)的产物适当地折叠或组装。在一个实施方案中，制剂中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物聚集。在一个实施方案中，制剂中少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(重量或数量)的产物是产物的片段。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但下文描述了适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请，专利和其他参考文献都通过引用整体并入。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不旨在限制性。标题、副标题或编号或字母元素，例如(a)、(b)、(i)等，仅为了便于阅读而呈现。在本文件中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素按字母顺序实施，或者步骤或元素必须彼此分立。根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
附图简要说明
图1显示了温度、氧溶解度和氧利用率(OUR)的相互关系。
图2是用于最小化生物反应器(初级回收外壳和贮藏装置)中的多肽解离的缓解方案的示意图。
图3显示了在没有缓和和具有包括冷却细胞的缓和的情况下具有和不具有收获充氧的两种生物反应器的收获概况。
图4是用于IgG1单克隆抗体的没有缓和(左图)和具有缓和(右图)制备的非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶样品的图示。
图5显示了对于基线上游工艺和用于采用推注添加痕量营养物或连续添加痕量营养物的优化上游工艺，生产培养物氧化还原电位随培养持续时间的图。
图6显示了用于细胞需氧量的空气和氧气的喷射流量(sLPM)以及生产培养温度随经过时间的图，标记了阶段和转变点。
图7A和7B显示当在收获期间在生产培养物中固定喷射的空气和氧气时(图7A)和当在收获期间在生产培养物中固定喷射的空气和氧气以将培养物的DOT限制至～200％空气饱和度最大值时(图7B)培养物的示例性控制概况。
图8A和8B显示了示例性生物反应器和收获容器的图示，其具有标记的培养物流、部件和功能(图8A)以及图8A的收获容器的圈出来的顶部空间区域的放大标记示意图(图8B)。
图9显示了示例性收获容器的图示。
详述
本公开的特征在于用于通过冷却细胞培养物来获得更高产量的产物的方法和组合物。因此，与获得自当前生产方法的产量和质量相比，细胞显示出改善的质量。与目前用于生产重组产物的细胞表达***相比，本文所述的方法和组合物还可用于具有改善的生产力、产物质量、稳健性和/或培养生存力的工程化的细胞或细胞系。
方法适用于生产下一代生物制剂。随着这些方法继续在患者中获得治疗效用，对于具有高质量的治疗用途的大量下一代生物制品的需求，以及用于生产和生产细胞系的有效开发的有效手段将会加剧。此外，许多下一代生物制剂难以使用本领域已知的常规表达技术在常规细胞系中表达和生产。目前的方法不足以生产大量和临床使用所需的高质量的这些产物。本文所述的冷却方法克服了这些障碍。
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践和/或测试，但本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将根据如何定义来使用以下术语，其中提供了定义。
还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制性。
本文使用的冠词“一个”和“一种”是指该冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“细胞”可以指一个细胞或超过一个细胞。
如本文所用，“解离”是指经由多肽内和多肽之间的半胱氨酸残基之间的还原的二硫键的切割或解离。
如本文所用，“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或***内或在其内部天然产生的任何材料。
如本文所用，“外源的”是指引入生物体、细胞、组织或***或在其外部产生的任何材料。因此，“外源核酸”是指引入生物体、细胞、组织或***或在其外部产生的核酸。在实施方案中，外源核酸的序列不是在引入外源核酸的生物体、细胞、组织或***内天然产生或不可以在其中天然发现的。在实施方案中，非天然存在的产物或含有非天然存在的部分的产物是相对于本文所述的宿主细胞的外源材料。
如本文所用，“异源的”是指当引入到来自不同物种的生物体、细胞、组织或***时来自一个物种的任何材料。在实施方案中，异源材料还涵盖包括来自一个或多个物种或非天然存在的部分的部分的材料。举例来说，在实施方案中，编码融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白的一部分是人的，融合蛋白的一部分是细菌的，并且融合蛋白的一部分是非天然发生的，并且将所述核酸引入人细胞中，所述核酸是异源的核酸。
如在本文中可互换地使用的，“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指通过肽键或肽键以外的其他方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。在一个实施方案中，蛋白质可以由超过一个(例如，2、3、4、5个或更多个)多肽组成，其中每个多肽彼此之间通过共价或非共价键/相互作用结合。多肽包括包含彼此之间通过肽键或肽键以外的其他方式连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，术语是指具有多种类型的短链(例如，其在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物)和更长的链(其在本领域中通常称为蛋白质)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。
“重组产物”是指可以通过细胞或无细胞***生产的产物。产物可以是分子、核酸、多肽或其任何杂合体。重组产物是其产物的至少一种组分或控制产物的生产或表达的序列的至少一种核苷酸是通过基因工程化改造形成的产物。本文用于生成重组产物或编码重组产物的构建体的基因工程化改造涵盖本领域已知的重组DNA表达技术(例如，如CurrentProtocols in Molecular Biology中所述)；定点、扫描或随机诱变；CRISPR策略；以及锌指核酸酶(ZFN)策略。在一个实施方案中，重组产物是重组多肽。在一个实施方案中，重组产物是天然存在的产物。在一个实施方案中，重组产物是非天然存在的产物，例如合成产物。在一个实施方案中，一部分重组产物是天然存在的，而另一部分重组产物是非天然存在的。在另一个实施方案中，第一部分重组产物是一种天然存在的分子，而另一部分重组产物是另一种天然存在的分子，其不同于第一部分。在一些实施方案中，重组产物(例如重组多肽)是稳定化的产物。稳定化的产物是由细胞(例如重组宿主细胞)在增加适当的折叠和键排列(例如正确配对的二硫键)的可能性，并降低多亚基多肽解离的可能性的条件下生产的产物。在一些实施方案中，稳定化的产物是稳定化的蛋白质。例如，可以在以下温度和充氧水平下生产的稳定化的蛋白质：其产生相对于用于生产非稳定化的蛋白质的温度和充氧水平的氧化环境，增加保留正确二硫键的可能性并降低多亚基多肽可以彼此解离的可能性。稳定化的产物(例如稳定化的蛋白质)也可以在促进适当的折叠和键排列的条件下从细胞或细胞培养物中分离(例如通过一系列分离/色谱步骤纯化)。稳定化的产物(例如稳定化的蛋白质)的制剂是在增加适当的折叠和键排列并降低多亚基多肽解离的可能性的条件下从细胞(例如重组宿主细胞)制备的制剂。例如，稳定化的产物(例如稳定化的蛋白质)的制剂更可能包含具有正确二硫键的产物(例如蛋白质)，并且不太可能包含解离的产物(例如蛋白质)，例如多亚基多肽的解离的亚基。参见，例如Wai Keen Chung等人2017、Michael WHandlogten等人2017和Brian Mullan等人2011对产物(例如抗体)的解离的主题进行更深入的讨论。
“重组多肽”是指可以由本文所述的细胞生产的多肽。重组多肽是其编码多肽的序列的至少一个核苷酸或控制多肽表达的序列的至少一个核苷酸是由(细胞或前体细胞的)基因工程化改造或操作形成的多肽。例如，改变至少一个核苷酸，例如将其引入细胞或其是基因工程化改造重排的产物。在实施方案中，重组多肽的序列与天然或非天然存在的多肽或蛋白质的同种型没有区别。在实施方案中，重组多肽的氨基酸序列与天然或非天然存在的多肽或蛋白质的同种型的序列不同。在实施方案中，重组多肽和细胞来自相同的物种。在实施方案中，重组多肽的氨基酸序列与由细胞的内源基因组编码的多肽相同或基本上相同或差别不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在实施方案中，重组多肽和细胞来自相同的物种，例如重组多肽是人多肽并且细胞是人细胞。在实施方案中，重组多肽和细胞来自不同的物种，例如重组多肽是人多肽而细胞是非人的，例如啮齿动物，例如CHO、其他哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物、真菌或细菌细胞。在实施方案中，重组多肽对细胞而言是外源的，换言之，细胞来自第一物种，而重组多肽来自第二物种。在一个实施方案中，多肽是合成的多肽。在一个实施方案中，多肽衍生自非天然存在的来源。在实施方案中，重组多肽是人多肽或蛋白质，其氨基酸序列与天然或非天然存在的人多肽或蛋白质的同种型没有区别。在实施方案中，重组多肽与天然或非天然存在的人多肽或蛋白质的同种型的不同不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基。在实施方案中，重组多肽与天然存在的人多肽的同种型的不同不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的其氨基酸残基。在实施方案中，其中一部分重组多肽包含衍生自一部分天然或非天然存在的人多肽的同种型，一部分重组多肽与相应部分的天然或非天然存在的同种型的不同不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基，或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的其氨基酸残基。
充氧水平和充氧的水平可互换使用，并且如本文所用，是指一定体积的液体或气体中的溶解氧水平，例如在培养物中。充氧水平可以以溶解氧张力(DOT)的单位描述，例如，以空气饱和度的百分比(例如，空气中氧气水平的百分比)表示。
如本文所用，生产培养物是指生长培养基和细胞(例如，至少一种细胞)的混合物，所述细胞例如重组细胞，例如表达产物(例如蛋白质)、细胞因子(例如酶和代谢物)的重组宿主细胞。在一些实施方案中，生产培养物通过包含细胞生长/***特征的一个或多个培养阶段(例如，顺序和/或重叠培养阶段)进行。在一些实施方案中，当生产培养物通过不同阶段进行时，生产培养物的处理如本文所述改变。如本文所用，生产阶段是指从接种开始并在达到特定标准(例如，过程或时间段结束，例如10-30天，例如15-20天)或达到特定细胞生存力标准(例如少于90、80、70、60、50、40、30、20或10％生存力，例如少于50％生存力)时结束的生产培养物的阶段。生产阶段可以包括指数生长阶段，其中细胞生长和/或***是指数的。生产阶段可以包括在指数生长阶段之后的生长后阶段，其中细胞生长和/或***处于生长曲线的线性阶段，例如，相对于指数生长阶段，细胞生长和/或***的速率降低。在一些实施方案中，从生产上清液中分离细胞(例如收获)，以及进一步的分离或纯化步骤(例如收获后)，是在生产阶段结束后的阶段。
如本文所用，氧化还原电位差描述了两种或更多种化合物的氧化还原电位的比较，所述化合物例如产物，例如稳定化的或非稳定化的产物，例如稳定化的或非稳定化的蛋白质。例如，稳定化的产物可以具有氧化还原电位A，而非稳定化的产物可以具有氧化还原电位B；然后，有从稳定化的产物到非稳定化的产物的A-B(A减去B)的氧化还原电位差，或从非稳定化的产物到稳定化的产物的B-A(B-A)的氧化还原电位差。例如绝对负氧化还原电位越高，环境的还原性越大，并且本发明的目的是通过本文公开的方法产生更氧化的环境，从而将绝对负氧化还原电位降低至正氧化还原电位。
可操作地连接，如本文所用，描述了容器之间的关系。在实施方案中，培养基或生产培养物可以在可操作地连接的容器之间传递。在实施方案中，可操作地连接的容器之间的培养物流以受控的方式发生，例如利用泵、过滤器、传感器、用于维持或改变培养条件的装置，和/或用于监测液体流动的装置。
在一些实施方案中，本公开的方法包括或者本公开的生物反应器能够在不同阶段的不同温度下维持生产培养物、生产培养物的细胞或来自生产培养物的上清液。如本文所用，T培养是从接种开始到生产阶段结束，例如在生长培养基中生长培养物的细胞生长的温度，以生产其中生产蛋白质的生产培养物。在一些实施方案中，T培养是30℃-38℃。如本文所用，T生产是在指数后生长阶段后将生产培养物冷却到的第一温度。在一些实施方案中，T生产小于35℃、34℃、33℃、32℃、31℃或30℃，例如30℃-33℃。如本文所用，T收获是在收获(例如，从上清液中分离细胞)之前将生产培养物冷却到的第二温度。在一些实施方案中，T收获是29℃、28℃、27℃、26℃、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃或4℃。在一个实施方案中，T收获是12℃-18℃，例如15℃。在一个实施方案中，T收获小于6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃。在一个实施方案中，T收获是15℃±3℃。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域技术人员可以设计出本发明的其他方面和变化。所附权利要求旨在被解释为包括所有此类方面和等同变化。
产物
本文提供了用于工程化或制备细胞或无细胞表达***的方法和组合物，其能够通过降低表达细胞的温度来生产高产量的产物和/或改善的产物质量(例如稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质)。本文描述的产物包括多肽，例如重组蛋白；多聚体蛋白质或复合物；脂质包裹的颗粒，例如病毒样颗粒、囊泡或外排体；或其他分子。在实施方案中，产物是多肽，例如重组多肽。在实施方案中，产物是外排体。例如，重组多肽可以是难以表达的蛋白质或具有复合和/或非天然结构的蛋白质，例如下一代生物制剂，例如双特异性抗体分子、融合蛋白或糖基化蛋白质。
在实施方案中，由本文所述的方法或组合物生成的细胞或细胞系生产可用于治疗医学病症、紊乱或疾病的产物(例如重组多肽，例如稳定化的蛋白质)。医学病症、紊乱或疾病的实例包括但不限于代谢疾病或紊乱(例如，代谢酶缺乏)、内分泌紊乱(例如，激素缺乏)、止血失调、血栓形成、造血障碍、肺病、胃肠道疾病、自身免疫性疾病、免疫失调(例如免疫缺陷)、不育、移植、癌症和传染病。
在实施方案中，产物是外源蛋白质，例如不是细胞天然表达的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质来自一个物种，而细胞来自不同物种。在另一个实施方案中，蛋白质是非天然存在的蛋白质。
在其他实施方案中，产物是由细胞内源地表达的蛋白质。在一个实施方案中，产物是细胞在内源或天然水平内源地表达的蛋白质。本文所述的本发明方法和组合物用于增加内源产物(例如由细胞天然产生的天然存在的产物)的产量和质量。在另一个实施方案中，将编码产物(例如蛋白质)的外源核酸引入细胞并由细胞表达。在另一个实施方案中，将增加由细胞内源地表达的产物的表达的外源核酸引入细胞中。举例来说，外源核酸包含激活控制细胞的内源产物的表达的启动子的序列。
重组产物可以是治疗性产物或诊断性产物，例如可用于药物筛选。治疗性或诊断性产物可以包括但不限于抗体分子(例如抗体或抗体片段)、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、报道蛋白、治疗性肽，或结构性和/或功能性片段或任何这些的杂合体。在其他实施方案中，治疗性或诊断性产物是合成多肽，例如，其中整个多肽或其部分不衍生自任何天然存在的多肽(例如，上述天然存在的多肽)或与任何天然存在的多肽(例如，上述天然存在的多肽)具有任何序列或结构相似性。
在一个实施方案中，重组产物是抗体分子。在一个实施方案中，重组产物是治疗性抗体分子。在另一个实施方案中，重组产物是诊断性抗体分子，例如可用于成像技术或诊断测试的单克隆抗体。
如本文所用，抗体分子是衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。在实施方案中，抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白质可以是多克隆的或单克隆的，多链或单链，或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在实施方案中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人或人源化抗体。在一个实施方案中，抗体是IgA、IgG、IgD或IgE抗体。在一个实施方案中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分或者其重组变体，并且是指抗原结合结构域(例如，完整抗体的抗原决定可变区)，其足以赋予抗体片段与靶点(如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体(如包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段)以及抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。还可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger and Hudson,Nature Biotechnology23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植入基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。
在实施方案中，多肽是例如，BOTOX、Myobloc、Neurobloc、Dysport(或其他血清型的肉毒杆菌神经毒素)、重组阿葡糖苷酶(alglucosidase)alpha、达托霉素(daptomycin)、YH-16、绒毛膜***(choriogonadotropin)alpha、非格司亭(filgrastim)、西曲瑞克(cetrorelix)、白细胞介素-2、阿地白介素、替西白介素(teceleulin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素alpha-n3(注射)、干扰素alpha-nl、DL-8234、干扰素、Suntory(gamma-1a)、干扰素gamma、胸腺素alpha 1、他索纳明(tasonermin)、DigiFab、ViperaTAb、EchiTAb、CroFab、奈西立肽(nesiritide)、阿他西普(abatacept)、阿来西普(alefacept)、Rebif、eptoterminalfa、特立帕肽(teriparatide)、降钙素、依那西普(etanercept)、血红蛋白glutamer 250(牛)、卓曲可近(drotrecogin)alpha、胶原酶、卡培立肽(carperitide)、重组人表皮生长因子、DWP401、达依泊汀(darbepoetin)alpha、依泊汀(epoetin)omega、依泊汀beta、依泊汀alpha、地西卢定(desirudin)、来匹卢定(lepirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、凝血素9(nonacog)alpha、Mononine、凝血素7(eptacog)alpha(活化的)、重组因子VIII+VWF、重组(Recombinate)、重组因子VIII、因子VIII(重组)、Alphnmate、凝血素8(octocog)alpha、因子VIII、帕利弗明(palifermin)、Indikinase、替奈普酶(tenecteplase)、阿替普酶(alteplase)、帕米普酶(pamiteplase)、瑞替普酶(reteplase)、那替普酶(nateplase)、孟替普酶(monteplase)、促卵泡素(follitropin)alpha、rFSH、hpFSH、米卡芬净(micafungin)、聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim)、来格司亭(lenograstim)、那托司亭(nartograstim)、舍莫瑞林(sermorelin)、胰高血糖素、艾塞那肽(exenatide)、普兰林肽(pramlintide)、伊米苷酶(iniglucerase)、加硫酶(galsulfase)、Leucotropin、molgramostirn、乙酸曲普瑞林(triptorelin acetate)、组胺瑞林(histrelin)(Hydron)、地洛瑞林(deslorelin)、组胺瑞林、那法瑞林(nafarelin)、亮丙瑞林(leuprolide)(ATRIGEL)、亮丙瑞林(DUROS)、戈舍瑞林(goserelin)、Eutropin、生长激素、美卡舍明(mecasermin)、enlfavirtide、Org-33408、甘精胰岛素、赖谷胰岛素、胰岛素(吸入型)、赖脯胰岛素、地特胰岛素、胰岛素(RapidMist)、林非贝特-美卡舍明(mecasermin rinfabate)、阿那白滞素(anakinra)、西莫白介素(celmoleukin)、99mTc-apcitide、myelopid、Betaseron、醋酸格拉替美(glatirameracetate)、Gepon、沙格司亭(sargramostim)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、人白细胞衍生alpha干扰素、Bilive、胰岛素(重组)、重组人胰岛素、门冬胰岛素、mecasenin、Roferon-A、干扰素-alpha 2、Alfaferone、干扰素alfacon-1、干扰素alpha、Avonex’重组人***、链道酶alpha、曲弗明(trafermin)、齐考诺肽(ziconotide)、他替瑞林(taltirelin)、迪奥特明(dibotermin)alfa、阿托西班(atosiban)、贝卡普勒明(becaplermin)、依替巴肽(eptifibatide)、Zemaira、CTC-111、Shanvac-B、奥曲肽(octreotide)、兰瑞肽(lanreotide)、ancestirn、半乳糖苷酶beta、半乳糖苷酶alpha、拉罗尼酶(laronidase)、醋肽铜(prezatide copper acetate)、拉布立酶(rasburicase)、兰尼单抗(ranibizumab)、Actimmune、PEG-Intron、Tricomin、重组人类甲状旁腺激素(PTH)1-84、依泊汀delta、转基因抗凝血酶III、Granditropin、Vitrase、重组胰岛素、干扰素-alpha、GEM-21S、伐普肽(vapreotide)、艾杜硫酸酯酶(idursulfase)、omnapatrilat、重组血清白蛋白、培戈-瑟托利珠单抗(certolizumab pegol)、谷卡匹酶(glucarpidase)、人重组C1酯酶抑制剂、拉诺普酶(lanoteplase)、重组人生长因子、恩夫韦肽(enfuvirtide)、VGV-1、干扰素(alpha)、芦西纳坦(lucinactant)、阿肽地尔(aviptadil)、艾替班特(icatibant)、依考兰肽(ecallantide)、奥米加南(omiganan)、Aurograb、醋酸培西加南(pexigananacetate)、ADI-PEG-20、LDI-200、地加瑞克(degarelix)、贝舒托-辛白介素-13(cintredelinbesudotox)、Favld、MDX-1379、ISAtx-247、利拉鲁肽(liraglutide)、特立帕肽(teriparatide)、替法可近(tifacogin)、AA4500、T4N5脂质体洗液、卡妥玛索单抗(catumaxomab)、DWP413、ART-123、Chrysalin、去氨普酶(desmoteplase)、安地普酶(amediplase)、绒促卵泡素alpha、TH-9507、替度鲁钛(teduglutide)、Diamyd、DWP-412、生长激素、重组G-CSF、胰岛素、胰岛素(Technosphere)、胰岛素(AERx)、RGN-303、DiaPep277、干扰素beta、干扰素alpha-n3、贝他西普(belatacept)、透皮胰岛素贴片、AMG-531、MBP-8298、Xerecept、奥培巴坎(opebacan)、AIDSVAX、GV-1001、LymphoScan、豹蛙酶(ranpirnase)、Lipoxysan、卢普尔肽(lusupultide)、MP52、sipuleucel-T、CTP-37、Insegia、vitespen、人凝血酶、凝血酶、TransMID、阿非普酶(alfimeprase)、Puricase、特利加压素、EUR-1008M、重组FGF-I、BDM-E、洛替加肽(rotigaptide)、ETC-216、P-113、MBI-594AN、耐久霉素(duramycin)、SCV-07、OPI-45、内皮抑素(Endostatin)、血管抑素(Angiostatin)、ABT-510、Bowman Birk抑制剂、XMP-629、99mTc-Hynic-Annexin V、kahalalide F、CTCE-9908、替维瑞克(teverelix)、奥扎瑞克(ozarelix)、洛米迪星(rornidepsin)、BAY-504798、白细胞介素4、PRX-321、Pepscan、艾柏人白介素-18(iboctadekin)、rh乳铁蛋白(rhlactoferrin)、TRU-015、IL-21、ATN-161、西仑吉肽(cilengitide)、Albuferon、Biphasix、IRX-2、omega干扰素、PCK-3145、CAP-232、帕西瑞肽(pasireotide)、huN901-DMI、SB-249553、Oncovax-CL、OncoVax-P、BLP-25、CerVax-16、MART-1、gp100、酪氨酸酶、奈米菲肽(nemifitide)、rAAT、CGRP、培苏奈西普(pegsunercept)、胸腺素beta4、plitidepsin、GTP-200、雷莫拉宁(ramoplanin)、GRASPA、OBI-1、AC-100、鲑鱼降钙素(salmon calcitonin)(eligen)、艾沙瑞林(examorelin)、卡莫瑞林(capromorelin)、Cardeva、维拉弗明(velafermin)、131I-TM-601、KK-220、T-10、乌拉立肽(ularitide)、地来司他(depelestat)、hematide、Chrysalin、rNAPc2、重组因子VIII(聚乙二醇化脂质体)、bFGF、聚乙二醇化重组葡激酶变体、V-10153、SonoLysis Prolyse、NeuroVax、CZEN-002、rGLP-1、BIM-51077、LY-548806、埃塞纳肽(exenatide)(控释型，Medisorb)、AVE-0010、GA-GCB、阿沃瑞林(avorelin)、ACM-9604、醋酸利那洛肽(linaclotideacetate)、CETi-1、Hemospan、VAL、速效胰岛素(可注射的，Viadel)、胰岛素(eligen)、重组人甲硫氨酰瘦蛋白、匹曲白滞素(pitrakinra)、Multikine、RG-1068、MM-093、NBI-6024、AT-001、PI-0824、Org-39141、Cpn10、talactoferrin、rEV-131、rEV-131、重组人胰岛素、RPI-78M、奥普瑞白介素(oprelvekin)、CYT-99007CTLA4-Ig、DTY-001、伐泰司特(valategrast)、干扰素alpha-n3、IRX-3、RDP-58、Tauferon、胆盐刺激脂肪酶、Merispase、碱性磷酸酶、EP-2104R、Melanotan-II、布美兰肽(bremelanotide)、ATL-104、重组人微纤溶酶、AX-200、SEMAX、ACV-1、Xen-2174、CJC-1008、强啡肽A、SI-6603、LAB GHRH、AER-002、BGC-728、ALTU-135、重组神经氨酸酶、Vacc-5q、Vacc-4x、Tat Toxoid、YSPSL、CHS-13340、PTH(1-34)(Novasome)、Ostabolin-C、PTH类似物、MBRI-93.02、MTB72F、MVA-Ag85A、FARA04、BA-210、重组瘟疫FIV、AG-702、OxSODrol、rBetV1、Der-p1/Der-p2/Der-p7、PR1肽抗原、突变ras疫苗、HPV-16E7脂肽疫苗、labyrinthin、WT1-肽、IDD-5、CDX-110、Pentrys、Norelin、CytoFab、P-9808、VT-111、艾罗卡肽(icrocaptide)、特柏明(telbermin)、卢平曲韦(rupintrivir)、reticulose、rGRF、HA、alpha-半乳糖苷酶A、ACE-011、ALTU-140、CGX-1160、血管紧张素、D-4F、ETC-642、APP-018、rhMBL、SCV-07、DRF-7295、ABT-828、ErbB2-特异性免疫毒素、DT3SSIL-3、TST-10088、PRO-1762、Combotox、缩胆囊肽-B/胃泌素-受体结合肽、111In-hEGF、AE-37、曲妥珠单抗(trasnizumab)-DM1、拮抗剂G、IL-12、PM-02734、IMP-321、rhIGF-BP3、BLX-883、CUV-1647、基于L-19的ra、Re-188-P-2045、AMG-386、DC/1540/KLH、VX-001、AVE-9633、AC-9301、NY-ESO-1(多肽)、NA17.A2多肽、CBP-501、重组人乳铁蛋白、FX-06、AP-214、WAP-8294A、ACP-HIP、SUN-11031、肽YY[3-36]、FGLL、阿塞西普(atacicept)、BR3-Fc、BN-003、BA-058、人甲状旁腺激素1-34、F-18-CCR1、AT-1100、JPD-003、PTH(7-34)(Novasome)、耐久霉素(duramycin)、CAB-2、CTCE-0214、糖聚乙二醇化***、EPO-Fc、CNTO-528、AMG-114、JR-013、因子XIII、氨基康定(aminocandin)、PN-951、716155、SUN-E7001、TH-0318、BAY-73-7977、替维瑞克(teverelix)、EP-51216、hGH、OGP-I、西夫韦肽(sifuvirtide)、TV4710、ALG-889、Org-41259、rhCC10、F-991、胸腺五肽、r(m)CRP、肝选择性胰岛素、subalin、L19-IL-2融合蛋白、elafin、NMK-150、ALTU-139、EN-122004、rhTPO、血小板生成素受体激动剂、AL-108、AL-208、神经生长因子拮抗剂、SLV-317、CGX-1007、INNO-105、特立帕肽(teriparatide)(eligen)、GEM-OS1、AC-162352、PRX-302、LFn-p24融合物、EP-1043、gpE1、gpE2、MF-59、hPTH(1-34)、768974、SYN-101、PGN-0052、aviscumnine、BIM-23190、多表位酪氨酸酶肽、enkastim、APC-8024、GI-5005、ACC-001、TTS-CD3、血管靶向TNF、去氨加压素、昂奈西普(onercept)以及TP-9201。
在一些实施方案中，多肽是阿达木单抗(adalimumab)(HUMIRA)、英夫利昔(infliximab)(REMICADETM)、瑞妥昔单抗(rituximab)(RITUXANTM/MAB THERATM)、依那西普(ENBRELTM)、贝伐赛珠单抗(bevacizumab)(AVASTINTM)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(HERCEPTINTM)、培非司亭(pegrilgrastim)(NEULASTATM)，或任何其他适合的多肽，包括生物仿制药和生物仿生药。
其他适合的多肽是下面和US2016/0097074的表1中列出的那些：
表1
在实施方案中，多肽是激素、血液凝结/凝血因子、细胞因子/生长因子、抗体分子、融合蛋白、蛋白质疫苗或肽，如表2中所示。
可以使用本文所述方法生产的示例性重组产物包括但不限于下表中提供的那些。
表2：示例性产物
在实施方案中，蛋白质是多特异性蛋白质，例如双特异性抗体，如表3中所示。
表3：双特异性形式
在实施方案中，产物是表4中列出的多肽。
表4
表4
表4
表4
表4
表4
表4
在一些实施方案中，多肽是由癌细胞表达的抗原。在一些实施方案中，重组或治疗性多肽是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。在一些实施方案中，重组或治疗性多肽选自以下各项：HER2、CD20、9-O-乙酰-GD3、βhCG、A33抗原、CA19-9标志物、CA-125标志物、钙网蛋白、碳酸酐酶IX(MN/CA IX)、CCR5、CCR8、CD19、CD22、CD25、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD63、CD70、CC123、CD138、癌胚抗原(CEA；CD66e)、桥粒芯蛋白4、E-钙粘蛋白新表位、内皮唾液酸蛋白(endosialin)、肝配蛋白(ephrin)A2(EphA2)、表皮生长因子受体(EGFR)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2、胎儿乙酰胆碱受体、成纤维细胞活化抗原(FAP)、岩藻糖基GM1、GD2、GD3、GM2、神经节苷脂GD3、Globo H、糖蛋白100、HER2/neu、HER3、HER4、***受体1、Lewis-Y、LG、Ly-6、黑色素瘤特异性硫酸软骨素蛋白多糖(MCSCP)、间皮素、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、Mullerian抑制物质(MIS)受体II型、浆细胞抗原、poly SA、PSCA、PSMA、sonic hedgehog(SHH)、SAS、STEAP、sTn抗原、TNF-alpha前体，及其组合。
在一些实施方案中，多肽是激活的受体并且选自以下各项：2B4(CD244)、α4β1整合素、β2整合素、CD2、CD16、CD27、CD38、CD96、CDlOO、CD160、CD137、CEACAMl(CD66)、CRTAM、CSl(CD319)、DNAM-1(CD226)、GITR(TNFRSF18)、激活形式的KIR、NKG2C、NKG2D、NKG2E、一种或多种天然细胞毒性受体、NTB-A、PEN-5，及其组合，任选地其中β2整合素包含CD11a-CD 18、CD11b-CD 18或CD11c-CD 18，任选地其中激活形式的KIR包含KlR2DSl、KIR2DS4或KIR-S，并且任选地其中天然细胞毒性受体包含NKp30、NKp44、NKp46或NKp80。
在一些实施方案中，多肽是抑制性受体并且选自以下各项：KIR、ILT2/LIR-l/CD85j、抑制形式的KIR、KLRG1、LAIR-1、NKG2A、NKR-P1A、Siglec-3、Siglec-7、Siglec-9，及其组合，任选地其中抑制形式的KIR包含KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2或KIR-L。
在一些实施方案中，多肽是激活的受体并且选自以下各项：CD3、CD2(LFA2、OX34)、CD5、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD40L、CD84(SLAMF5)、CD137(4-1BB)、CD226、CD229(Ly9、SLAMF3)、CD244(2B4、SLAMF4)、CD319(CRACC、BLAME)、CD352(Lyl08、NTBA、SLAMF6)、CRTAM(CD355)、DR3(TNFRSF25)、GITR(CD357)、HVEM(CD270)、ICOS、LIGHT、LTβR(TNFRSF3)、OX40(CD134)、NKG2D、SLAM(CD150、SLAMF1)、TCRα、TCRβ、TCRδγ、TIM1(HAVCR、KIM1)，及其组合。
在一些实施方案中，多肽是抑制性受体并且选自以下各项：PD-1(CD279)、2B4(CD244、SLAMF4)、B71(CD80)、B7Hl(CD274、PD-L1)、BTLA(CD272)、CD160(BY55、NK28)、CD352(Ly108、NTBA、SLAMF6)、CD358(DR6)、CTLA-4(CD152)、LAG3、LAIR1、PD-1H(VISTA)、TIGIT(VSIG9、VSTM3)、TIM2(TIMD2)、TIM3(HAVCR2、KIM3)，及其组合。
其他示例性蛋白包括但不限于Leader等人，“Protein therapeutics:a summaryand pharmacological classification”,Nature Reviews Drug Discovery,2008,7:21-39(通过引用并入本文)的表1-10中描述的任何蛋白质；或本文所述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物，或功能性片段。
其他重组蛋白质产物包括非抗体支架或替代蛋白质支架，例如但不限于：DARPin、亲和体和adnectin。可以工程化改造此类非抗体支架或替代蛋白质支架以识别或结合一种或两种或更多种，例如1、2、3、4或5种或更多种不同的靶点或抗原。
在一个实施方案中，包含编码本文所述的产物(例如多肽，例如重组多肽)的核酸序列的载体进一步包含编码选择标志物的核酸序列。在一个实施方案中，可选择的标志物包含谷氨酰胺合成酶(GS)；二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如赋予甲氨蝶呤(MTX)抗性的酶；脯氨酸或抗生素标志物，例如赋予抗生素抗性的酶，所述抗生素例如：潮霉素、新霉素(G418)、吉欧霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素。在另一个实施方案中，选择标志物包含Selexis选择***(例如，SUREtechnology PlatformTM和Selexis Genetic ElementsTM，可商购自SelexisSA)或Catalant选择***，或与之兼容。
在一个实施方案中，包含编码本文所述的重组产物的核酸序列的载体包含可用于鉴定一种或多种细胞的选择标志物，所述细胞包含编码本文所述的重组产物的核酸。在另一个实施方案中，选择标志物可用于鉴定包含将编码重组产物的核酸序列整合到基因组中的一种或多种细胞，如本文所述。已整合编码重组蛋白的核酸序列的一种或多种细胞的鉴定可以用于选择和工程化稳定表达产物的细胞或细胞系。
在一个实施方案中，产物与表1-4中的多肽的不同不超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。在另一个实施方案中，产物与表2或3中的多肽的不同不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或15％的其氨基酸残基。以上讨论了用于确定百分比同一性的方法。
其他重组产物包括非抗体支架或替代蛋白质支架，例如但不限于：DARPin、亲和体和adnectin。
其他示例性治疗性或诊断性蛋白质包括但不限于描述于Leader et al.,“Protein therapeutics:a summary and pharmacological classification”,NatureReviews Drug Discovery,2008,7:21-39的表1-10中和如Walsh,“Biopharmaceuticalbenchmarks 2014”,Nature Biotechnology,2014,32:992-1000中所描述的任何蛋白质(各自通过引用并入本文)；或本文所述的重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能片段。
还原和氧化
还原和氧化反应(氧化还原反应)，其中电子从化合物中提供或去除，在生物***中是常见的。在一组条件下在氧化还原反应中放弃电子或获得电子的趋势可以通过化合物的氧化还原电位来描述。氧化还原电位(ΔE)以伏特(V)或毫伏(mV)测量。可以计算单个化合物(例如蛋白质)的氧化还原电位，在这种情况下，氧化还原电位描述化合物对电子的亲和力；氧化还原电位越正，获得电子的趋势越大，氧化还原电位越负，放弃电子的趋势越大。除了化合物，溶液、细胞器和细胞也可以具有其获得或失去电子的趋势，表示为氧化还原电位。
细胞使用几种***来调节其氧化还原电位。人中的硫氧还蛋白***包含两种蛋白质，Trx1和Trx2。Trx蛋白具有低氧化还原电位并还原蛋白质二硫键；该还原反应由硫氧还蛋白还原剂(TrxR)使用来自NADPH的电子催化。
Trx-S2+NADPH+H+→Trx-(SH)2+NADP+
蛋白质-S2+Trx-(SH)2→蛋白质-(SH)2+Trx-S2谷氧还蛋白***由谷氧还蛋白、谷胱甘肽和NADPH依赖性谷胱甘肽还原酶组成。谷氧还蛋白***使用谷胱甘肽还原蛋白质二硫键，其随着NADPH的消耗而恢复到还原状态。谷氧还蛋白还原蛋白质硫醇基团，通过二硫醇机制，
R-S2+Grx-(SH)2→R-(SH)2+Grx-S2
Grx-S2+2GSH→Grx-(SH)2+GSSG
或单硫醇机制，
R-S-SG+Grx(SH)2→R-SH+Grx-S-SG
Grx-S-SG+GSH→Grx-(SH)2+GSSG。
有关氧化还原反应、电位以及调节或控制氧化还原反应/电位的方法的更多信息，参见例如，Holmgren et al.Biochem Soc Trans.2005Dec；33(Pt6):1375-7；Nordberg andArner.Free Radic Biol Med.2001Dec1；31(11):1287-312；Ghezzi P.Biochem SocTrans.2005Dec；33(Pt 6):1378-81；Ivarsson et al.Diabetes.2005Jul；54(7):2132-42；Sen,CK.Biochem Pharmacol55(11),1747-1758.1998Jun 01；和May et al.J BiolChem.1997Sep5；272(36):22607-10；Molteni,S.N.,et al.(2004).″Glutathione limitsEro1-dependent oxidation in the endoplasmic reticulum.″Journal of BiologicalChemistry 279(31):32667-32673；Kojer,K.and J.Riemer(2014).″Balancing oxidativeprotein folding:The influences of reducing pathways on disulfide bondformation.″Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1844(8):1383-1390；Hanschmann,E.-M.,et al.(2013).″Thioredoxins,Glutaredoxins,andPeroxiredoxins—Molecular Mechanisms and Health Significance:from Cofactorsto Antioxidants to Redox Signaling.″Antioxidants&Redox Signaling 19(13):1539-1605；Chakravarthi,S.,et al.(2006).″The role of glutathione in disulphide bondformation and endoplasmic-reticulum-generated oxidative stress.″EMBO Reports7(3):271-275；Flohé,L.(2013).″The fairytale of the GSSG/GSH redox potential.″Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects 1830(5):3139-3142；and Bánhegyi,G.,et al.(2007).″Stress on redox.″FEBS Letters 581(19):3634-3640，其全部内容通过引用并入本文。
可以独立于细胞采用的氧化还原调节***调节氧化还原电位。例如，通过调节溶液中的氧含量，可以调节化合物(例如产物，例如蛋白质)的氧化还原电位。增加溶液中的氧含量(例如使溶液有利于氧化)，增加产物(例如蛋白质)的氧化还原电位。增加产物(例如蛋白质)的氧化还原电位可以降低产物(例如蛋白质)的二硫键相对于产物(例如蛋白质)在较低氧化还原电位下得以还原的可能性。
生产应用
本文公开的产物(例如产物变体)的制备方法可以用于生产多种产物、评估各种细胞系，或评估用于生物反应器或处理容器或罐中的各种细胞系的生产，或更通常地用于任何进料来源。本文所述的装置、设施和方法适用于培养任何所需的细胞系，包括原核和/或真核细胞系。此外，在实施方案中，所述装置、设施和方法适用于培养悬浮细胞或贴壁依赖性(贴壁)细胞，并且适用于配置用于生产药物和生物制药产物的生产操作，所述产物例如多肽产物或细胞和/或病毒，例如用于细胞和/或病毒疗法的那些。
如上所述，在实施方案中，装置、设施和方法允许真核细胞，例如哺乳动物细胞或低等真核细胞(例如酵母细胞或丝状真菌细胞)，或原核细胞(例如革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞)的生产和/或真核细胞或原核细胞的产物，例如蛋白质、肽、抗生素、氨基酸，由真核细胞以大规模方式合成。除非本文另有说明，否则所述装置、设施和方法可以包括任何所需的体积或生产能力，包括但不限于实验室规模、中试规模和全生产规模能力。
此外，除非本文另有说明，否则所述装置、设施和方法可以包括任何适合的反应器，包括但不限于搅拌罐、气升、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷射床生物反应器。如本文所用，“反应器”或“生物反应器”可以包括发酵罐或发酵单元，或任何其他反应容器，并且术语“反应器”和“生物反应器”可与“发酵罐”互换使用。例如，在一些方面，生物反应器单元可以进行以下各项中的一项或多项或全部：营养物和/或碳源的进料，适合的气体(例如氧气)的注入，发酵或细胞培养基的流的入口和出口，气相和液相的分离，温度的维持，氧气和CO2水平的维持，pH水平的维持，搅动(例如，搅拌)和/或清洁/消毒。示例性反应器单元(例如发酵单元)可以在单元内包含多个反应器，例如，单元可以在每个单元中具有1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个或更多个生物反应器和/或设施可以包含在设施内具有单个或多个反应器的多个单元。在各种实施方案中，生物反应器可以适用于分批、半补料分批、补料分批、灌注和/或连续发酵过程。可以使用任何适合的反应器直径。在实施方案中，生物反应器可以具有约100mL和约50,000L之间的体积。非限制性实例包括100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升的体积。另外，适合的反应器可以是多次使用的、单次使用的的、用即可弃的或非用即可弃的，并且可以由任何适合的材料形成，包括金属合金，例如不锈钢(例如316L或任何其他适合的不锈钢)和铬镍铁合金(Inconel)、塑料和/或玻璃。在一些实施方案中，适合的反应器可以是圆形的，例如圆柱形。在一些实施方案中，适合的反应器可以是方形的，例如矩形。在一些情况下，方形反应器可以提供优于圆形反应器的益处，例如易于使用(例如，由技术人员装载和设置)、反应器内容物的更大混合和均匀性，以及更低的地板占地面积。
在实施方案中并且除非本文另有说明，否则本文所述的用于制备制剂的方法的装置、设施和方法还可以包括任何适合的单元操作和/或未另外提及的设备，例如用于分离、纯化和分离此类产物的操作和/或设备。可以使用任何适合的设施和环境，例如传统的杆式设施，模块化、移动和临时设施，或任何其他适合的结构、设施和/或布局。例如，在一些实施方案中，可以使用模块化的洁净室。另外并且除非另有说明，否则本文所述的装置、***和方法可以在单个位置或设施中容纳和/或进行，或者替代地在单独的或多个位置和/或设施处容纳和/或进行。
作为非限制性实例而没有限制，美国公开号2013/0280797；2012/0077429；2011/0280797；2009/0305626；和美国专利号8,298,054；7,629,167；和5,656,491，其在此通过引用整体并入，描述了可以适合的示例性设施、设备和/或***。
生物反应器设置和条件
在一个方面，本公开的生物反应器或由本公开的方法利用的生物反应器是单次使用的生物反应器。
单次使用的生物反应器可以包括生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
在一个实施方案中，本公开涉及包含生物过程容器的生物反应器。生物过程容器由液体不可渗透且柔性形状贴合材料制成。例如，生物过程容器可以由柔性薄膜，例如多层薄膜制成。在一个实施方案中，例如，薄膜由聚乙烯聚合物，例如已改性以形成亲水表面的低密度聚乙烯组成。亲水表面用于与生物反应器内的细胞培养物接触并改善润湿性。在一个实施方案中，通过经受辐射、光(photo)或等离子体诱导或氧化来改性聚乙烯聚合物。
生物过程容器可以具有顶部、底部和在它们之间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于接收培养基的中空外壳。中空外壳可以具有任何适合的体积，例如100mL、250mL、500mL、750mL、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10,000升、15,000升、20,000升和/或50,000升。
生物反应器可以包括用于将材料进料到生物过程容器的中空外壳中的至少一个入口。包含连接到至少一个搅拌器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中。在一个实施方案中，可旋转轴可以是可折叠的。例如，可旋转轴可以包括至少一个由亲水性聚合物材料制成的叶轮，该叶轮是朝向可旋转轴可折叠的(collapsible)或可折叠的(foldable)。
生物反应器还可以包括配置为在纵向方向上邻近生物过程容器的侧壁延伸的至少一个挡板。挡板可以具有从侧壁径向向内延伸的形状，其量足以在通过混合装置混合培养基期间影响中空外壳中的流体流动。挡板可以是可折叠的(collapsible)和/或可折叠的(foldable)。在一个实施方案中，例如，挡板可以限定可膨胀的流体囊，使得挡板能够膨胀和收缩。挡板可以与生物过程容器成一体，其意味着挡板形成为柔性成形材料。或者，挡板可以与生物过程容器分开。挡板可以配置成放置在中空外壳内部，或者可以放置在中空外壳外部。当放置在中空外壳外部时，生物过程容器的侧壁符合围绕挡板的形状。例如，在一个实施例中，挡板可以可拆卸地连接到外金属壳体。生物过程容器可以放置在金属壳体中，以符合围绕挡板的形状。生物反应器，在一个实施方案中，可以包括约两个至约六个挡板，所述挡板围绕生物过程容器的中空外壳的圆周间隔开。
在一个实施方案中，生物过程容器具有直径，并且一个或多个挡板径向向内延伸的距离为生物过程容器直径的约3％至约20％，例如约5％至约15％。
生物反应器可以进一步包括至少一个喷射器。喷射器例如可以包含压载喷射器(ballast sparger)，所述压载喷射器包含具有纵向部分和横向部分的气体管。纵向部分可以垂直延伸到生物过程容器的中空外壳中。另一方面，横向部分可以位于搅拌器下方的纵向部分的一端。横向部分可以限定多个孔，用于将气体释放到包含在生物过程容器内的培养基中。在一个实施方案中，钻出多个孔。横向部分可以具有任何适合的形状。在一个实施方案中，横向部分可以配置为与混合装置的可旋转轴接合用于稳定轴。可旋转轴可以延伸穿过横向部分或者可以容纳在形成在横向部分中的轴接收构件内。
在一个实施方案中，生物反应器包括第一表面下(subsurface)喷射器和第二表面上(supersurface)喷射器。表面下喷射器中的多个孔可以比表面上喷射器上的多个孔更大或更小。在一个实施方案中，钻出多个孔。
在一个实施方案中，生物反应器可以包括至少一个进料管线，其延伸到中空外壳中，用于将流体进料到生物过程容器中。进料管线可以包括位于邻近搅拌器的表面下流体出口。流体出口可以与流体控制装置相关联，所述流体控制装置仅允许流体流出流体出口并防止流体沿相反方向流动。例如，流体控制装置可以包含单向阀门。
在另一个实施方案中，生物反应器可以包括位于生物过程容器顶部的进料管线。进料管线可以包括位于存在于生物过程容器中的一定体积的培养基上方的表面上流体排出。可以定位表面上流体排出，使得流过流体排出的流体与包含在生物过程容器内的培养基直接接触。在一个实施方案中，搅拌器在旋转时可以形成圆周，并且进料管线的表面上流体排出可以位于搅拌器的圆周上方，使得流过流体排出的流体与圆周内的培养基接触。
生物反应器可以放置成与称重传感器(load cell)可操作地关联，用于指示包含在中空外壳内的培养基的质量。生物过程容器的底部可以具有圆顶形状以便于排水。例如，生物过程容器可以包括位于生物过程容器底部的排水管线。流体收集装置可以位于生物过程容器的中空外壳和排水管线之间。流体收集装置可以具有配置为引起流体从生物过程容器进入排水管线的涡流的形状。在一个实施方案中，排水管线具有与中空外壳的体积成比例的横截面积。例如，出于示例性目的，排水管线可以具有每升体积的中空外壳约0.3mm2至约0.7mm2，例如约0.4mm2至约0.6mm2的横截面积。
在一个实施方案中，生物过程容器可以包括多个端口，用于连接到多个用于将流体进料到生物过程容器的供应管线。每个端口和相应的供应管线可以包括匹配指示器，用于帮助用户将供应管线连接到相应的端口。例如，匹配指示标可以包括颜色，使得每个端口和相应的供应管线得以颜色编码。匹配指示标也可以应用于进料管线和任何相应的端口以及喷射器和任何相应的连接器。
在一个实施方案中，生物过程容器可以包括包含通用连接器的端口。端口可以具有第一端和第二端。第一端可以用于形成与相应供应管线的可重连的附件。每个供应管线可以包括位于相应端口上游的流体过滤器。
本公开还涉及生物反应器***。生物反应器***可以包括由液体不可渗透且柔性的形状贴合材料制成的生物过程容器。生物过程容器可以具有顶部、底部和在它们之间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于接收培养基的中空外壳。生物过程容器还可以包括用于将材料进料到中空外壳中的多个入口。排水管线可以位于生物过程容器的底部，用于排出流体。混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中，并且可以包含连接到至少一个搅拌器的可旋转轴。
生物反应器***可以进一步包括至少一个与生物过程容器可操作关联的传感器，用于监测中空外壳内的至少一个参数。所述至少一个传感器可以包含pH传感器、溶解二氧化碳传感器、溶解氧传感器、氧化还原传感器、称重传感器、温度传感器或转速表。控制器可以放置成与至少一个传感器通信。控制器可以配置成从至少一个传感器接收信息，并且基于该信息，控制流体供应，以改变流体从流体供应到生物过程容器的中空外壳中的流速，用于将包含在中空外壳内的培养基的至少一个参数保持在预设限度内。
例如，在一个实施方案中，生物反应器***可以包括与生物过程容器流体连通的二氧化碳气体供应源和也与生物过程容器流体连通的液体碱供应源。所述至少一个传感器可以包含pH传感器并且控制器可以配置成通过从二氧化碳气体供应源添加一定量的二氧化碳气体来选择性地降低pH或通过从液体碱供应源添加一定量的碱来选择性地增加pH，从而将培养基的pH水平调节在预设限度内。在一个实施方案中，***可以包括与控制器通信的第一pH传感器和第二pH传感器。
在又一个实施方案中，生物反应器***可以包括氧气供应源，并且至少一个传感器可以包含溶解氧传感器。控制器可以通过基于从溶解氧传感器接收的信息周期性地将来自氧气供应源的一定量的氧气添加到培养基中来将培养基内的溶解氧水平调节在预设限度内。
在又一个实施方案中，生物反应器***可以包括二氧化碳气体供应源，并且其中至少一个传感器包含溶解二氧化碳传感器。控制器可以被配置成通过基于从溶解二氧化碳传感器接收的信息周期性地将来自二氧化碳气体供应源的一定量的二氧化碳气体添加到培养基中来将培养基内的溶解二氧化碳水平调节在预设限度内。
在又一个实施方案中，生物反应器***可以包括围绕生物过程容器的热夹套。热夹套可以与加热的流体或冷却的流体中的至少一种流体连通。生物反应器***可以进一步包括温度传感器，用于感测包含在生物过程容器内的培养基的温度。温度传感器可以与控制器通信。控制器可以被配置成接收来自温度传感器的信息，并且基于该信息，控制流体进入热夹套的流动，以增加或降低生物过程容器中包含的培养基的温度，用于将培养基维持在预设的温度限度内。
在另一个实施例中，生物反应器***可以进一步包括转速表，用于监测连接到至少一个搅拌器的可旋转轴的旋转速度。转速表可以与控制器通信。控制器可以与旋转轴的电动机连通。控制器可以配置成以基于从转速表接收的信息以在预定速度下旋转轴的方式控制电动机。
控制器可以包含一个或多个微处理器。
在一个实施方案中，控制器可以配置成从多个传感器接收信息，以便控制生物反应器内的多个参数。
在一个实施方案中，上述的一个或多个传感器可以集成到生物过程容器中，并且可以与生物过程容器一起是用即可弃的。
本公开还涉及包含由液体不可渗透且柔性的形状贴合材料制成的生物过程容器的生物反应器。生物过程容器可以具有顶部、底部和在它们之间的至少一个侧壁。生物过程室可以限定用于接收培养基的中空外壳。至少一个进料管线可以延伸到中空外壳中，用于将流体进料到生物过程容器中。
在一个实施方案中，进料管线包括位于邻近搅拌器的表面下流体出口。流体出口可以与流体控制装置相关联，所述流体控制装置仅允许流体流出流体出口并防止流体沿相反方向流动。
在替代的实施方案中，进料管线可以包含位于存在于生物过程容器中的一定体积的培养基上方的表面上流体排出。可以定位表面上流体排出，使得流过流体排出的流体与包含在生物过程容器内的培养基直接接触而不接触侧壁。
在一个实施方案中，生物反应器可以包括第一进料管线和第二进料管线，第一进料管线包括表面下流体出口，第二进料管线包括表面上流体排出。在一个实施方案中，生物反应器可以包含约1至约5个，例如约2至约3个具有表面上流体排放的进料管线。
在又一个实施方案中，本公开涉及用于生产单次使用的生物反应器的方法。方法包括由液体不可渗透且柔性的形状贴合材料构造生物过程容器的步骤。生物过程容器具有顶部、底部和在它们之间的至少一个侧壁。生物过程室限定用于接收培养基的中空外壳。中空外壳的体积可以具有约1-250毫升、250毫升至50升、50至800升，或800-200,000升的体积。生物过程容器包括多个入口，用于将材料进料到生物过程容器的中空外壳中。每个入口具有直径。
将混合装置***到中空外壳中。混合装置包含连接到至少一个搅拌器的可旋转轴。至少一个喷射器也***到生物过程容器的中空外壳中。喷射器包含具有纵向部分和横向部分的气体管。纵向部分垂直延伸到中空外壳中。横向部分位于搅拌器下方的纵向部分的一端。横向部分限定多个孔，用于将气体释放到包含在生物过程容器内的培养基中。多个孔具有直径。
排水管线连接到生物过程容器的底部。排水管线具有横截面积。
根据本发明，入口的直径、喷射器上的多个孔的直径以及排水管线的横截面积与中空外壳的体积成比例。例如，排水管线可以具有每升体积的中空外壳约0.3mm2至约0.7mm2的横截面积。
本公开还涉及包含由液体不可渗透且柔性的形状贴合材料制成的生物过程容器的生物反应器。生物过程室可以限定用于接收培养基的中空外壳，并且可以包括至少一个入口。包含连接到多个搅拌器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中。
根据本发明，生物反应器可以进一步包括细胞保留室，其与生物过程容器的中空外壳流体连通。滤液出口可以放置成与细胞保留室流体连通。滤液出口包括生物过滤器，其对液体是可渗透的但对培养基中包含的生物材料是不可渗透的。滤液出口用于连续或周期性地从细胞保留室中除去液体。流量调节器配置成在生物过程容器的中空外壳和细胞保留室之间交替培养基的流动，以实施灌注过程。
例如，流量调节器可以与加压气体源和真空源连通。流量调节器可以配置成交替地将真空或气体压力施加到包含在细胞保留室中的流体，用于在生物过程容器的中空外壳和细胞保留室之间来回循环流体。
在一个实施方案中，流量调节器可以包括往复隔膜，其在施加压力和向包含在细胞保留室中的流体施加抽吸力之间交替。
本公开还涉及包含由液体不可渗透且柔性的形状贴合材料制成的生物过程容器的生物反应器。生物过程容器限定用于接收培养基的中空外壳。包含连接到至少一个搅拌器的可旋转轴的混合装置可以延伸到生物过程容器的中空外壳中。根据本发明，搅拌器可以可折叠到旋转轴上。例如，搅拌器可以包含叶轮，叶轮包含至少一个叶片元件。叶片元件可以朝向可旋转轴可折叠。在一个实施方案中，可旋转轴连接到第一叶轮和第二叶轮，并且两个叶轮可以包括至少一个可折叠的叶片元件。扣环(retaining ring)可以位于轴上。扣环可以包括搅拌器接合位置和搅拌器脱离位置，用于在搅拌期间将搅拌器保持在直立位置或分别在折叠(collapsed)和折叠(folded)位置。
在一个实施方案中，可旋转轴包含由轴套包围的金属加强杆。可以由不锈钢制成的金属加强杆可以由连接在一起的多个部件制成。加强杆的顶部可包括用于磁性接合电动机的磁性构件。轴套可以由聚合材料组成。轴上的搅拌器也可以由聚合物材料，例如亲水聚合物制成。例如，轴套和搅拌器可以包含聚乙烯聚合物，其通过经受辐射、光或等离子体诱导或氧化而改性。
在一个实施方案中，根据本公开的单次使用的生物反应器***包含：单次使用的细胞培养生物过程容器(“SUB”)、在操作期间存放SUB的可重复使用的壳体，以及用于控制SUB及相关子***和过程的操作的控制器。相关的子***包括搅拌***、挡板***、喷射器***、进料***、收获***、监测***、控制***和装料***。
在一个实施方案中，接触细胞培养物和接触过程流体的每一个SUB的表面优选无动物源组分。
根据本公开的一个方面，提供了单次使用的生物反应器。单次使用的生物反应器可以包括生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
本公开的单次使用的生物反应器也可以与单次使用的生物反应器(SUB)***一起使用。***可以包括用于单次使用和用即可弃的柔性生物反应器生物过程容器、配置成存放柔性生物反应器生物过程容器的SUB壳体、搅拌器、喷射器、多个端口，以及配置成控制与SUB***相关的多个参数，使得SUB***产生对应于能够在类似尺寸的不锈钢生物反应器中生产的生物材料的生物材料的至少一个控制器。
根据本发明，可旋转轴可以连接到顶部叶轮和底部叶轮。顶部叶轮和底部叶轮两者可以由聚合物材料制成。例如，在一个实施方案中，叶轮可以是3D打印的。顶部叶轮和底部叶轮两者可以限定亲水表面。例如，用于形成叶轮的聚合物材料可以包含亲水聚合物或可以包含已经表面改性以使表面亲水的聚合物。
在一个实施方案中，例如，顶部叶轮和底部叶轮由聚烯烃聚合物，例如聚乙烯或聚丙烯制成。在一个实施方案中，可以使用低密度聚乙烯。低密度聚乙烯可以通过经受辐射、光或等离子体诱导或氧化来改性以形成亲水表面。
顶部叶轮可以包含水翼叶轮。另一方面，底部叶轮可以包含四个带角度的叶片的(pitched-bladed)高硬度的叶轮。叶轮与罐直径之比可以为约0.35至约0.55，例如约0.44至约0.46。顶部叶轮和底部叶轮可以具有约0.1至约0.9的功率数(Np)，并且可以具有约0.4至约0.9的流量数(Nq)。
在一些实施方案中，本公开的生物反应器是如美国专利9,670,446中所述的生物反应器，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的生物反应器包含美国专利9,670,446中描述的生物反应器的部分或特征。
在一个实施方案中，生物反应器可以可操作地连接到收获容器，例如收获容器。收获容器可以包含混合培养物和气体(例如，用于曝气培养物)的工具，例如，以确保培养物的充分充氧。在实施方案中，收获容器包含已经沉积在收获容器中的上清液，例如来自生物反应器)，以及包含气体(例如空气、氧气或空气和氧气的混合物)的顶部空间。在实施方案中，收获容器使用表面曝气以用顶部空间气体(例如空气或氧气或空气和氧气的混合物)充氧培养上清液。表面曝气涉及使来自J形管入口和来自与顶部空间接触的上清液液体表面的上清液沿着收获容器壁向下倾泻或流动。在一些实施方案中，移动或倾泻导致培养物的充氧水平增加。
收获容器可以包括至少一个混合器、至少一个用于顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个具有指向容器壁的内部J形管的装料口、至少一个收获口、至少一个样品口、至少一个温度探针、至少一个氧化还原探针、至少一个DOT探针，以及至少一个pH探针、至少一个温度控制、至少一个气流，例如至少一个空气流控制和O2流控制。
在一个实施方案中，收获容器包含空气/O2的顶部空间气体混合物，其将DOT维持在大于40％空气饱和度至小于或等于500％空气饱和度的范围内。
在一个实施方案中，生物反应器或收获容器包含氧化还原探针，例如管线内氧化还原探针，例如Mettler Toledo管线内氧化还原探针。
在一些实施方案中，方法包括生物反应器或收获容器能够提供，例如，添加或调节，例如增加或减少硫氧还蛋白或谷胱甘肽/谷氧还蛋白***的组分的活性/丰度，以在培养物或者培养物或培养物上清液的细胞中提供或维持氧化还原电位。硫氧还蛋白和谷胱甘肽/谷氧还蛋白***及其组分是本领域已知的。参见，例如Holmgren et al.Biochem SocTrans.2005Dec；33(Pt 6):1375-7；Nordberg and Arner.Free Radic Biol Med.2001Dec1；31(11):1287-312；Ghezzi P.Biochem Soc Trans.2005Dec；33(Pt 6):1378-81；Ivarsson et al.Diabetes.2005Jul；54(7):2132-42；Sen,CK.Biochem Pharmacol 55(11),1747-1758.1998Jun01；and May et al.J Biol Chem.1997Sep 5；272(36):22607-10，其内容通过引用整体并入本文。
在实施方案中，方法包括或者生物反应器或收获容器能够提供，例如，添加或调节，例如增加或减少GILT(gamma-干扰素诱导型溶酶体硫醇还原酶)的活性/丰度。参见，例如Rausch and Hastings.Mol Immunol.2015Dec；68(2Pt A):124-8.doi:10.1016/j.molimm.2015.06.008.Epub 2015Jun 23；and Hastings and Cresswell.AntioxidRedox Signal.2011Aug 1；15(3):657-668，其内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，方法包括或者生物反应器或收获容器能够向生长培养物中提供例如添加抗坏血酸、脱氢抗坏血酸或者抗坏血酸或脱氢抗坏血酸改性组分。抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的氧化还原电位调节性质是本领域已知的。参见，例如Winkler et al.Free Radic Biol Med.1994Oct；17(4):333-49，其内容通过引用整体并入本文。
在实施方案中，方法包括或者生物反应器能够向生产培养物中提供细胞内试剂，例如添加氧化还原电位指示标记，例如氧化还原敏感染料或分子探针。此类氧化还原电位指示标记可以用于监测培养物中培养物或细胞的氧化还原电位。氧化还原电位指示标记包括但不限于：2,2’-联吡啶(Ru复合物)、硝基邻菲罗啉(Nitrophenanthroline)(Fe复合物)、N-苯基邻氨基苯甲酸(N-Phenylanthranilic acid)、1,10-菲咯啉铁(II)硫酸盐复合物(邻二氮菲亚铁离子(Ferroin))、N-乙氧基菊橙(N-Ethoxychrysoidine)、2,2’-联吡啶(Fe复合物)、5,6-二甲基邻菲罗啉(5,6-Dimethylphenanthroline)(Fe复合物)、邻联茴香胺(o-Dianisidine)、二苯胺磺酸钠、二苯联苯胺、二苯胺、紫罗碱(Viologen)、2,6-二溴苯酚-靛酚钠、2,6-二氯苯酚-靛酚钠、邻甲酚靛酚钠、硫堇(劳氏紫)、亚甲蓝、靛蓝四磺酸、靛蓝三磺酸、靛蓝胭脂红(靛蓝二磺酸)、靛蓝单磺酸、酚藏花红(Phenosafranin)、番红、中性红、在此并入的任何文件中公开的标记，以及公开于M et al,Antioxid RedoxSignal.2016May1；24(13):680-712中的标记，其内容通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，方法包括或者生物反应器或收获容器能够向生产培养物提供细胞外试剂，例如代谢物，如本文所述的过渡态金属离子。
在一些实施方案中，可以根据以下原则设置生物反应器或用于本公开的方法的生物反应器：
-在收获生产培养物的同时生物反应器的功能设置对于确保离开生物反应器的培养物充分充氧并将溶解氧携带到随后的处理步骤中是重要的。一旦细胞培养物已经达到目标温度以启动收获步骤，确保抑制可能拮抗生产培养物的充氧的所有过程控制。这些可以包括如果激活则抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制CO2气流控制，如果激活则按需抑制碱控制，以及如果激活则抑制进料应用。
-当细胞对氧气的需求低时，氮气喷射气流通常用作压载物(ballast)以将溶解氧张力(DOT)控制到设定点，然而这可以在生产阶段期间保持主动流动。氮气也用于气升式生物反应器中作为载体压载物以维持这些容器中的混合。然而，然而，在使用氮气喷射气体的情况下，必须对其进行抑制以防止在收获步骤期间稀释用于给生产培养物曝气的喷射气体的氧气成分，因为这将防止培养物中的溶解氧、DOT达到100％空气饱和度(如果仅使用空气喷射)或预期的最大DOT(如果使用空气和氧气的混合物)。因此，喷射的氮气限制了对于给定的单独空气的喷射或空气-氧气混合物的喷射所预期的最大溶解氧浓度。响应于过程pH升高到控制范围以上，将CO2气流喷射到生产培养物中。当CO2气流喷射激活时，它还稀释喷射气体的氧气成分，其反过来限制了对于给定的单独空气的喷射或空气-氧气混合物的喷射所预期的最大溶解氧浓度。因此，在收获生产培养物期间其不激活防止曝气喷射气体的稀释。
-为了在生产培养物的培养期间进行严格的pH控制，需要响应于过程pH值低于控制范围的向生产培养物中添加碱溶液。然而，由于操作体积的不断减少和碱溶液的过量使用，在收获生产培养物的同时，施加碱溶液存在更大的细胞损伤和细胞死亡的潜在风险。当培养物正在积极生长和代谢时，施加进料到生产培养物中是必要的。然而，在收获期间，持续减少的操作体积影响生物反应器的混合行为并且由于进料的非生理性质(高渗透压和高或低pH)和在混合不良的容器中产生的微环境，随着进料溶液的施加，导致更大的细胞损伤和细胞死亡。
-一旦生产培养物已经达到目标温度以启动收获步骤，确保激活可能促进生产培养物的充氧的所有过程控制。这些可以包括如果未激活则激活喷射的空气和/或氧气流，如果未激活则激活顶部空间空气和/或氧气流，以及最终如果未激活则激活顶部空间压力。一旦生产培养物已经停止生长，或者当其冷却时，按需空气和/或氧气喷射流可以变得非常低或甚至停止，以准备收获。在各种连续固定的流速下持续的空气和氧气喷射施加对于充氧生产培养物和确保生产培养物将溶解氧携带入细胞澄清过滤器壳体或离心机以及生物反应器和过滤器壳体或离心机之间以及过滤器壳体或离心机与上清液收集容器(例如收获容器)之间的流动路径是至关重要的。顶部空间或覆盖曝气通常在生产培养物的培养期间是激活的，并且确保生物反应器顶部空间不断地清除代谢的CO2气体。在收获期间生产培养物的持续覆盖曝气促进了培养物的表面充氧，尽管比用喷射气体实现的更慢，但是当生产培养物从生物反应器中排出时避免产生泡沫。
-对于能够在顶部空间压力下操作的生物反应器，以及在生产培养物的培养期间使用压力以帮助气体更大地溶解到液相(培养物)中或以在生物反应器内维持正压力以防止环境污染物进入容器的无菌边界的情况下，建议在收获期间将其维持。在通过压力驱动收获的实践中，如果用于加压生物反应器的气体是空气或空气和氧气的混合混合物，则将辅助培养物充氧。然而，如果通过泵驱动收获，则通常不使用顶部空间压力。在此类情况下使用具有空气或空气/氧气混合物的顶部空间压力有利于当培养物以取决于收获操作期间所需的操作规模的所需的快速流动时，帮助培养物充氧并防止收获管在泵头上游的抽吸头(suction head)下方塌陷。
-对于单次使用生物反应器，设计相对于内孔尺寸和壁强度的收获管线以抵抗在高流速下在泵头上游产生的抽吸下塌陷，对于确保收获流速不受管阻塞的阻碍是重要的。管阻塞的影响不仅在于限制收获流速，而且可以促进更大的细胞死亡和细胞裂解以及从培养物中溶解氧的脱气。管阻塞影响有可能通过以较慢的流速增加壳体中的停留时间将过滤器壳体与细胞和产物暴露于低氧/缺氧环境中，通过更大的细胞死亡和通过狭窄开口的细胞裂解促进细胞内因子的释放并且通过在抽吸区内脱气从培养物中除去溶解氧，并从而将培养物携带的较低量的溶解氧带入到过滤器外壳中。在一个实施方案中，本文公开的方法避免了这些对产物稳定性的负面影响。
选择收获管的内径和所用泵的选择以获得所需的流速，以通过深度过滤器或与深度过滤器连接的离心机实现用于细胞澄清步骤的过程体积通量(每个过滤区域的过程上清液的升，L/m2)。收获管线的构造的材料需要具有刚性以抵抗在泵头上游产生的抽吸头中的塌陷。建议将其他常用的铂固化硅或C-flex用于收获管的构造。编织管的使用可以认为是常用材料的替代品。
-在一些实施方案中，方法包括或生物反应器能够优化深度过滤器区域以避免过滤器澄清步骤期间过滤器的结垢和堵塞，并且因此，最小化细胞培养物在过滤器壳体内的停留时间是确保生产培养物的充氧和当培养物流入并在作为上清液排出前停留在过滤器壳体中时其从生物反应器携带出的溶解氧不会耗尽的整体步骤。此外，流速应足以使澄清步骤(过滤器壳体)和c上清液收集容器(例如收获容器)之间的上清液的停留时间最小化。
对细胞澄清过滤器(初级、次级和三级)区域进行了优化，以确保满足所需的过程体积通量，同时不会损失过滤器上的流量(flux)(L/m2/h)或滤液质量(通过微粒的突破)，直至其影响初级或阶段1过滤器下游的次级或阶段2和三级或阶段3过滤器的性能的程度。此外，选择的用于最佳细胞澄清的过滤器区域和过滤器类型必须避免不同过滤器阶段之间的较高压力差，其意味着过滤器结垢和即将发生的过滤器堵塞。因此，预期通过不同的连续连接的过滤器的流量的减少将导致过滤器壳体内的停留时间增加并导致过滤器壳体内的上清液中溶解氧的更多消耗/耗尽，导致上清液中的低氧。初级和次级过滤器之间的较高压力差的累积也是有问题的，因为它促进了更高的细胞裂解和细胞因子的释放，其当激活时使产物不稳定。
-在一些实施方案中，方法包括或生物反应器能够确保在良好曝气和混合的收获容器(钢或单次使用)中收集无细胞上清液。设计收获容器以确保其通过以下方式促进良好的表面充氧：通过设计指向容器壁的内部喷嘴将收集的滤液冲击到容器壁表面上，迫使滤液沿容器壁向下倾泻；和/或在用于收集滤液之前用空气或任何给定的空气和氧气混合物组成的气体环境填充收获容器的能力，以促进收集的滤液的充氧达到大于>40％空气饱和度和≤500％空气饱和度。
在一个实施方案中，收获容器是不锈钢收获容器。上清液收集的方法和收获容器的设计是在收获步骤中保护产物的方法的最后元素。目前，用混合器将收获的上清液收集在带夹套的不锈钢容器中，以连续混合收集的上清液。收获的上清液通过顶部空间端口排出到收获容器中，该顶部空间端口具有内部“J”形管，其将上清液的流引导到容器壁上，从那里它沿着壁向下倾泻以收集在罐的底部。另外，这些不锈钢容器填充有无菌空气，以在容器已经蒸汽就地灭菌之后使容器保持加压在大气压以上，以防止环境污染物进入容器无菌边界。据推测，在这些容器中收集的收获上清液在加压空气的大气压下沿着容器壁向下倾泻时得以充氧。通过与收集的上清液上方的顶部空间的表面接触进行上清液的进一步充氧。
在另一个实施方案中，收获容器是单次使用收获容器。单次使用的上清液收集容器是gamma-辐射和抽空的袋子。在上清液收集期间，袋子装料并置换真空，在收集的上清液上方没有形成气态顶部空间。这些袋子没有搅拌器，因此收集的上清液不能混合，并且袋子安装在未夹套的塑料或不锈钢壳体中，其不能加热或冷却收集的上清液。一旦袋子装满上清液，将它们转移到+5℃贮藏长达14天。纯化过程可以在收获后立即，或者在14天的保持期内从初级捕获步骤开始。
确保收获步骤期间生产培养物的充氧维持在大于40％空气饱和度至小于500％空气饱和度的范围内的DOT的方法旨在用溶解氧“装载”生产培养物，所述溶解氧预期被带入并通过澄清步骤，使得当收集上清液时，其具有足够的溶解氧以防止可以促进产物解离的细胞因子的激活。设计收获容器以确保收获的上清液继续维持充分在充氧状态，同时保持在+5℃下贮藏长达14天。这是通过容器设计实现的，该容器设计确保上清液在收集和保持在+5℃贮藏下时继续充氧，例如通过表面曝气。在一个实施方案中，收获容器设计包含以下特征：
-容器或单次使用的袋子具有搅拌器/混合器，其提供足够的轴向主体(bulk)混合以允许收集的上清液通过表面曝气充氧。
-容器或单次使用袋壳体用适当尺寸的热循环器夹套，以允许容器内容物的温度达到+5℃，例如，从室温在4小时内，并在相似的持续时间内从+5℃加热至室温。
-容器或单次使用袋壳体配有适当尺寸的空气和氧气气体质量流量控制器，以允许顶部空间与空气、氧气或富氧气体曝气。
-容器或单次使用袋和壳体配有覆盖气体过滤器(适用于适合操作规模的流速的空气和氧气气体，以及适用于适合操作规模的流速的空气和氧气气体的出口气体排出过滤器，以在空气或任何给定的空气和氧气混合物组成的气体环境中收集上清液滤液之前，允许空气和氧气连续流过顶部空间以填充收获容器，以在上清液滤液收集和收集完成时促进上清液滤液的充氧至大于>40％空气饱和度和≤500％空气饱和度。
-如果压力超过操作规模和容器设计的安全限制，则容器或单次使用袋和壳体配有压力传感器和安全联锁装置以停止顶部空间气体。
-容器或单次使用袋和壳体配有过程传感器端口，用于pH、DOT、氧化还原和温度。容器或袋内的探针位置允许在适合操作规模的最低操作体积下进行监测。
-容器或单次使用袋在容器的顶部配有添加口，端口配有内部喷嘴，引导液体流到容器壁上并促使液体沿容器壁向下倾泻。
细胞和细胞培养物
在一个方面，本公开涉及用于工程化或制备细胞或细胞系的方法和组合物，所述细胞或细胞系生产产物，例如重组产物，例如稳定化的产物，例如本文所述的稳定化的蛋白质。在另一方面，本发明涉及用于工程化或制备细胞或细胞系的方法和组合物，其具有改善的，例如降低的解离，提高的生产力和/或产物质量。
在实施方案中，细胞是哺乳动物或非哺乳动物细胞，例如昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、古细菌细胞，例如来自古细菌(Archaea)物种的细胞或细菌细胞。在实施方案中，细胞来自人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴子、猿、狗、鸭、马、鹦鹉、雪貂、鱼或猫。在实施方案中，细胞是动物细胞。在实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或啮齿动物细胞，例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在实施方案中，细胞是原核细胞，例如细菌细胞。在实施方案中，细胞是放线菌物种，例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。
在一个实施方案中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHOFUT8GS敲除细胞、CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞。CHO FUT8敲除细胞是，例如CHOK1SV(Lonza Biologics,Inc.)。
在另一个实施方案中，细胞是HeLa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、CHO-K1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SVGS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DUXB11和CHOZN，或由其衍生的任何细胞。在一个实施方案中，细胞是干细胞。在一个实施方案中，细胞是本文所述任何细胞的分化形式。在一个实施方案中，细胞是衍生自培养物中的任何原代细胞的细胞。
在实施方案中，细胞是本文所述的任何一种细胞，其生产产物，例如本文所述的产物。在实施方案中，细胞是本文所述的任何一种细胞，其包含编码重组多肽的外源核酸，例如，表达重组多肽，例如选自表2或3的重组多肽。
在实施方案中，细胞培养作为分批培养、补料分批培养、拉伸和填充培养或连续培养实施。在实施方案中，细胞培养物是贴壁培养物。在实施方案中，细胞培养物是悬浮培养物。在实施方案中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模式生物体或人受试者中。
例如，方法在大规模生物反应器中进行，例如，具有至少两个叶轮的生物反应器、大规模生物反应器***和用于哺乳动物细胞的大规模培养和繁殖的方法。在实施方案中，生物反应器是如2011/0312087中所述的生物反应器。
在实施方案中，细胞在如USSN 62/242,758中公开的生物反应器中培养，其内容以其整体并入本文。其中公开了用于控制至少一个生物反应器、其他细胞培养相关设备和包含这些的任何组合的***的***和方法。例如，用于生物反应器控制的***和方法可以包括控制多个生物反应器和其他类型的培养相关设备，例如用于发酵、收获的设备，用于微滤和纯化的设备(例如，液相色谱防滑***)，缓冲液制备，培养基制备等。多个生物反应器和其他类型的培养相关设备可以位于工厂中，并且此类设备的控制可以称为全厂控制***(Plant-Wide Control System)(“PWCS”)。
在实施方案中，方法在制造设施中进行，该制造设施使用至少一件单次使用用即可弃的技术提供批量和连续制造，例如，在USSN 62/246,478中描述的，其内容以其整体并入本文。在实施方案中，制造设施用于生产活性药物成分(“API”)。
可以使用本领域已知的方法实现冷却。例如，较大的反应器通常具有水夹套，热固定的水通过该水夹套以控制培养物温度。在实施方案中，将过程冷却水供应输送到夹套中以获得实质且快速的冷却。在实施方案中，制冷单元用于移除热量。当培养(即，导致细胞数量增加，或诱导细胞培养物产生所需产物)时或在生产阶段结束冷却生产培养物时，或当收获细胞时，可以在一个或多个所需时间进行冷却。因为生物体在它们生长的最佳温度方面不同，所以将基于冷却步骤之前的一个或多个步骤的相对较高的温度来选择冷却温度。在实施方案中，进行培养细胞的冷却以降低细胞的氧消耗率，使得收获流通过收获过程维持充氧。
对于哺乳动物细胞系，培养过程温度变化通常为27-35℃(例如27、28、29、30、31或32、33、34或35℃)。在一些实施方案中，在指数生长阶段后温度降至30-33℃。不希望受理论束缚，据信在生产阶段之后将温度降至12-18℃，例如15℃，降低氧消耗的比率10倍。
在实施方案中，培养基不含血清。
用于哺乳动物细胞系的其他适合的培养基和培养方法是本领域熟知的，例如，如美国专利号5,633,162中所述。用于实验室烧瓶或低密度细胞培养并适应特定细胞类型需要的标准细胞培养基的实例是例如：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre,G.,The Journal of the American Medical Association,199,p.519f.1967)、L-15培养基(Leibovitz,A.et al.,Amer.J.of Hygiene,78,1p.173ff,1963)、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、Eagle最小必需培养基(MEM)、Ham’s F12培养基(Ham,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288ff.1965)或Iscoves缺乏白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的改良DMEM(Iscoves et al.,J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如，Ham’s F10或F12培养基专为CHO细胞培养而设计。在EP-481 791中描述了特别适用于CHO细胞培养的其他培养基。其他适合的培养方法是本领域技术人员已知的，并且可以取决于重组多肽产物和所用的宿主细胞。测定或优化适用于表达和生产由细胞表达的产物(例如重组多肽)的条件在普通技术人员的技能范围内。
用于定量生产或分泌(例如分泌到培养基中)的产物的量、水平或数量的测定包括蛋白质定量测定(例如Bradford蛋白质测定、SDS-PAGE分析)、免疫印迹(例如蛋白质印迹(western blot))和自动化装置(例如使用nanodrop装置)。用于测量增加的蛋白质产量的其他方法是本领域技术人员熟知的。例如，通过由ELISA测量组织培养基中的浓度，可以小规模测定重组蛋白质产量的增加(Smales et al.2004Biotechnology Bioengineering88:474-488)。它也可以通过ForteBio Octet定量测定，例如，用于高通量测定培养基中重组单克隆抗体(mAb)的浓度(Mason et al.2012Biotechnology Progress 28:846-855)或通过蛋白A HPLC在较大规模(Stansfield et al.2007Biotechnology Bioengineering97:410-424)。用于测定产物(例如，本文所述的重组多肽)的产量的其他方法可以指产物的特定产率(qP)，特别是细胞中的重组多肽和/或指活细胞浓度(IVC)的时间积分。在实施方案中，用于测定产量的方法包括测定qP和IVC的组合。根据Porter等人的计算，重组多肽产量或生产力，定义为培养基中多肽的浓度，是这两个参数(qP和IVC)的函数(Porter etal.2010Biotechnology Progress 26:1446-1455)。用于测量蛋白质产量的方法也在本文提供的实施例中进一步详细描述。
在一个实施方案中，本文所述的方法产生具有改善的产物质量的细胞。在一个实施方案中，产物质量的改善导致产物质量增加，例如，与未经受较低温度的细胞产生的产物的量、水平或数量相比，例如增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更多，增加产物质量；或1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多增加产物质量。产物质量的此类增加可以例如通过以下一项或多项来举例说明：
i)二硫键扰乱的增加或减少(例如，增加或减少所需的同种型或结构，结果是增加或减少二硫键扰乱，例如对于抗体分子产物)。
ii)非聚集产物的量或数量的增加(或聚集产物的量或数量的减少)；
iii)适当折叠或组装的产物的量或数量的增加(或错误折叠、展开、部分组装或未组装产物的量或数量的减少)，或适当折叠或组装的产物与展开、错误折叠、部分组装或未组装产物的比率增加；
iv)全长产物的量或数量的增加(或产物的破碎的减少)；
v)所需的翻译后修饰的增加(或未修饰或未正确修饰的产物的减少)；
vi)聚糖异质性的增加或减少(例如，对于糖基化产物)；
vii)功能性产物的量或数量的增加(或非功能性或失效性产物的量或数量的减少)，或功能性与非功能性或功能失调的产物的比率的增加；和/或
用于测量如本文所述生成的细胞或细胞系的产物质量(例如产物质量的改善)的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，用于测定表达的重组多肽产物的一级序列的保真度的方法是本领域已知的，例如质谱法。适当折叠的产物(例如表达的重组多肽)的量或浓度的增加可以通过圆二色性或评估表达的重组多肽的内在荧光来测定。可以使用各种功能测定来测试功能性产物的量或浓度的增加，功能测定取决于重组产物(例如重组多肽)的特性。例如，可以通过ELISA或其他免疫亲和测定来测试抗体。用于测定产物质量增加的其他方法，例如，测定聚集、翻译后修饰、二硫键扰乱，可以通过尺寸排阻色谱、高效液相色谱、动态光散射(DLS)方法和蛋白质电泳(PAGE)方法来评估。
在一些实施方案中，可以进行另外的步骤以改善产物的表达，例如产物的转录、翻译和/或分泌，或产物的质量，例如，一级序列的适当折叠和/或保真度。此类另外的步骤包括引入改善产物表达或产物质量的试剂。在实施方案中，改善产物表达或产物质量的试剂可以是小分子、多肽或编码改善蛋白质折叠的多肽(例如伴侣蛋白)的核酸。在实施方案中，有助于蛋白质折叠的试剂包含编码伴侣蛋白(例如BiP、PD1或ERO1)的核酸(Chakravarthi&Bulleid2004；Borth et al.2005；Davis et al.2000)。提高产物的产量和质量的其他另外的步骤包括转录因子如XBP1和ATF6的过表达(Tigges&Fussenegger 2006；Cain etal.2013；Ku et al.2008)以及凝集素结合伴侣蛋白如钙联蛋白和钙网蛋白的过表达(Chung et al.2004)。通过引入编码所述试剂的外源核酸，可以实现有助于或改善本文所述的蛋白质折叠、产物质量和产物产量的试剂的过表达。在另一个实施方案中，改善产物表达或产物质量的试剂是可以添加到细胞培养物中以增加产物表达或产物质量的小分子，例如DMSO。在一个实施方案中，将细胞维持在比细胞通常生长的温度更低的温度，例如低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃，可以通过减少或消除产物的解离来改善产物的质量。
本文描述的任何方法可以进一步包括用于识别具有高生产力或生产高质量产物的细胞的另外的选择步骤。例如，FAC选择可以用于选择具有所需特征的特定细胞，特征例如蛋白质折叠蛋白质(例如伴侣蛋白)的更高表达。
在一个方面，本公开提供了包括用于回收或取回重组多肽产物的步骤的方法。在重组多肽从细胞分泌的实施方案中，方法可以包括从细胞、细胞群或培养细胞的培养基中取回、收集或分离重组多肽的步骤。在重组多肽在细胞内的实施方案中，重组多肽产物的纯化包括从任何以下各项的一项或多项中分离细胞产生的重组多肽：宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其他碎片。
在实施方案中，本文所述的工艺提供基本上纯的蛋白质产物。如本文所用，“基本上纯的”意指基本上不含热解材料，基本上不含核酸，和/或基本上不含来自宿主细胞的内源细胞蛋白酶和组分，例如聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白。基本上纯的蛋白质产物含有例如少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的来自宿主细胞的污染性内源蛋白质、核酸或其他大分子。
用于回收和纯化产物(例如重组多肽)的方法在本领域中已经很好地建立。为了回收重组多肽产物，使用物理或化学或物理-化学方法。物理或化学或物理-化学方法可以是过滤方法、离心方法、超速离心方法、提取方法、冻干方法、沉淀方法、色谱方法或其两种或更多种方法的组合。在实施方案中，色谱法包括尺寸排阻色谱(或凝胶过滤)、离子交换色谱，例如阴离子或阳离子交换色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱和/或多峰色谱中的一种或多种。
在实施方案中，温度的降低与降低温度、与降低pH、硫氧还蛋白抑制剂，例如金属离子相结合。在实施方案中，组合处理在如上所述的生物反应器中进行。
编号实施方案
本发明可以在以下编号段落中的任何一个中定义。
1.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
2.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
3.段落1或2的方法，其中所述方法进一步包括在从生产培养物中分离细胞期间，建立大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围内的溶解氧张力(DOT)。
4.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
在所述生产阶段的结束时将所述生产培养物冷却至T收获温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从生产培养物中分离细胞和收集上清液，将所述DOT增加至大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
5.段落1-4中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属离子选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+。
6.段落1-5中任一项的方法，其中通过选自下组的一个或多个动作进一步维持所述DOT：如果激活则抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制碱控制，如果激活则按需抑制CO2气流控制，通过如果激活则抑制进料添加，如果未激活则激活顶部空间压力，以及如果未激活则激活空气/O2的顶部空间流动。
7.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
(i)在从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述方法包括：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度，所述温度是低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，其是低于T生产的温度。
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质或稳定化的产物的制剂，例如稳定化的蛋白质。
8.段落7的方法，其中所述方法包括a、b和f。
9.段落7的方法，其中所述方法包括a、c和f。
10.段落7的方法，其中所述方法包括b和c。
11.段落7的方法，其中所述方法包括a、b、c和f。
12.段落1-11中任一项的方法，其中所述生产培养物具有至少10％、至少30％或30％和70％之间空气饱和度的充氧水平。
13.段落12的方法，其中所述充氧水平大于40％至小于或等于70％空气饱和度。
14.段落4-13中任一项的方法，其中所述过渡金属是Zn2+、Mn2+和/或Cu2+。
15.段落4-14中任一项的方法，其中Zn2+以10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220，或250至300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、550、600、650、700或1000μM，例如200-400μM的浓度存在。
16.段落4-15中任一项的方法，其中Mn2+以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40，或50至60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μM，例如10-100μM的浓度存在。
17.段落4-16中任一项的方法，其中Cu2+以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40，或50至60、70、80、90、100、120、140、160、180或200μM，例如10-100μM的浓度存在。
18.段落4-17中任一项的方法，其中Zn2+以200至400μM的浓度存在，Mn2+以10-100μM的浓度存在并且Cu2+以10-100μM的浓度存在。
19.段落1-18中任一项的方法，其中所述稳定化的蛋白质包含第N个半胱氨酸残基和第N+1个半胱氨酸残基，其中N＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多，例如N＝1或N＝3。
20.段落19的方法，其中，以天然形式，稳定化的蛋白质包含第N个半胱氨酸残基和第N+1个半胱氨酸残基之间的二硫键。
21.段落20的方法，其中：
i)N＝1，并且以天然形式，所述多肽包含第一个半胱氨酸残基和第二个半胱氨酸残基之间的二硫键；
ii)N＝3，并且以天然形式，所述多肽包含第三个半胱氨酸残基和第四个半胱氨酸残基之间的二硫键；
iii)N＝3，并且以天然形式，所述多肽包含第一个半胱氨酸残基和第二个半胱氨酸残基之间的二硫键以及第三个半胱氨酸残基和第四个半胱氨酸残基之间的二硫键。
22.段落1-21中任一项的方法，其中例如，如通过大小分离，例如通过凝胶电泳，例如通过非还原凝胶电泳测定的至少80、85、90、95、96、97、98或99％重量的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质是在预先确定的状态，例如天然构象。
23.段落1-22中任一项的方法，其中所述产物是抗体，并且例如，如通过大小分离，例如通过凝胶电泳，例如通过非还原凝胶电泳测定的至少80、85、90、95、96、97、98或99％重量的所述抗体是在预先确定的状态，例如天然构象。
24.段落1-23中任一项的方法，其中所述产物是抗体，并且至少80、85、90、95、96、97、98或99％重量的所述抗体是包括各自包含轻链可变区的两条链和各自包含重链可变区的两条链的四聚体。
25.段落4-24中任一项的方法，其中T收获足够低以抑制所述二硫键的解离。
26.段落4-25中任一项的方法，所述方法包括在T收获下从所述生产培养物中分离所述细胞。
27.段落4-26中任一项的方法，其中所述细胞系在第一温度T培养下培养，并且在T收获下收获。
28.段落27的方法，其中T收获比T培养低至少19℃至25℃。
29.段落4-28中任一项的方法，其中T收获是12℃-18℃，例如15℃。
30.段落27-29中任一项的方法，其中T培养是30℃-38℃。
31.段落4-30中任一项的方法，其中在T收获下将所述蛋白质，例如作为所述上清液的组分施加至滤器。
32.段落1-31中任一项的方法，其中在生物反应器中培养所述细胞。
33.段落32的方法，其中在生产阶段后将所述生物反应器的内容物冷却至T收获。
34.段落32的方法，其中在适于使所述细胞培养物达到T收获的温度下，通过与包含流体例如水的构件例如冷却夹套接触来冷却所述细胞培养物。
35.段落32-34的方法，其中所述生物反应器具有1-250毫升、250毫升至50升、50至800升或800-200,000升的体积。
36.段落32-35的方法，其中所述生物反应器是单次使用的生物反应器，例如设计以允许细胞培养物的温育和随后进行处置的生物反应器，例如，如本文所述。
37.段落32-36的方法，其中所述生物反应器包含生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
38.段落32-37的方法，其中所述生物反应器包含用于监测和维持一个或多个参数，例如pH、溶解氧张力(DOT)或温度的工艺和探针。
39.段落32-37的方法，其中所述生物反应器是具有至少4000L的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮的自承式生物相容性罐，并且其中所述至少一个顶部叶轮是水翼叶轮，并且其中所述顶部叶轮和所述底部叶轮之间的叶轮间距(Ds)至少为1.229x所述底部叶轮的直径(D底部)并且至多为2xD底部，其中所述顶部叶轮上方的液体高度(Do)至少为0.3x所述顶部叶轮的直径(D顶部)并且至多为2.5xD顶部，并且其中所述罐底和所述底部叶轮的中心线之间的底部间隙(Dc)至少为0.35xD底部。
40.段落32-39的方法，其中所述生物反应器可操作地连接至收获容器。
41.段落40的方法，其中所述收获容器配置为包含或提供所述贮存培养物上方的顶部空间，例如其中所述顶部空间包含气体，例如空气或氧气，或气体的混合物，例如空气或空气和氧气。
42.段落41的方法，其中所述收获容器配置为允许通过J形管口收集上清液至所述顶部空间中，使得所述上清液沿着所述收获容器的壁向下移动或倾泻(cascade)。
43.段落42的方法，其中将上清液传递至所述顶部空间中的所述收获容器的表面，例如壁上，并沿着所述表面流动，返回至贮存培养物中。
44.段落43的方法，其中在所述收获容器中的上清液移动或倾泻导致所述上清液的充氧水平增加。
45.段落40-44中任一项的方法，其中通过表面曝气(aeration)将所述上清液的DOT维持在所述收获容器中大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围内。
46.段落40-45中任一项的方法，其中所述收获容器包含冷却装置和机械装置以进一步将所述贮存培养物冷却至5℃至8℃的温度。
47.段落40-46中任一项的方法，其中所述收获容器包含能够轴向混合的混合器装置和pH滴定剂添加口。
48.段落40-47中任一项的方法，其中所述收获容器包含至少一个顶部空间气体入口和至少一个气体出口。
49.段落40-48中任一项的方法，其中所述收获容器进一步包含至少一个空气流控制器和至少一个O2流控制器以提供空气和O2混合物。
50.段落40-49中任一项的方法，其中所述收获容器包含检测所述上清液的DOT、氧化还原、温度和pH的传感器。
51.段落50的方法，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出用于在分离之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加；以及向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
52.段落50的方法，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出用于实现改变向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
53.段落40-52中任一项的方法，其中使用抗阻塞的管将所述生物反应器连接至所述收获容器。
54.段落53的方法，其中所述抗阻塞的管是编织的。
55.段落40-54中任一项的方法，其中所述生物反应器和所述收获容器之间的流动路径包含DOT和氧化还原传感器/探针的安装。
56.段落55的方法，其中所述DOT和氧化还原传感器/探针输出用于在收获之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加。
57.段落40-56中任一项的方法，其中所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述生物反应器的顶部空间的表面的元件，例如管线(line)或喷嘴。
58.段落40-57中任一项的方法，其中所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述生物反应器的顶部空间的表面的第二元件，例如管线或喷嘴。
59.段落1-58中任一项的方法，所述方法进一步包括在所述培养物内并且在分离所述蛋白质时监测所述细胞的氧化还原电位，用于维持所述氧化还原电位的目的。
60.段落59的方法，其中监测所述氧化还原电位包括使用管线内监测探针，例如如本文所述的Mettler Toledo。
61.段落58的方法，其中监测所述氧化还原电位包括评估影响产物稳定性的细胞因子的氧化还原状态，其中所述细胞因子可以损害以下途径的的酶或代谢辅因子：谷胱甘肽/还原的谷胱甘肽途径、硫氧还蛋白/还原的硫氧还蛋白途径或磷酸戊糖途径(例如谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白、葡萄糖-6-磷酸、NADPH、NADP+、6-膦酰基葡萄糖内酯(6-phosphonoglucolactone)、6-磷酸葡萄糖酸盐或核酮糖-5-磷酸)。
62.段落1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8GS敲除细胞、CHOZN或CHO衍生的细胞。CHO GS敲除细胞(例如GSKO细胞)是，例如CHO-K1SV GS敲除细胞(LonzaBiologics,Inc.)。CHO FUT8敲除细胞是，例如CHOK1SV(Lonza Biologics,Inc.)。
63.段落1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是CHO-GSKO细胞、CHOXceed细胞。CHO GS敲除细胞(例如GS-CHO细胞)是，例如CHO-K1SV GS敲除细胞(LonzaBiologics,Inc.)。CHO FUT8敲除细胞是，例如CHOK1SV(Lonza Biologics,Inc.)。
64.段落1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、PotelligentCHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN，或由其衍生的任何细胞。
65.通过段落1-64中任一项的方法生产的稳定化的蛋白质。
66.包含段落65的稳定化的蛋白质的药物组合物。
67.段落66的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
68.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
69.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
70.段落68或69的生物反应器，其中所述生物反应器能够在从生产培养物中分离细胞期间，建立大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围内的溶解氧张力(DOT)。
71.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
将所述生产阶段的结束时的所述生产培养物冷却至T收获温度，所述T收获温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从所述生物反应器中除去所述生产培养物，将所述DOT增加至大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
72.段落68-71中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器进一步能够在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4 +、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+。
73.段落68-72中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器进一步能够通过选自下组的一个或多个动作进一步维持所述DOT：抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制碱控制，如果激活则按需抑制CO2气流控制，通过如果激活则抑制进料添加，如果未激活则激活顶部空间压力，以及如果未激活则激活顶部空间气流/O2流。
74.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
(i)在从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的10mV至-1000mV、-20mV至-800mV、-30mV至-700mV、-40mV至-600mV、-50mV至-500mV、-50mV至-400mV、-50mV至-300mV、-50mV至-200mV或-50mV至-150mV，例如-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述生物反应器进一步能够：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，所述温度是低于T生产的温度。
75.段落74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、b和f。
76.段落74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、c和f。
77.段落74的生物反应器，其中所述生物反应器能够b和c。
78.段落74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、b、c和f。
79.段落68-77中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器可操作地连接至收获容器。
80.段落79的生物反应器，其中所述收获容器配置为包含或提供所述贮存培养物上方的顶部空间，例如其中所述顶部空间包含气体，例如空气或氧气，或气体的混合物，例如空气或空气和氧气。
81.段落80的生物反应器，其中所述生物反应器配置为允许培养物循环进入所述顶部空间中，使得所述培养物沿着所述收获容器的壁向下移动或倾泻。
82.段落81的生物反应器，其中将来自贮存培养的培养物传递至所述顶部空间中的所述生物反应器的表面，例如壁上，并沿着所述表面流动，返回至贮存培养物中。
83.段落82的生物反应器，其中移动或倾泻导致所述培养物中充氧水平增加。
84.段落79-83中任一项的生物反应器，其中所述收获容器能够通过表面曝气将所述贮存培养物的DOT维持在大于10、20、30、40、50或60％至小于或等于70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500％空气饱和度，例如大于40％至小于或等于500％空气饱和度的范围。
85.段落79-84中任一项的生物反应器，其中所述收获容器包含一个或多个选自下组的组分：冷却装置和机械装置以进一步将所述贮存培养物冷却至5℃至8℃的温度；能够轴向混合的混合器装置和pH滴定剂添加口；至少一个顶部空间气体入口和至少一个气体出口；至少一个空气流控制器和至少一个O2流控制器以提供空气和O2混合；以及检测所述上清液的DOT、氧化还原、温度和pH的传感器。
86.段落85的生物反应器，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出能够在分离之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加；以及向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
87.段落85的生物反应器，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出能够实现向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
88.段落79-87中任一项的生物反应器，其中使用抗阻塞的管将所述生物反应器连接至所述收获容器。
89.段落88的生物反应器，其中所述抗阻塞的管是编织的。
90.段落79-88中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器和所述收获容器之间的流动路径包含DOT和氧化还原传感器/探针的安装。
91.段落79-90中任一项的生物反应器，所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述收获容器的顶部空间的表面的元件，例如管线或喷嘴。
92.段落79-91中任一项的生物反应器，所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述收获容器的顶部空间的表面的第二元件，例如管线或喷嘴。
93.段落68-92中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器是单次使用的生物反应器，例如设计以允许细胞培养物的温育和随后进行处置的生物反应器，例如，如本文所述。
94.段落68-93中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器包含生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
95.段落68-92中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器是具有至少4000L的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮的自承式生物相容性罐，并且其中所述至少一个顶部叶轮是水翼叶轮，并且其中所述顶部叶轮和所述底部叶轮之间的叶轮间距(Ds)至少为1.229x所述底部叶轮的直径(D底部)并且至多为2xD底部，其中所述顶部叶轮上方的液体高度(Do)至少为0.3x所述顶部叶轮的直径(D顶部)并且至多为2.5xD顶部，并且其中所述罐底和所述底部叶轮的中心线之间的底部间隙(Dc)至少为0.35xD底部。
96.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中产物包含双特异性抗体。
97.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中产物是表1、表2、表3或表4中列出的蛋白质。
98.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中产物是抗体，例如单克隆抗体，例如IgG1抗体。
99.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞衍生自哺乳动物细胞，例如小鼠、大鼠、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、叙利亚仓鼠、猴子、猿、狗、马、雪貂或猫细胞。
100.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞衍生自非哺乳动物细胞，例如来自鸭、鹦鹉、鱼、昆虫、植物，真菌、酵母、细菌的细胞，例如，大肠杆菌，例如古细菌或放线菌。
101.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞是干细胞。
102.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞是本文所述任何细胞的分化形式。
103.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞是衍生自培养物中的任何原代细胞的细胞。
104.段落1-64中任一项的方法或段落68-95中任一项的生物反应器，其中重组宿主细胞是CHOK1SV、GS-KO或DUX-B11细胞。
实施例
通过参考以下实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，除非另有说明，否则不旨在限制性。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应该解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进一步描述，据信本领域普通技术人员可以使用前述说明和以下说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1.冷却细胞缓和细胞样品的收获和贮藏相关的缺氧
氧耗尽是已鉴定和记录的解离的根本原因。耗尽率随温度降低。图1显示O2溶解度随温度反向增加(比较37℃、15℃和5℃)。还显示了在这三个温度下三个其他氧相关参数的变化。因此假定冷却生物反应器/样品可以类似地帮助防止解离。
用于生物反应器、初级贮藏室和贮藏袋或瓶子的包括细胞冷却的缓和策略如图2所示。
实施例2.具有和不具有收获充氧的两种生物反应器的收获概况
具有和不具有收获充氧的两种生物反应器的收获概况显示在图3中。数据显示收获期间培养物中的低氧事件(接近0％)，符合解离假设。相比之下，显示了用于通过进行如图所示的缓和策略在收获期间保持充氧(在最低点约20％)的培养物的概况。
实施例3.具有和不具有缓和的非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶
图4是用于IgG1单克隆抗体的没有缓和(左面板)和具有缓和(右面板)制备的非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶样品的图示。对于没有缓和而制备的样品，观察到多个条带，表明解离的多肽种类。相反，对于经受图2中所示的缓和策略的样品，检测到没有解离迹象的单个高分子量条带。这些结果表明，包括冷却细胞的缓和策略抑制蛋白质解离。
在单个生长特征(最大活细胞浓度、收获活细胞浓度、IVC、收获时的生存力)和解离之间没有观察到简单的趋势。不存在趋势并不排除生长参数和另一个参数之间相互作用的可能性，这些参数一起趋于解离。
实施例4：氧化还原管理
尽管不希望受理论束缚，但下表表示在本公开的方法和生物反应器中空气流量、氧气流量、气体的氧含量和DOT如何相关。
图5显示了基线上游工艺和采用更高过程控制的溶解氧张力(60％空气饱和度的DOT)、在细胞生长阶段(通常是第6天)之后从36.5℃的控制点到33.0℃的控制点的过程温度变化的优化上游工艺的生产培养物氧化还原电位差概况。另外，从培养的第3天到培养的第10天，间歇地向生产培养物中供给具有高水平的痕量营养素如铜、锰和锌盐的推注进料。在优化的上游工艺的另一个变体中，从培养的第3天连续供给痕量营养素，直到在培养的第15天收获。从第3天开始，增加的促氧化痕量营养素的应用赋予约-50mV的有利氧化还原电位差，其在温度变为33.0℃并且持续应用促氧化剂痕量营养素至约-115mV后进一步改善。基线工艺中生产的产物在基线细胞澄清程序后显示出更大的不稳定行为。然而，用氧化还原电位差优化工艺制备的产物生产对基线细胞澄清程序(其中培养物可以在收获步骤中暴露于低氧或缺氧环境)更具弹性的产物。
使用这些上游工艺制备的产物的不稳定行为是：
-从蛋白A树脂层析中洗脱产物后或在用于病毒灭活的低pH处理后，增加产物片段的丰度。
-暴露于通常用于在制造过程中灭活病毒的低pH值后，增加产物聚集。
虽然在产物的生产期间更氧化的氧化还原电位差的益处是有益的，但是假定在收获步骤和上清液的贮藏期间确保相似氧化的氧化还原电位差可能同样有益。
进一步预期其他促氧化细胞培养营养素和细胞代谢物(例如铁III盐、胱氨酸/半胱氨酸、脱氢抗坏血酸/抗坏血酸和谷胱甘肽/谷胱甘肽SH)可以以与上述实施例中测试的相似的方式表现。
实施例5：温度管理
图6显示了当生产培养物冷却至收获操作之前的温度概况以及按需空气和氧气流量喷射率以满足生产培养物对细胞氧气的摄取。如果喷射率低于工艺特定阈值，则这些喷射率在收获操作期间是固定的。这些固定的喷射率可以是：
-在即将开始冷却培养物之前使用从最小0流量到最大流量是恒定的氧气流量。
-从等于即将开始冷却培养物之前的流量的最小流量到实现氧传质系数(kLa类似于在空气和氧气两者需求流量冷却之前应用的情况)的最大流量的恒定的空气流量。
实施例6：氧气管理
图7a显示了在使用用于澄清细胞培养物的用即可弃的POD深度过滤器从1000L单次使用生物反应器收获期间的生产培养物中的关键工艺参数的实例。在这种情况下，用与应用于生产培养物以满足细胞需氧量相同的搅拌(混合)与曝气混合并曝气生产培养物。如先前在图1中所述，生产培养物的冷却停止了细胞需求。然而，继续应用类似的混合和曝气率确保培养物DOT继续增加至受到喷射气体的富氧比例限制的水平。注意空气将使培养物中的溶解氧饱和至最大100％的空气饱和度。纯氧将使培养物中的溶解氧饱和至最大约500％的空气饱和度。因此，对于任何给定的收获，生产培养物可以用空气或氧气或空气和氧气的混合物曝气。取决于所使用的空气和氧气的比例，培养物中的溶解氧可以是变化的并且特定于特定产物或过程，或用于收获生产培养物的生产设施和设备(例如过滤器类型、过滤器区域、生物反应器和过滤器壳体之间以及过滤器壳体和上清液收集容器(例如收获容器)之间的流动路径)以及设施内使用的前向处理操作模式(例如在纯化过程开始之前保持上清液的持续时间)。尽管在该实施例中描述了顶部空间压力未被使用，但预期容器可以在高于大气压的顶部空间压力下操作。该参数也可以用于增加培养物中溶解氧超过100％空气饱和度。然而，预期培养物在离开生物反应器内的高压环境时会脱气，并且培养物的DOT降低以平衡至新的压力。
图7b显示了在使用用于澄清细胞培养物的用即可弃的POD深度过滤器从50L单次使用生物反应器收获期间的生产培养物中的关键工艺参数的实例。在这种情况下，用与应用于生产培养物相同的搅拌(混合)混合生产培养物。然而，调节曝气率以在即将冷却以准备收获之前实现与生产培养物所需的相似的氧传质系数kLa(h-1)。喷射气体中的氧气的组成也增加到(在该实施例中为40％富集)以实现～200％空气饱和度的最大培养物DOT。
在收获期间生产培养物充氧的另外的特征可以通过在收获进行之前培养物保持在高DOT的持续时间来定义。这可以定义为在达到收获的目标温度<1h内，或者其可以达到收获的目标温度长达24h。
实施例7：生物反应器特征
在1000L cGMP生产培养物的收获期间，喷射的空气和氧气流速取决于操作规模，在这种情况下为1000L SUB。在回顾收获操作的性能后，生产培养物的溶解氧张力(DOT)在收获的后期开始下降，此时约～400L培养物仍保留在SUB内。DOT下降率的推断表明培养物DOT在5分钟期间内降至低氧水平(DOT在0％空气饱和度下)。当不能进一步充氧时，低氧培养物随后进入深度过滤器壳体。因此，预期进入过滤器壳体的细胞培养物和先前从过滤器澄清的早期阶段保留的细胞将变得缺氧。有证据表明，这种细胞培养工艺和产物在收获期间发生缺氧可以导致产物在分析(在使用蛋白A的第一个层析步骤后，通过非还原SDS电泳测定)时表现为“解离”，见图4。
潜在的机制认为是细胞因子的释放，其来自收获操作期间在澄清过滤器中发生的细胞损伤，其催化保持和折叠产物亚基(IgG重链和轻链)的二硫键的还原。这些释放的细胞因子通常在其还原状态下是具有活性的(并且可能对产物有害)。然而，通过收获生产培养物时在生物反应器中以足够的喷射率持续充氧生产培养物，需要提供足够的氧气以带入深层过滤器并进入澄清的上清液中。由澄清的上清液携带的溶解氧阻止细胞因子激活至其活性状态降低，并且从而避免蛋白质二硫键的催化驱动的解离反应。然而，目前没有直接的方法来检测一旦培养操作水平低于生物反应器的培养物的DOT，以及当其停留在POD过滤器壳体中或当澄清的上清液收集在袋中时的培养物的DOT。由于这种限制，应用替代方法，其中喷射的空气和氧气气体以连续的流施加，以确保收获时的培养物从未显示出DOT下降的趋势，这表明培养物的细胞氧摄取率大于生物反应器将氧气转移到细胞培养物中的能力，并且如果氧转移到培养物中和从培养物中溶解氧损失的这种不平衡(由DOT趋势下降表示)继续，则澄清的上清液中可获得的氧气不足以防止细胞因子的激活，并且随后会产生产物解离。
因此提出，增加以较低流速固定的喷射空气和氧气流速。在修订的喷射条件下，喷射气体的氧气成分和体积流量可以使培养物饱和至更高的DOT空气饱和度。此外，总体积喷射气体流速(空气和氧气的组合流量)提供增加的氧传质系数，kLa相当于生产培养物所要求的，在生产培养物进一步冷却以准备收获之前，在至少40％空气饱和度的过程设定点维持培养物DOT。
等同实施方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在由以下权利要求涵盖。
本发明涵盖所有变化、组合和置换，其中来自一个或多个所列权利要求中的一个或多个限制、元素、条款和描述性术语被引入另一个权利要求中。在元素呈现为列表的情况下，例如，以马库什(Markush)组格式或作为替代，元素的每个子组也得以公开，并且可以从组中移除任何元素。
应当理解，一般而言，在本发明或本发明的方面称为包括特定元素和/或特征的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方案由此类元素和/或特征组成或基本上由此类元素和/或特征组成。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在是开放的并且允许包含另外的元素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或从本领域普通技术人员的上下文和理解中以其他方式显而易见，否则表示为范围的值可以假设在本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，至该范围的下限的单位的十分之一。

Claims (95)

1.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
2.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
3.权利要求1或2的方法，其中所述方法进一步包括在从生产培养物中分离细胞期间，建立大于40％至小于500％空气饱和度的范围内的溶解氧张力(DOT)。
4.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
在所述生产阶段的结束时将所述生产培养物冷却至T收获温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从生产培养物中分离细胞和收集上清液，将所述DOT增加至大于40％至小于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属离子选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中通过选自下组的一个或多个动作进一步维持所述DOT：如果激活则抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制碱控制，如果激活则按需抑制CO2气流控制，通过如果激活则抑制进料添加，如果未激活则激活顶部空间压力，以及如果未激活则激活空气/O2的顶部空间流动。
7.生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的方法，所述方法包括：
(i)以从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述方法包括：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度T生产，所述温度T生产是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，其是低于T生产的温度，
从而生产稳定化的产物，例如分离的稳定化的蛋白质，或稳定化的产物例如稳定化的蛋白质的制剂。
8.权利要求7的方法，其中所述方法包括a、b和f。
9.权利要求7的方法，其中所述方法包括a、c和f。
10.权利要求7的方法，其中所述方法包括b和c。
11.权利要求7的方法，其中所述方法包括a、b、c和f。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述生产培养物具有至少10％、至少30％或30％和70％之间空气饱和度的充氧水平。
13.权利要求12的方法，其中所述充氧水平为大于40％至小于或等于70％空气饱和度。
14.权利要求4-13中任一项的方法，其中所述过渡金属是Zn2+、Mn2+和/或Cu2+。
15.权利要求4-14中任一项的方法，其中Zn2+以200至400μM的浓度存在。
16.权利要求4-15中任一项的方法，其中Mn2+以10-100μM的浓度存在。
17.权利要求4-16中任一项的方法，其中Cu2+以10-100μM的浓度存在。
18.权利要求4-17中任一项的方法，其中Zn2+以200至400μM的浓度存在，Mn2+以10-100μM的浓度存在并且Cu2+以10-100μM的浓度存在。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述稳定化的蛋白质包含第N个半胱氨酸残基和第N+1个半胱氨酸残基，其中N＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多，例如N＝1或N＝3。
20.权利要求19的方法，其中，天然形式的所述稳定化的蛋白质包含第N个半胱氨酸残基和第N+1个半胱氨酸残基之间的二硫键。
21.权利要求20的方法，其中：
i)N＝1，并且天然形式的所述多肽包含第一个半胱氨酸残基和第二个半胱氨酸残基之间的二硫键；
ii)N＝3，并且天然形式的所述多肽包含第三个半胱氨酸残基和第四个半胱氨酸残基之间的二硫键；
iii)N＝3，并且天然形式的所述多肽包含第一个半胱氨酸残基和第二个半胱氨酸残基之间的二硫键以及第三个半胱氨酸残基和第四个半胱氨酸残基之间的二硫键。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中按重量计至少80、85、90、95、96、97、98或99％的所述稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质处于预先确定的状态，例如天然构象，例如，如通过大小分离，例如通过凝胶电泳，例如通过非还原性凝胶电泳测定。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述产物是抗体，并且按重量计至少80、85、90、95、96、97、98或99％的所述抗体处于预先确定的状态，例如天然构象，例如，如通过大小分离，例如通过凝胶电泳，例如通过非还原性凝胶电泳测定。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述产物是抗体，并且按重量计至少80、85、90、95、96、97、98或99％的所述抗体是包括各自包含轻链可变区的两条链和各自包含重链可变区的两条链的四聚体。
25.权利要求4-24中任一项的方法，其中T收获足够低以抑制所述二硫键的解离。
26.权利要求4-25中任一项的方法，所述方法包括在T收获下从所述生产培养物中分离所述细胞。
27.权利要求4-26中任一项的方法，其中所述细胞系在第一温度T培养下培养，并且在T收获下收获。
28.权利要求27的方法，其中T收获比T培养低至少19℃至25℃。
29.权利要求4-28中任一项的方法，其中T收获是12℃-18℃，例如15℃。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其中T培养是30℃-38℃。
31.权利要求4-30中任一项的方法，其中在T收获下将所述蛋白质，例如作为所述上清液的组分施加至滤器。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中在生物反应器中培养所述细胞。
33.权利要求32的方法，其中在生产阶段后将所述生物反应器的内容物冷却至T收获。
34.权利要求32的方法，其中通过与包含适于使所述细胞培养物达到T收获的温度的流体例如水的构件例如冷却夹套接触来冷却所述细胞培养物。
35.权利要求32-34的方法，其中所述生物反应器具有1-250毫升、250毫升至50升、50至800升或800-200,000升的体积。
36.权利要求32-35的方法，其中所述生物反应器是单次使用的生物反应器，例如设计以允许细胞培养物的温育和随后进行处置的生物反应器，例如，如本文所述。
37.权利要求32-36的方法，其中所述生物反应器包含生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
38.权利要求32-37的方法，其中所述生物反应器包含用于监测和维持一个或多个参数，例如pH、溶解氧张力(DOT)或温度的工艺和探针。
39.权利要求32-37的方法，其中所述生物反应器是具有至少4000L的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮的自承式生物相容性罐，并且其中所述至少一个顶部叶轮是水翼叶轮，并且其中所述顶部叶轮和所述底部叶轮之间的叶轮间距(Ds)为至少1.229x所述底部叶轮的直径(D底部)并且至多2xD底部，其中所述顶部叶轮上方的液体高度(Do)为至少0.3x所述顶部叶轮的直径(D顶部)并且至多2.5xD顶部，并且其中所述罐底和所述底部叶轮的中心线之间的底部间隙(Dc)为至少0.35xD底部。
40.权利要求32-39的方法，其中所述生物反应器可操作地连接至收获容器。
41.权利要求40的方法，其中所述收获容器配置为包含或提供贮存培养物上方的顶部空间，例如其中所述顶部空间包含气体，例如空气或氧气，或气体的混合物，例如空气或空气和氧气。
42.权利要求41的方法，其中所述收获容器配置为允许通过J形管口收集上清液至所述顶部空间中，使得所述上清液沿着所述收获容器的壁向下移动或倾泻(cascade)。
43.权利要求42的方法，其中将上清液传递至所述顶部空间中的所述收获容器的表面，例如壁上，并沿着所述表面流动，返回至贮存培养物中。
44.权利要求43的方法，其中在所述收获容器中的上清液移动或倾泻导致所述上清液的充氧水平增加。
45.权利要求40-44中任一项的方法，其中通过表面曝气(aeration)将所述收获容器中的所述上清液的DOT维持在大于40％至小于500％空气饱和度的范围内。
46.权利要求40-45中任一项的方法，其中所述收获容器包含冷却装置和机械装置以进一步将所述贮存培养物冷却至5℃至8℃的温度。
47.权利要求40-46中任一项的方法，其中所述收获容器包含能够轴向混合的混合器装置和pH滴定剂添加口。
48.权利要求40-47中任一项的方法，其中所述收获容器包含至少一个顶部空间气体入口和至少一个气体出口。
49.权利要求40-48中任一项的方法，其中所述收获容器进一步包含至少一个空气流控制器和至少一个O2流控制器以提供空气和O2混合物。
50.权利要求40-49中任一项的方法，其中所述收获容器包含检测所述上清液的DOT、氧化还原、温度和pH的传感器。
51.权利要求50的方法，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出用于在分离之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加；以及向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
52.权利要求50的方法，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出用于实现改变向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
53.权利要求40-52中任一项的方法，其中使用抗阻塞的管将所述生物反应器连接至所述收获容器。
54.权利要求53的方法，其中所述抗阻塞的管是编织的。
55.权利要求40-54中任一项的方法，其中所述生物反应器和所述收获容器之间的流动路径包含DOT和氧化还原传感器/探针的安装。
56.权利要求55的方法，其中所述DOT和氧化还原传感器/探针输出用于在收获之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加。
57.权利要求40-56中任一项的方法，其中所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述生物反应器的顶部空间的表面的元件，例如管线(line)或喷嘴。
58.权利要求40-57中任一项的方法，其中所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述生物反应器的顶部空间的表面的第二元件，例如管线或喷嘴。
59.权利要求1-58中任一项的方法，所述方法进一步包括在所述培养物内并且在分离所述蛋白质时监测所述细胞的氧化还原电位，用于维持所述氧化还原电位的目的。
60.权利要求59的方法，其中监测所述氧化还原电位包括使用管线内监测探针，例如如本文所述的Mettler Toledo。
61.权利要求58的方法，其中监测所述氧化还原电位包括评估影响产物稳定性的细胞因素的氧化还原状态，其中所述细胞因素可以损害以下途径的的酶或代谢辅因子：谷胱甘肽/还原的谷胱甘肽途径、硫氧还蛋白/还原的硫氧还蛋白途径，或磷酸戊糖途径(例如谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白、葡萄糖-6-磷酸、NADPH、NADP+、6-膦酰基葡萄糖内酯(6-phosphonoglucolactone)、6-磷酸葡萄糖酸盐或核酮糖-5-磷酸)。
62.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1 SV细胞、DG44 CHO细胞、DUXB11 CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHO FUT8 GS敲除细胞、CHOZN或CHO衍生的细胞；CHO GS敲除细胞(例如GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(Lonza Biologics,Inc.)；CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1 SV(LonzaBiologics,Inc.)。
63.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是CHO-GSKO细胞、CHOXceed细胞CHO GS敲除细胞(例如GS-CHO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(Lonza Biologics,Inc.)；CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1 SV(Lonza Biologics,Inc.)。
64.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述重组宿主细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS例如COS1和COS7、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、PotelligentCHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN，或由其衍生的任何细胞。
65.通过权利要求1-64中任一项的方法生产的稳定化的蛋白质。
66.包含权利要求65的稳定化的蛋白质的药物组合物。
67.权利要求66的药物组合物，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
68.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
69.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
70.权利要求68或69的生物反应器，其中所述生物反应器能够在从生产培养物中分离细胞期间，建立大于40％至小于500％空气饱和度的范围内的溶解氧张力(DOT)。
71.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
在所述生产培养物的指数后生长培养阶段，提供例如建立从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)在大于40％至70％空气饱和度的范围内；
在所述生产阶段的结束时将所述生产培养物冷却至T收获温度，所述T收获温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常培养的温度；
通过将空气或O2气体喷射到所述生产培养物中直至从所述生物反应器中除去所述生产培养物，将所述DOT增加至大于40％至小于500％空气饱和度的范围；和
在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液。
72.权利要求68-71中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器进一步能够在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4 +、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+。
73.权利要求68-72中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器进一步能够通过选自下组的一个或多个动作维持所述DOT：抑制喷射的氮气流，如果激活则按需抑制碱控制，如果激活则按需抑制CO2气流控制，通过如果激活则抑制进料添加，如果未激活则激活顶部空间压力，以及如果未激活则激活顶部空间气流/O2流。
74.能够生产在重组宿主细胞中表达的稳定化的产物，例如稳定化的蛋白质的生物反应器，其中所述生物反应器能够：
(i)以从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差提供例如建立生产培养物，例如指数后生长培养物，所述培养物包含表达所述产物例如蛋白质的重组宿主细胞；
(ii)在生长后培养阶段，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差；和
(iii)在从生产培养物中分离细胞和收集上清液期间，维持从非稳定化的产物到稳定化的产物的-50mV至-300mV的范围内的氧化还原电位差，其中在没有喷射的情况下或在足够少的喷射，使得所述喷射不实质上改变所述生产培养物和所述上清液中的氧化还原电位的情况下实施从生产培养物中分离细胞和收集上清液，
其中所述生物反应器进一步能够：
a.在指数生长阶段已经发生后将所述生产培养物冷却至30℃至33℃的温度，所述温度是下述温度，其低于所述细胞系进行了培养或通常进行培养的温度；
b.给所述生产培养物充氧，至从所述生产阶段的开始到所述生产阶段的结束的溶解氧张力(DOT)大于40％至小于或等于70％空气饱和度；
c.在所述生产培养物中或向所述生产培养物提供例如添加过渡金属，其中所述过渡金属选自Zn2+、Mn4+、Cu2+、Fe3+、Co2+、Cr3+和/或Ni2+；
d.向所述生产培养物提供例如添加脱氢抗坏血酸或抗坏血酸，或脱氢抗坏血酸或抗坏血酸改性组分；
e.向所述生产培养物提供例如添加谷胱甘肽，例如氧化和/或还原的谷胱甘肽，或谷胱甘肽改性组分；或
f.将用于从生产培养物中分离细胞和收集上清液的所述生产培养物冷却至12℃-18℃的温度T收获，所述温度低于T生产。
75.权利要求74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、b和f。
76.权利要求74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、c和f。
77.权利要求74的生物反应器，其中所述生物反应器能够b和c。
78.权利要求74的生物反应器，其中所述生物反应器能够a、b、c和f。
79.权利要求68-77中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器可操作地连接至收获容器。
80.权利要求79的生物反应器，其中所述收获容器配置为包含或提供所述贮存培养物上方的顶部空间，例如其中所述顶部空间包含气体，例如空气或氧气，或气体的混合物，例如空气或空气和氧气。
81.权利要求80的生物反应器，其中所述生物反应器配置为允许培养物循环进入所述顶部空间中，使得所述培养物沿着所述收获容器的壁向下移动或倾泻。
82.权利要求81的生物反应器，其中将来自贮存培养物的培养物传递至所述顶部空间中的所述生物反应器的表面，例如壁上，并沿着所述表面流动，返回至所述贮存培养物中。
83.权利要求82的生物反应器，其中移动或倾泻导致所述培养物中充氧水平增加。
84.权利要求79-83中任一项的生物反应器，其中所述收获容器能够通过表面曝气将所述贮存培养物的DOT维持在大于40％至小于500％空气饱和度的范围。
85.权利要求79-84中任一项的生物反应器，其中所述收获容器包含一个或多个选自下组的组分：冷却装置和机械装置以进一步将所述贮存培养物冷却至5℃至8℃的温度；能够轴向混合的混合器装置和pH滴定剂添加口；至少一个顶部空间气体入口和至少一个气体出口；至少一个空气流控制器和至少一个O2流控制器以提供空气和O2混合；以及检测所述上清液的DOT、氧化还原、温度和pH的传感器。
86.权利要求85的生物反应器，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出能够在分离之前实现改变喷射率、顶部空间和向所述生物反应器生产培养物中的进料或补充添加；以及向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
87.权利要求85的生物反应器，其中所述DOT、氧化还原、温度和pH传感器输出能够实现向所述收获容器中pH滴定剂的添加。
88.权利要求79-87中任一项的生物反应器，其中使用抗阻塞的管将所述生物反应器连接至所述收获容器。
89.权利要求88的生物反应器，其中所述抗阻塞的管是编织的。
90.权利要求79-88中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器和所述收获容器之间的流动路径包含DOT和氧化还原传感器/探针的安装。
91.权利要求79-90中任一项的生物反应器，所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述收获容器的顶部空间的表面的元件，例如管线或喷嘴。
92.权利要求79-91中任一项的生物反应器，所述生物反应器包含配置以将培养物递送至限定所述收获容器的顶部空间的表面的第二元件，例如管线或喷嘴。
93.权利要求68-92中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器是单次使用的生物反应器，例如设计以允许细胞培养物的温育和随后进行处置的生物反应器，例如，如本文所述。
94.权利要求68-93中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器包含生物过程容器、壳体、至少一个搅拌器、至少一个喷射器、至少一个用于所述喷射器和顶部空间覆盖物的气体过滤器入口、至少一个装料口、至少一个收获口、至少一个样品口以及至少一个探针。
95.权利要求68-92中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器是具有至少4000L的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮的自承式生物相容性罐，并且其中所述至少一个顶部叶轮是水翼叶轮，并且其中所述顶部叶轮和所述底部叶轮之间的叶轮间距(Ds)为至少1.229x所述底部叶轮的直径(D底部)并且至多2xD底部，其中所述顶部叶轮上方的液体高度(Do)为至少0.3x所述顶部叶轮的直径(D顶部)并且至多2.5xD顶部，并且其中所述罐底和所述底部叶轮的中心线之间的底部间隙(Dc)至少为0.35xD底部。
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