CN109496235A - 用于改进高粱的遗传转化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于转化高粱以及产生遗传修饰的高粱的改进的方法。特别地，描述了用于产生高质量、可转化的高粱植物细胞的方法和手段，所述高粱植物细胞在培养物中维持较长持续时间而不丧失其再生潜力和用于遗传转化的用途。所述方法还描述了使用改进的培养基从转化的植物细胞有效再生植物，从而提供高粱的稳定转化频率的显著改进。

Description

用于改进高粱的遗传转化的方法

相关申请数据

本申请要求2016年6月10日提交的澳大利亚临时申请No.2016902278的优先权，该临时申请的全部内容以引用方式并入本文。

发明领域

本公开涉及高粱的有效植物再生和遗传转化的方法。

发明背景

高粱是一种重要的谷类作物，可种植用于多种用途，诸如食品、草料、饲料和生物能源。高粱是一种多功能作物，能够在广泛的温度和气候条件下生长，并且相对于其他谷类作物相对耐受干旱和土壤毒性。随着市场寻找合适的无麸质替代谷物来迎合患有麸质敏感的消费者例如像患有乳糜泻的消费者，越来越多地利用高粱谷物作为粮食并且对其的关注也日益增加。

随着从高粱中鉴定出更多的基因和调控元件，以及代谢组学和基因组学取得的进步，将遗传工程应用于高粱的有益生产和利用的可能性也在增加(Venkatesh等人，2015)。然而，从历史上看，高粱一直被认为是一种难以进行组织培养和转化的作物(Grootboom等人，2010)，原因诸如细胞培养中酚类化合物的积累(Gurel等人，2009)、模型基因型的缺乏、低再生频率和传代培养所带来的再生潜力的丧失(Visarada和Kishore，2015)。因此，对于高粱而言仍然难以实现高效和全面的转化***(Liu等人，2015)，由此限制了这种重要作物的遗传工程的潜力。

粒子轰击和农杆菌介导的转化是一直以来用于产生转基因植物(包括高粱)的两种主要方法。Casas等人(1993)报告了首次成功的高粱遗传转化，方式为使用未成熟胚胎作为植物组织进行粒子轰击，以实现每个轰击胚胎0.08％转化体的转化频率。此后报告了对该方法的若干修改，包括优化组织培养条件和其他参数(Able等人，2001；Tadesee等人，2003；Masheswari等人，2010)，使转化效率在每个胚胎1％-7％的范围内。Liu和Godwin(2012)报告了对先前发表的方法的进一步显著改进，方式为使用高粱品种TX430的未成熟胚胎和优化的培养基组成。Zhao等人(2000)报告了首次成功的农杆菌介导的高粱转化。

自此首次报告以来，已发表了许多针对农杆菌介导的高粱转化的修改和改良方案，包括Howe等人(2006)和Shridhar等人(2010)的报告，其中转化频率分别达到每个胚胎4.5％和4.28％。最近，Wu等人(2014)报告了使用具有超双元载体的未成熟胚胎(Ishida等人，1996)和改良的培养基，改进了农杆菌介导的高粱转化的频率。然而，由于组织培养方法的最优化似乎已经趋于稳定，因此研究人员现在转向不依赖于组织培养的高粱转化替代方法，例如，如Li等人(2016)中所述的。即使做出了这些广泛的最优化努力且有了改进的转化报告，高粱在转化频率方面仍然落后于其他谷类，并且仍然被认为是一种难以改造的难以转化的植物。Visarada和Kishore(2015)回顾了这一领域并得出结论，对于高粱而言，细胞转化然后再生仍然非常复杂。

在用于通过粒子轰击或农杆菌方法成功遗传转化高粱的不同组织外植体中，相对于源自成熟种子的外植体(例如茎尖)和迄今为止报告的已使用未成熟胚胎的所有更有效的转化方案，未成熟胚胎是外植体的选择(Liu等人，2012和2014；Wu等人，2014)。Zhao等人(2000)也以统计学方式表明，胚胎来源对高粱转化效率具有非常显著的影响。

需要效率提高的用于转化高粱植物的进一步的方法，以及可用于提高高粱转化效率的进一步的组织外植体和培养基。

发明内容

本发明部分地基于发明人的认识，即从来自高粱的分离的未成熟胚胎诱导的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织可以提供灵活的用于转化高粱的外植体选择，所述外植体不依赖于环境因素，并且可用于提高转化效率。

因此，在一个实例中，本公开提供了用于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的方法，所述方法包括将来自高粱的分离的未成熟胚胎(IE)在愈伤组织诱导培养基(CIM)中在足以从所述IE产生DEC组织的时间内和条件下培养，其中所述CIM包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少氧化褐变的剂。

在一个实例中，IE源自双色高粱(Sorghum bicolor)的栽培品种。例如，IE可以源自双色高粱的甜高粱栽培品种。例如，IE可以源自粒用高粱栽培品种。在一个实例中，IE可以源自选自由以下组成的组的高粱品系：IEsCS3541、M91051、SRN39、Shanqui red、IS8260、IS4225、Tx430、P898012、P954035和PP290。在一个实例中，IE可以源自称为Tx430的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为IEsCS3541的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为M91051的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为SRN39的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为Shanqui red的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为IS8260的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为IS4225的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为P898012的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为P954035的高粱品系。在一个实例中，IE可以源自称为PP290的高粱品系。

在一个实例中，CIM包含选自由以下组成的组的一种或多种减少氧化褐变的剂：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸(2-aminoidan-2-phosphonic acid)、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷(phenoxane)、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭。

在一个实例中，一种或多种减少氧化褐变的剂以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的浓度存在于CIM中。

在一个实例中，CIM包含选自由以下组成的组的一种或多种生长素：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式。

在一个实例中，一种或多种生长素以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、或约0.5mg/L至约1mg/L的浓度存在于CIM中。

在一个实例中，一种或多种细胞***素是选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)。

在一个实例中，一种或多种细胞***素以约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的浓度存在于CIM中。

在一个实例中，一种或多种生长素和一种或多种细胞***素以相对于彼此足以从IE产生和/或维持DEC的量存在于CIM中。

在一个实例中，一种或多种生长素和一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于CIM中。

在一个优选实例中，CIM包含硫辛酸，例如α-硫辛酸。在特别优选的实例中，CIM包含浓度为约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的硫辛酸。例如，CIM包含浓度为约1mg/L的硫辛酸。

在一个实例中，CIM包含蛋白胨。例如，CIM可包含浓度为约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L的蛋白胨。在一个实例中，CIM包含浓度为约1mg/L的硫辛酸，例如α-硫辛酸。

在一个实例中，CIM包含铜。例如，当存在铜时，铜可以硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜的形式提供。例如，当存在铜时，铜以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的浓度存在。在一个实例中，铜以硫酸铜的形式提供，浓度为约0.8mg/L。

在一个实例中，CIM包含渗透剂。

在一个实例中，所述方法包括在昏暗光条件下培养IE，持续足以产生DEC组织的一段时间。例如，IE的培养可以在光强度为约10μmol s^-1m^-2至约55μmol s^-1m^-2、或约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2的昏暗光条件下进行。

优选地，光是白光，即以对应于白光光谱的一个或多个波长发射的光。

在一个实例中，所述方法包括其中以约12h至约20h、约14h至约18h、或约16h的光周期培养IE。优选地，光周期为16h。

在一个实例中，足以产生DEC组织的时间为至少约2至约6周、约3至约5周、或约4周。

在一个实例中，所述方法包括至少一个传代培养步骤，包括将DEC组织转移至新鲜CIM并在新鲜CIM中培养DEC组织。

根据包含至少一个传代培养步骤的实例，所述至少一个传代培养步骤包括在与用于产生DEC组织的条件基本上相同的条件下在新鲜CIM中培养转移的DEC组织。

在一个实例中，所述方法包括每2至4周重复传代培养步骤以维持DEC组织。

在一个实例中，所述方法包括重复传代培养步骤，以便从自IE产生DEC组织时起将DEC组织维持至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和/或长达12个月。

在另一个实例中，所述方法产生至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％的自未成熟胚胎的愈伤组织诱导频率。

本公开还提供了一种产生遗传修饰的高粱细胞的方法，所述方法包括将一种或多种核酸引入高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织中。

在一个实例中，所述方法具有至少40％或至少45％、或约40％至约50％的平均转化频率。转化频率是指每DEC组织中再生的转化植物的数量，以百分比表示。

本公开还提供了一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)通过将一种或多种核酸引入高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织中，产生遗传修饰的高粱细胞，优选地粒用高粱细胞；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的一个或多个DEC组织，使得所述培养诱导从所述一个或多个DEC组织形成芽，从而产生一个或多个遗传修饰的芽；

(c)从步骤(b)的所述遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

本公开还提供了一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分，优选地粒用高粱植物或其部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)将一种或多种核酸引入高粱组织群体中；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的高粱组织，使得所述培养以每100个已引入所述一种或多种核酸的高粱组织至少35个遗传修饰的芽的效率诱导从所述高粱组织形成芽，从而产生遗传修饰的芽；以及

(c)从步骤(b)的所述遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

在产生遗传修饰的高粱细胞的方法的一个实例中，所述一种或多种核酸中的至少一种包含选择性标记基因，并且步骤(b)包括选择已引入选择性标记基因的一个或多个组织。

在一个实例中，通过细菌介导的转化、微粒介导的转化、电穿孔、显微注射、聚乙二醇(PEG)诱导的融合或脂质体介导的转移，将一种或多种核酸引入一个或多个高粱组织中。

在一个实例中，用于细菌介导的转化的细菌是选自由以下组成的组：农杆菌属种(Agrobacterium sp.)、根瘤菌属种(Rhizobium sp.)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium loti)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、假结核耶尔森氏菌(Yersiniapseudotuberculosis)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。

在一个实例中，通过农杆菌介导的转化将核酸引入DEC组织中。

在一个实例中，通过微粒介导的转化将核酸引入DEC组织中。

在一个实例中，核酸包含编码选择性标记的多核苷酸，并且一个或多个选择步骤包括基于选择性标记的表达的检测选择转化的DEC组织。

在一个实例中，选择性标记是可由转化体表达的荧光或生物发光标记，并且一个或多个选择步骤包括选择表达荧光标记或生物发光标记的转化的DEC组织或由其生长的植物组织。

在一个实例中，荧光标记或生物发光标记是选自以下的表达形式：绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、Renilla GFP、MonsterGFP、paGFP、Kaede蛋白、藻胆蛋白、荧光素酶、或这些物质中任一者的生物活性变体或片段。

在一个实例中，所述一种或多种核酸中的一种包含赋予转化体抗生素抗性的编码选择性标记的多核苷酸，并且一个或多个选择步骤包括在对应的抗生素存在下培养转化的DEC组织或由其生长的植物组织。例如，编码选择性标记的多核苷酸赋予针对潮霉素、草铵膦、卡那霉素或草胺膦的抗生素抗性。

在一个实例中，核酸包含赋予转化体除草剂抗性的编码选择性标记的多核苷酸，并且一个或多个选择步骤包括在对应的除草剂存在下培养转化的DEC组织或由其生长的植物组织。例如，编码选择性标记的多核苷酸赋予针对草甘膦、草铵膦或双丙氨膦的除草剂抗性。

在一个实例中，核酸包含编码阳性选择性标记的多核苷酸，所述多核苷酸在代谢物存在下赋予转化体选择性优势例如生长优势，并且一个或多个选择步骤包括在对应的阳性选择性标记代谢物存在下培养转化的DEC组织或由其生长的植物组织。例如，在代谢物存在下赋予转化体选择性生长优势的编码选择性标记的多核苷酸是海藻糖酶(trehelase)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因或磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因。

在一个实例中，用于在步骤(b)中培养一个或多个高粱组织的所述培养基或所述一系列培养基中的至少一种培养基包含如本文所定义的CIM。

在一个实例中，产生遗传修饰的高粱植物的方法的步骤(b)包括在昏暗光条件下在所述一系列培养基中的一种或多种培养基上培养一个或多个高粱组织，然后在强度大于昏暗光条件的光条件下在所述一系列培养基中的一种或多种另外的培养基上培养一个或多个高粱组织。

在一个实例中，昏暗光条件的特征在于光强度为约10μmol s^-1m^-2至约55μmol s^{- 1}m^-2、约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2。在优选的实例中，昏暗光条件包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光。

在一个实例中，强度大于昏暗光条件的光条件的特征在于光强度为约55μmol s^{- 1}m^-2至约90μmol s^-1m^-2、约60μmol s^-1m^-2至约85μmol s^-1m^-2、或约65μmol s^-1m^-2至约80μmols^-1m^-2。

根据昏暗光条件包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光的实例，在另外的培养基上培养一个或多个组织是在强度为约65μmol s^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的白光下进行。

在一个实例中，所述方法的步骤(b)中的培养以约12h至约20h、约14h至约18h、或约16h的光周期进行。优选地，所述方法的步骤(b)中的培养以16h的光周期进行。

在一个实例中，在所述培养基上或在所述一系列培养基中的每种培养基上培养一个或多个高粱组织独立地进行约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或约6周。

在一个实例中，产生遗传修饰的高粱植物的方法还包括在引入一种或多种核酸后将一个或多个高粱组织各自分成两个或更多个部分。

在一个实例中，所述方法的步骤(b)中的所述一系列培养基中的一种或多种培养基包含L-半胱氨酸和/或抗坏血酸。在一个实例中，CIM包含L-半胱氨酸和/或抗坏血酸。

还提供了一种产生遗传修饰的高粱植物，优选地粒用高粱植物的方法，其中获得了至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％的遗传修饰效率，其中遗传修饰效率表示为步骤(b)中产生的遗传修饰的芽的数量与步骤(a)中使用的DEC组织或高粱组织的数量的百分比。例如，产生遗传修饰的高粱植物的方法是如上所述的方法。

在一个实例中，产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法还包括：

(i)获得一个或多个高粱DEC组织；

(ii)获得通过本公开的方法产生的一个或多个DEC组织；或者

(iii)通过实施本公开的方法产生一个或多个高粱DEC组织。

本公开还提供了一种产生遗传修饰的高粱植物，优选地粒用高粱植物的子代的方法，所述方法包括自交或杂交使用本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物，从而产生子代植物。

在一个实例中，产生遗传修饰的高粱植物的子代的方法还包括

(i)筛选子代植物是否存在遗传修饰或由遗传修饰赋予的表型；以及

(ii)选择包含遗传修饰和/或显示由遗传修饰赋予的表型的子代植物，从而产生一种或多种遗传修饰的高粱植物。

本公开还提供了一种使用本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物、子代或其部分，优选地粒用高粱植物、子代或宏量营养素、微量营养素、维生素、氨基酸或氮补充剂的来源、碳源、不确定的有机补充剂和固化剂其部分，其中所述高粱植物、子代或其部分包含通过所述方法引入的遗传修饰。例如，其部分是高粱的器官、组织或细胞，它们包含遗传修饰。在优选的实例中，植物部分是选自由以下组成的组：种子、叶和茎。

本公开还提供了一种适用于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的培养基，所述培养基包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少氧化褐变的剂，其中所述一种或多种减少氧化褐变的剂以足以防止或减少高粱组织氧化褐变的浓度存在于培养基中；并且其中所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以相对于彼此足以在培养期间从IE产生DEC的量存在于培养基中。

在一个实例中，一种或多种减少氧化褐变的剂是选自由以下组成的组：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷(phenoxane)、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭。优选地，减少氧化褐变的剂是硫辛酸，例如α-硫辛酸。

在一个实例中，一种或多种减少氧化褐变的剂以约0.1mg/L至约10mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的浓度存在。优选地，一种或多种减少氧化褐变的剂以约1mg/L的浓度存在。

在一个实例中，一种或多种生长素是选自由以下组成的组：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式。优选地，生长素是2,4-D。

在一个实例中，一种或多种生长素以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L或约1mg/L的浓度存在。优选地，一种或多种生长素以约1mg/L的浓度存在。

在一个实例中，一种或多种细胞***素是选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)。在优选的实例中，细胞***素是BAP。

在一个实例中，一种或多种细胞***素以约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的浓度存在。优选地，一种或多种细胞***素以约0.5mg/L的浓度存在。

在一个实例中，一种或多种生长素和一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于培养基中。

在一个实例中，减少氧化褐变的剂是硫辛酸，例如α-硫辛酸，并且硫辛酸以约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的浓度存在于培养基中。优选地，硫辛酸，例如α-硫辛酸，以约1mg/L的浓度存在于培养基中。

在一个实例中，培养基包含蛋白胨。例如，肽的浓度为约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L。在一个实例中，蛋白胨以约0.8g/L的浓度存在于培养基中。

在一个实例中，培养基包含铜源。例如，培养基包含硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜。

在一个实例中，培养基包含浓度为约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的铜。

在一个实例中，培养基包含渗透剂。

在一个实例中，培养基包含固化剂，例如琼脂。

在一个实例中，基础培养基是MS培养基。

在一个实例中，适用于生产高粱的DEC组织的培养基包含浓度为约4g/L至约5g/L的MS培养基、浓度为约1mg/L的2,4-D、浓度约为0.5mg/L的BAP以及浓度约为1mg/L的硫辛酸。此外，培养基可包含浓度为约0.5g/L至约1g/L的L-脯氨酸、浓度为约0.5g/L至约1g/L的蛋白胨、浓度为约100mg/L至约200mg/L的肌醇、浓度为约0.5g/L至约1g/L的硫酸铜、浓度为约10g/L至约50g/L的麦芽糖以及浓度为约6g/L至约12g/L的琼脂中的一者或多者或全部。

在一个实例中，培养基具有适于产生DEC组织的pH。例如，培养基的pH为约pH 5.0至约pH 6.0。

还提供了当在例如本文所述的方法中用于制备高粱的DEC组织的如本文所述的培养基。

本公开还提供了一种高粱分化胚胎发生愈伤(DEC)组织，所述组织能够以至少35％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少40％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少45％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少50％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少55％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少60％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少65％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少70％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少75％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少80％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少85％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少90％的效率进行遗传修饰。

在一个实例中，其中遗传修饰效率是通过根据本文公开的方法执行产生遗传修饰的高粱植物的方法使用DEC组织并计算遗传修饰的效率来确定的。

在一个实例中，在适于产生如本文所公开的DEC细胞的培养基中产生和/或提供DEC组织。

除非另外明确指出，否则本文中的任何实施方案应当加以必要的变更以便应用于任何其他实施方案。

本发明在范围上不受本文所述具体实施方案或实例的限制，这些实施方案或实例仅旨在用于举例证明。功能上等效的产物、组合物以及方法明显在如本文所述的本发明范围内。

在本说明书通篇中，除非另外明确指出或上下文另外要求，否则对单个步骤、单个物质组合物、成组步骤或成组物质组合物的提及应当理解为涵盖那些步骤、物质组合物、成组步骤或成组物质组合物中的一者和多者(即一者或多者)。

本发明在下文中借助于以下非限制性实施例来描述。

附图说明

图1.自高粱未成熟胚胎的DEC组织产生和植物再生：(A)从胚胎萌生愈伤组织(3周龄)；(C)具有结节状结构的胚胎发生愈伤组织(～8周龄)；(B)&(D)分别在含和不含LA的SIM和SRM中的芽诱导。

图2.从自不同年龄愈伤组织系再生的植物和WT高粱幼苗的叶组织提取的核的直方图：(A)来自3周龄植物的WT叶组织；(B)CL9：24个月；(C)CL10：12月龄；(D-E)CL-11和CL12，6月龄；(F)CL13，5月龄的DEC组织。

图3.用于轰击高粱DEC组织的质粒的示意图。(A)pUbi-BAR；和(B)pBSV003。

图4.示出切割被轰击DEC组织以及在选择培养基中培养被轰击DEC组织的方法的流程图。

图5.随机选择的品系中的NptII转基因的PCR检测。泳道从左到右为：“M”＝1kb加DNA梯状条带；泳道2-18＝转基因品系，“P”＝质粒DNA；“WT”＝WT TX430DNA；且“NC”＝水对照组。

图6.转基因高粱植物的选择和再生：(A)CIM+G25上的非转化(对照)愈伤组织；(B)CIM+G25上的转化愈伤组织；(C-D)从转化愈伤组织再生芽；以及(E)PCR确认植物生长室中存在转基因植物。

图7.通过微滴数字PCR分析的在31个独立T0转基因植物中Npt-II基因的拷贝数。

具体实施方式

一般技术和定义

除非另外明确定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语都应当被视为具有与本领域(例如，细胞培养领域、植物转化领域、分子遗传学领域、蛋白质化学领域和生物化学领域)普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

除非另外指出，否则本发明中使用的重组蛋白、细胞培养物和免疫学技术是本领域技术人员所熟知的标准程序。这些技术在诸如以下来源的整个文献中有所说明和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984)；J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989)；T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach,第1卷和第2卷,IRL Press(1991)；D.M.Glover and B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995和1996)；以及F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associatesand Wiley-Interscience(1988，包括到目前为止的所有更新)。

术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应当理解为意味着“X和Y”或者“X或Y”，并且应当用来对这两种含义或对任一种含义提供明确的支持。

除非相反指出，否则如本文所用的术语约是指指定值的+/-10％、更优选+/-5％、更有选+/-1％。

在本说明书通篇中，词语“包括(comprise)”或者其变型形式诸如“包含(comprises)”或“含有(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的要素、整体或步骤，或者成组的要素、整体或步骤，但并不排除任何其他的要素、整体或步骤，或者成组的要素、整体或步骤。

本公开总体上涉及高粱，并且尤其包括用于遗传修饰高粱的方法和材料。如本文所用，术语“高粱”是指许多种类的一年生禾本科牧草的一个属，叶宽，茎高而精干，在密集的末簇中结出谷粒。预期本文所公开的方法、组织和培养基可用于任何高粱物种，包括但不限于双色高粱、石茅高粱(Sorghum halepense)、黑高粱(Sorghum almum)、苏丹高粱(Sorghum sudanense)和拟高梁(Sorghum propinquum)。双色高粱是初级栽培的高粱物种，并且包括许多已认可的不同类型，包括粒用高粱、甜高粱、草高粱和帚高粱，所有这些都是根据本教导所预期的。根据一个具体实施方案，高粱是粒用高粱或甜高粱。此外，预期本文所公开的方法、组织和培养基可用于任何高粱品系或品种，包括但不限于公共品系诸如CS3541、M91051、SRN39、Shanqui red、IS8260、IS4225、Tx430、P898012、P954035和PP290。

产生高粱的DEC组织的方法

如本文所讨论的，到目前为止，未成熟胚胎已成为用于转化高粱的外植体的选择。以未成熟胚胎作为外植体阻碍高粱转化效率的因素之一是在组织培养中快速产生酚类化合物。直接使用未成熟胚胎作为外植体的另一个缺点是需要继续种植原种植物以确保未成熟胚胎的持续供应，这很难实现因为开花仅持续几天，因此所提供的收集最适当胚胎的窗口很小。除了劳动力和***成本之外，供体植物的生理条件将影响胚胎的质量，胚胎的质量可以影响自转化细胞的愈伤组织萌生频率。本公开部分地基于发明人的认识，即从来自高粱的分离的未成熟胚胎诱导的高粱分化胚胎发生愈伤(DEC)组织提供了更灵活的用于转化高粱的外植体选择，特别是当DEC组织不依赖于环境因素时。如本文所述，发明人已经表明，当用作转化高粱的外植体时，DEC组织相对于未成熟胚胎可以实现改善的转化效率。

因此，在一个实例中，本公开涉及一种用于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的方法。如本文所用，术语“分化胚胎发生愈伤组织”或“DEC组织”应当被认为是指包含维持胚胎发生和器官发生潜力的分化细胞的结节状结构的组织。“分化胚胎发生愈伤组织”或“DEC组织”可包含由愈伤组织细胞、形成结节状结构和颗粒状结构的细胞、位于愈伤组织(为未分化细胞)与结节状结构之间某处发育途径上的中间细胞和/或早期(球形)体细胞胚胎组成的细胞群体。如本文所用，“维持胚胎发生潜力”的细胞应理解为意指能够经历胚胎发生过程的细胞，所述胚胎发生过程是芽和根以协同方式(不是顺序地)一起发育的过程，无论是从体细胞发育还是从配子发育。如本文所用，“维持器官发生潜力”的细胞应理解为意指能够经历器官发生过程的细胞，所述器官发生过程是芽和根顺序地从分生组织中心发育的过程。“器官发生”过程应理解为包括一系列将发育中的植物的未分化细胞转化为完整器官(即，芽、叶、根等)的有组织的整合过程。器官形成区域的细胞经历差异发育以形成器官原基。器官发生一直持续到器官的确定特征得以实现。

在一个实例中，产生DEC组织的方法包括将获自高粱的分离的未成熟胚胎(IE)在愈伤组织诱导培养基(CIM)中在足以从所述IE产生DEC组织的时间内和条件下培养，其中所述CIM包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少例如高粱组织氧化褐变的剂。在一个实例中，基础培养基是MS培养基。

如本文所用，术语“未成熟胚胎”或“IE”或其变型形式是指未成熟种子的胚胎即高粱的胚胎，这种胚胎在授粉后成熟但是还不能发芽成高粱植物，并且包括处于早期发育的胚胎，即前子叶胚胎；和处于中期发育的胚胎，即具有尚未完全发育的子叶或下胚轴的胚胎。

如本文所用，术语“减少氧化褐变的剂”或类似术语应理解为意指这样的化合物：相对于在不存在所述化合物的情况下由于高粱组织产生酚类化合物而原本将在培养物中发生的高粱组织的氧化褐变的水平，所述化合物防止、抑制或以其他方式降低培养物中高粱组织的氧化褐变的水平。抑制植物组织的氧化褐变并且适用于本公开的方法和培养基的化合物将是本领域技术人员已知的并且在本文中描述。例如，一种或多种减少氧化褐变的剂可以是选自由以下组成的组：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷(phenoxane)、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭。在优选的实例中，CIM包含硫辛酸，例如α-硫辛酸，作为减少高粱组织的氧化褐变的剂。

优选地，CIM将包含一种或多种减少氧化褐变的剂，其量足以相对于在不存在化合物的情况下原本将在培养物中发生的高粱组织的氧化褐变的水平，将培养物中高粱组织的氧化褐变的水平降低例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％。在一个实例中，一种或多种减少氧化褐变的剂以足以基本上抑制或防止培养物中高粱组织的氧化褐变的量存在。例如，CIM可包含浓度为约0.1mg/L至约5mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的一种或多种减少高粱组织的氧化褐变的剂。在一个实例中，CIM可包含浓度为约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的一种或多种减少高粱组织的氧化褐变的剂。在一个实例中，CIM包含浓度为约0.5mg/L至约2.0mg/L，例如浓度为约1mg/L的硫辛酸，例如α-硫辛酸。

如本文所用，术语“生长素”是指一类植物生长调节化合物，这些化合物刺激细胞伸长和***、血管组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生，并且(在高浓度下)诱导去分化(愈伤组织形成)。用于本公开的方法和培养基的合适的生长素将是本领域技术人员已知的并且在本文中描述。例如，合适的生长素可以是选自由以下组成的组：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式。

优选地，CIM将包含足以诱导和/或刺激细胞分化，同时维持高粱组织的胚胎发生和器官发生潜力的量的一种或多种生长素。例如，CIM可包含浓度为约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、或约0.5mg/L至约1mg/L的生长素。在一个实例中，CIM包含浓度为约1mg/L的2,4-D。

本文所用的术语“细胞***素”是指一类刺激细胞***、子叶扩张和侧芽生长的植物生长调节化合物。它们延迟了离脱叶的衰老，并且与生长素(本文所述)组合可以影响根和芽的形成。用于本公开的方法和培养基的合适的细胞***素将是本领域技术人员已知的并且在本文中描述。例如，包含在CIM中的合适的细胞***素可选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)。

优选地，CIM将包含足以诱导和/或刺激高粱组织的细胞***的量的一种或多种细胞***素。例如，CIM可包含浓度为约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的一种或多种细胞***素。在一个实例中，CIM包含浓度为约0.5mg/L的BAP。

本领域技术人员将理解，“愈伤组织诱导培养基”或“CIM”由此被配制成包含生长素和细胞***素，其相对量足以诱导和刺激维持胚胎发生和器官发生潜力的分化细胞的结节状结构的生长，但不允许高粱组织大量分化成有组织的结构。在一个实例中，一种或多种生长素和一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于CIM中。

可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM的特别优选的实例包含与实施例1的表1中描述的CIM基本上相同浓度的生长素、细胞***素和用于减少氧化褐变的剂。另选地或除此之外，可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM包含与实施例1的表1中描述的CIM相同的生长素、细胞***素和用于减少氧化褐变的剂。在实施例1的表1中描述了可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM的特别优选的实例。因此，可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM可包含如表1中所述的CIM的用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素，任选地其中用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素中的任何一种或多种以与表1中描述的CIM相同的浓度存在。可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM可还包含表1中描述的CIM的一种或多种或全部其他成分，任选地具有与表1中描述的CIM相同的浓度。

在一个实例中，CIM包含浓度为约0.5mg/L的BAP、浓度为约1mg/L的2,4-D和浓度为约1mg/L的硫辛酸例如α-硫辛酸。

如在本公开的方法中使用的CIM可包含一种或多种已知可用于植物组织培养的其他成分，包括宏量营养素、微量营养素、维生素、氨基酸或氮补充剂的来源、碳源、不确定的有机补充剂和固化剂。在一个实例中，本公开的CIM(除生长素、细胞***素和用于减少氧化褐变的剂以外)包含蛋白胨、铜源、渗透剂和/或固化剂。

例如，蛋白胨可以作为氮、维生素和/或氨基酸的来源包含在CIM中。在一个实例中，蛋白胨以约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L的浓度包含在本公开的CIM中。在一个实例中，蛋白胨以约0.8g/L的浓度存在于CIM中。

在植物中激活某些酶途径，例如像参与木质素合成的那些途径需要铜。光合作用、植物呼吸也需要铜，并且铜有助于碳水化合物和蛋白质的植物代谢。因此，在一个实例中，在本公开的方法中使用的CIM可包含铜源。例如，CIM可包含呈硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜形式的铜。铜可以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的浓度存在于CIM中。

CIM可包含渗透剂。用于植物细胞培养的合适的渗透剂在本领域中是已知的并且预期用于本文所述的CIM。例如，包含在本公开的CIM中的渗透剂可选自肌醇、蔗糖、甘露糖醇、甘油、山梨糖醇和麦芽糖。

可用于植物细胞培养基的固化剂在本领域中是已知的，例如琼脂，并且也预期用于本文所述的CIM。

在实施例1的表1中描述了可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM的特别优选的实例。因此，可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM可包含如表1中所述的CIM的用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素，任选地其中用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素中的任何一种或多种以与表1中描述的CIM相同的浓度存在。可用于在本公开的方法中产生DEC组织的CIM可还包含表1中描述的CIM的一种或多种或全部其他成分，任选地具有与表1中描述的CIM相同的浓度。

在一个实例中，如本文所述的产生DEC组织的方法包括在昏暗光条件下在CIM中培养从高粱获得的IE，持续足以从IE产生DEC组织的一段时间。如本文所用，术语“昏暗光条件”是指包括以约10μmol m^-2s^-1至约55μmol m^-2s^-1的强度照射的光例如白光的条件。

根据一个实例，本公开的方法包括在光强度为约10μmol s^-1m^-2至约55μmol s^-1m^-2、或约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2的昏暗光条件下培养IE。在一个特定实例中，用于培养IE并由此产生DEC组织的昏暗光条件包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光。

如本文所述，预期从高粱获得的IE的培养进行足以从IE产生DEC组织的时间量。技术人员将理解，植物或植物组织，特别是绿色组织的生长将受光周期以及培养时期(如果是组织)的影响。如本文所用，术语“光周期”应理解为意指植物或组织例如高粱植物或组织在24小时时期内接收的光照持续时间。

在每个前述实例中，预期在昏暗光条件下的培养可以约12h至约20h、约14h至约18h、或约14h至约16h的光周期进行。例如，在昏暗光条件下的培养可以约12h、约14h、约16h、约18h、或约20h的光周期进行。在优选的实例中，根据本公开方法的在昏暗光条件下的培养以约14h至约16h，例如16h的光周期进行。根据本文的任何实例，足以从IE产生DEC组织的时间可为约2至约6周、约3至约5周、或约4周。

一旦通过本文描述的方法获得DEC组织，预期可以进行一个或多个传代培养步骤以便维持新鲜的高粱DEC组织群体。通过执行传代培养步骤维持一个或多个DEC组织群体的一个优点是可以持续供应新鲜的DEC组织，包括在一年中难以从开花高粱植物获得未成熟胚胎的时间也是如此。

因此，如本文所述的产生DEC组织的方法可包括一个或多个传代培养步骤。如本文所用，术语“传代培养”是指将一部分组织或细胞从现有培养物转移至含有新鲜培养基的新培养容器并恢复组织或细胞培养的过程。每轮传代培养可以称为细胞或组织的“传代”。因此，当已对细胞或组织进行传代培养时，它们也可以被称为已经传代。

根据本文所述的方法，一个或多个传代培养步骤可包括将通过本文所述方法获得的DEC组织转移至包含新鲜CIM的不同培养容器，并将传代培养物暴露于与用于从IE产生DEC的条件基本上相同的条件。根据一个实例，每2至4周进行传代培养步骤以维持DEC组织。例如，可大约每2周对DEC组织进行传代培养。例如，可大约每3周对DEC组织进行传代培养。例如，可大约每4周对DEC组织进行传代培养。根据产生DEC组织的方法包括一个或多个传代培养步骤的前述实例中的任一个实例，可以重复传代培养步骤以便从自IE产生DEC组织时起将DEC组织维持至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和/或长达12个月。就这一点而言，本公开的方法的优点在于通过进行传代培养可以将产生的DEC组织维持长达6个月或大于6个月。

遗传修饰高粱的方法

如本文所述，当用作转化高粱的外植体时，相对于使用未成熟胚胎作为转化的外植体组织时实现的转化效率，本公开的DEC组织可以实现改善的转化效率。

因此，本公开的另一方面涉及一种产生遗传修饰的高粱细胞的方法，所述方法包括将一种或多种核酸引入高粱的DEC组织的细胞中。

本公开还涉及一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)对如本文所述的一个或多个DEC组织执行产生遗传修饰的高粱细胞的方法；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的一个或多个DEC组织，使得所述培养诱导从所述一个或多个DEC组织形成芽，从而产生一个或多个遗传修饰的芽；

(c)从步骤(b)的所述遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

本公开还涉及一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)将一种或多种核酸引入高粱组织群体中；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的高粱组织，使得所述培养以每100个已引入所述一种或多种核酸的高粱组织至少35个遗传修饰的芽的效率诱导从所述高粱组织形成芽，从而产生遗传修饰的芽；以及

(c)从步骤(b)的所述遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少40个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少45个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少50个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少55个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少60个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少65个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少70个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少75个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少80个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少85个遗传修饰的芽的效率。在一个实例中，实现了每100个已引入一种或多种核酸的高粱组织至少90个遗传修饰的芽的效率。

如本文在如本文所述的高粱细胞、组织、芽或植物的上下文中使用的术语“遗传修饰的”是指遗传物质即DNA已通过例如DNA添加、DNA缺失或DNA取代而改变的高粱细胞、组织、芽或植物。在一些实例中，已根据本文所述的方法“进行遗传修饰”的高粱细胞、组织、芽或植物被修饰为含有在野生型高粱植物、品种或栽培品种中发现的基因(或其部分)，例如像是来自良种品系或遗传上不同的群体的有利基因变体。在另一个实例中，已根据本文所述的方法“进行遗传修饰”的高粱细胞、组织、芽或植物被修饰为含有在野生型高粱植物、品种或栽培品种中未发现的基因构建体(“转基因”)或其他异源多核苷酸。通过引入转基因或异源多核苷酸而“进行遗传修饰”的高粱细胞、组织或植物可称为“转基因的”。如本文提及的“转基因”具有生物技术领域的通常含义，并且包括已通过重组DNA或RNA技术产生或改变并已引入细胞中的基因序列。

在本公开的遗传修饰的植物的上下文中，术语“再生部分”是指能够生成高粱植物的生殖部分，例如像种子或胚胎。如本文所用，术语“种子”是指植物的“成熟种子”，其要么很快就可以收获要么已从植物收获，诸如通常在田间以商业方式收获，或作为植物中受精之后种子休眠建立之前以及收获之前的“发育中的种子”收获。

如在核酸的上下文中使用的术语“引入”是指将核酸呈递给高粱DEC组织或高粱组织，使得核酸进入DEC组织或高粱组织中的细胞的内部。当使用本公开的方法引入多于一种核酸时，这些核酸可以作为单个核酸构建体的一部分组装，或作为单独的核酸组装，并且可以位于相同或不同的转化载体上。因此，可以在单个转化事件中，在多个独立的转化事件中，或例如作为育种方案的一部分将多种核酸引入DEC组织。

如本文所用的术语“转化”是指将核酸引入DEC组织或其他高粱组织外植体的细胞中。细胞的转化可能是稳定的或瞬时的。

可以通过本领域已知的任何方法将一种或多种核酸引入DEC组织或其他高粱组织外植体的细胞中。已经描述了四种将核酸直接递送到细胞中的通用方法：(1)化学方法(Graham等人，1973)；(2)物理方法，诸如显微注射(Capecchi，1980)；电穿孔(参见，例如，WO87/06614、US 5,472,869、US 5,384,253、WO 92/09696和WO 93/21335)；和基因枪(参见，例如，US 4,945,050和US 5,141,131)；(3)病毒载体(Clapp，1993；Lu等人，1993；Eglitis等人，1988)；以及(4)受体介导的机制(Curiel等人，1992；Wagner等人，1992)。

可以使用的加速方法包括例如微粒轰击等。将一种或多种核酸递送至DEC组织细胞或其他高粱组织外植体细胞的方法的一个实例是微粒轰击。该方法已由Yang等人，Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)综述。非生物粒子(微粒)可以用核酸涂覆并通过推进力递送到细胞中。示例性粒子包括由钨、金、铂等组成的粒子。除了是可重复转化单子叶植物的有效方法之外，微粒轰击的一个独特优点是既不需要分离原生质体，也不需要农杆菌感染的易感性。通过加速将DNA递送到玉米(Zea mays)细胞中的方法的例示性实施方案是基因枪α-粒子递送***，该***可用于将涂覆有DNA的粒子通过筛网诸如不锈钢或Nytex筛网推进到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的过滤器表面上。适用于本发明的粒子递送***是氦加速PDS-1000/He枪，该枪可从Bio-Rad Laboratories获得。

对于轰击，可将悬浮细胞浓缩在过滤器上。将含有待轰击的细胞的过滤器定位在微粒停止板下方适当的距离处。如果需要，将一个或多个筛网也定位在枪与待轰击的细胞之间。

或者，可将高粱DEC组织或其他高粱组织外植体排列在固体培养基上。将待轰击的细胞定位在微粒停止板下方适当的距离处。如果需要，将一个或多个筛网也定位在加速装置与待轰击的细胞之间。通过使用本文所述的技术，可以获得多达1000个或更多个瞬时表达标记基因的细胞灶。在轰击后48小时表达外源基因产物的灶中的细胞数量通常为一至十个，平均为一至三个。

在轰击转化中，可以优化轰击前培养条件和轰击参数以产生最大数量的稳定转化体。在这项技术中轰击的物理参数和生物参数都很重要。物理因素是涉及操纵DNA/微粒沉淀物或影响大弹或微粒的飞行和速度的物理因素。生物因素包括涉及轰击前和轰击后即刻细胞操纵的所有步骤；靶细胞的渗透调节，目的是帮助减轻与轰击相关的创伤；以及转化DNA，诸如线性化DNA或完整超螺旋质粒的性质。

在另一个替代实例中，可以稳定地转化质体。公开用于高等植物中的质体转化的方法包括粒子枪递送含有选择性标记的DNA且通过同源重组将DNA靶向质体基因组(U.S.5,451,513、U.S.5,545,818、U.S.5,877,402、U.S.5,932479和WO 99/05265)。

因此，预期人们可能希望在小规模研究中调整轰击参数的各个方面以全面优化条件。人们可能特别希望调整物理参数诸如间隙距离、飞行距离、组织距离和氦压。还可以通过改变影响受体细胞的生理状态并因此影响转化和整合效率的条件来最小化创伤减少因素。例如，可调整受体细胞的渗透状态、组织水合作用以及传代培养阶段或细胞周期以进行最佳转化。根据本公开，本领域技术人员将知晓其他常规调整的执行。

农杆菌介导的转移是可广泛用于将核酸引入植物细胞的***，因为DNA可以被引入整个植物组织，由此避免了从原生质体再生完整植物的需要。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞在本领域中是众所周知的(参见，例如，US 5,177,010、US 5,104,310、US 5,004,863、US 5,159,135)。此外，T-DNA的整合是一个相对精确的过程，只会产生很少的重排。待转移的DNA的区域由边界序列限定，并且介入DNA通常***植物基因组中。

现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制，从而允许如(Klee等人，Plant DNA Infectious Agents,Hohn and Schell,编辑,Springer-Verlag,New York,第179-203(1985)页所述进行便利操纵。此外，在用于农杆菌介导的基因转移的载体方面的技术进步已经改进了基因和限制性位点在载体中的排列，以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有与启动子和多聚腺苷酸化位点侧面连接的用于直接表达***的多肽编码基因的便捷多接头区域，并且这些载体适用于本发明目的。此外，含有带甲和卸甲(armed and disarmed)Ti基因的农杆菌可用于转化。

使用农杆菌转化方法形成的遗传修饰的植物或组织通常在一条染色体上含有单个遗传基因座。这种转基因植物可被称为对于添加的核酸而言是半合子的。更优选的是对于添加的核酸是纯合的遗传修饰的植物；即，一个核酸在染色体对的各染色体的相同基因座上。纯合的遗传修饰植物可以通过有***配(自交)含有单个添加的核酸的独立的分离遗传修饰植物，使产生的一些种子发芽并分析所得植物的目标核酸来获得。

在优选的实例中，使用本公开的方法引入DEC组织或高粱组织的一种或多种核酸被稳定地引入。

如本文在引入高粱细胞的核酸的上下文中所用的术语“稳定地引入”或“被稳定地引入”旨在表示引入的核酸稳定地掺入高粱细胞的基因组中，并且因此细胞用核酸稳定转化。如本文所用，术语“稳定转化”或“稳定地转化”是指将核酸引入细胞并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸能够被其子代遗传，更具体地，被多代连续的子代遗传。如本文所提及的，术语“基因组”包括核和质体基因组，并因此包括将核酸整合到例如叶绿体基因组中。如本文所用的稳定转化还可以指在染色体外，例如作为微染色体维持的核酸。

自DEC组织或其他高粱外植体产生的，基因组中已使用本公开的方法引入核酸的遗传修饰的高粱植物，可以被称为“种系稳定转化的高粱植物”。

如本文所用的“核酸”应理解为意指多核苷酸，例如像DNA、RNA或寡核苷酸。引入DEC组织或高粱组织的一种或多种核酸可以存在于能够指导高粱植物中核酸的特定多核苷酸序列的表达的一种或多种核酸构建体诸如表达盒中，并且通常包含与多核苷酸序列可操作地连接的启动子和/或由其编码的蛋白质或多肽的正确表达和翻译所需的一种或多种其他调控元件。

优选地，引入DEC组织或高粱组织的一种或多种核酸可包含至少一种目标基因。目标基因可以增加或降低遗传修饰的高粱植物或组织或其再生部分中蛋白质的内源活性水平，或者可以将新的蛋白质引入高粱植物、组织或其再生部分。例如，目标基因可编码蛋白质或功能性多核苷酸，其增加收率；赋予增强的动物和/或人营养；赋予除草剂耐受性(例如草甘膦抗性或草铵膦抗性)；影响碳水化合物生物合成或修饰(例如淀粉分支酶、淀粉脱支酶、淀粉合成酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)；参与脂肪酸生物合成或修饰(例如去饱和酶、延长酶、羟化酶、环氧酶、结合酶、乙酰基转移酶、TAG组件)；赋予昆虫抗性(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的晶体毒素蛋白)；赋予病毒抗性(例如病毒外壳蛋白)；赋予真菌抗性(例如几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、家蚕抗菌肽相关肽或植物抗毒素)；改变蔗糖代谢(例如转化酶或蔗糖合酶)；赋予降低的变应原性；增加消化率；赋予环境胁迫耐受性；赋予线虫抗性；是编码药物(例如抗生素、抗体、次级代谢物、药物肽或疫苗)的基因；是编码工业酶的基因；或增加高粱植物或其部分作为生物燃料的用途。

在另一个实例中，预期所述方法包括至少引入一种或多种核酸，其中所述至少两种核酸是与用于诱导靶向遗传改变的成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas***相关的基因座。

通过共同递送表达Cas内切核酸酶的质粒和必需的crRNA组分，CRISPR***可以携带至植物细胞。Cas内切核酸酶可以转变为切口酶，以提供对DNA修复机制的额外控制(Cong等人，2013)。

CRISPR基因座是一类独特的散布短序列重复序列(SSR)，最初识别于大肠杆菌(Ishino等人，1987；Nakata等人，1989)。在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鱼腥藻(Anabaena)和肺结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)中已识别出类似的散布SSR(Groenen等人，1993；Hoe等人，1999；Masepohl等人，1996；Mojica等人，1995)。

CRISPR基因座与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，这种结构被称为短规律间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人，2002；Mojica等人，2000)。重复序列是以簇形式出现的短元件，它们总是由具有恒定长度的独特介入序列规律地间隔开(Mojica等人，2000)。虽然在菌株之间重复序列是高度保守的，但散布重复序列的数量和间隔区的序列因菌株而异(van Embden等人，2000)。

在Jansen等人(2002)中，CRISPR基因座的共同结构特征被描述为(i)存在多个短直接重复序列，这些短直接重复序列在给定基因座内几乎未显示出序列变异；(ii)在类似大小的重复序列之间存在非重复间隔序列；(iii)在包含多个CRISPR基因座的大多数物种中存在几百个碱基对的共同前导序列；(iv)基因座内不存在长开放阅读框架；以及(v)存在一个或多个cas基因。

CRISPR通常是24-40bp的短部分回文序列，含有长达11bp的内部和末端反向重复序列。虽然已经检测到分离的元件，但它们通常以重复单元的簇(每个基因组最多约20个或更多个)排列，所述重复单元由独特的20-58bp介入序列间隔开。CRISPR在给定的基因组内通常是同源的，其中大多数是相同的。然而，在例如Archaea(Mojica等人，2000)中存在异质性的实例。

如本文所用，术语“cas基因”是指通常与侧翼CRISPR基因座偶联缔合或靠近其或在其附近的一个或多个cas基因。Haft等人(2005)中提供了对Cas蛋白的全面综述。给定CRISPR基因座处的cas基因的数量在物种之间可以是变化的。

因此，预期使用本公开的方法将CRISPR***的基因座转化为DEC组织或高粱组织的实施方案使得能够对高粱植物进行CRISPR介导的基因编辑。

为了便于鉴定或选择转化体，一种或多种核酸可以理想地包含“选择性标记基因”。因此，如本文所述的产生遗传修饰的高粱细胞或植物的方法可包括选择已用一种或多种核酸转化的组织或植物。

如本文所述，选择性标记基因可包含在具有目标基因的核酸构建体内。然而，这些不必提供在相同的核酸构建体中，并且选择性标记基因可以与包含目标基因的核酸例如单独的核酸构建体分开提供。

“选择性标记基因”是指赋予表达标记基因的细胞或组织不同的表型并由此使得可以将此类转化的细胞或组织与不具有标记的细胞或组织区分开的基因。选择性标记基因赋予一种可以基于其进行“选择”的性状。例如，选择性标记基因可以赋予对选择剂(例如，除草剂、抗生素、辐射、热或其他对未转化细胞有害的处理)的抗性。根据一种或多种核酸包含赋予对选择剂的抗性的选择性标记基因的实例，所述方法包括将已引入所述一种或多种核酸的DEC组织或高粱组织(或源自此的高粱植物)暴露于对应的选择剂。

另选地或除此之外，一种或多种核酸可包含在特定代谢物存在下赋予转化体生长优势的选择性标记基因(例如，海藻糖酶基因、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因或磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因)。根据一种或多种核酸包含在特定代谢物存在下赋予转化体生长优势的选择性标记基因的实例，所述方法包括在对应的代谢物存在下培养已引入所述一种或多种核酸的DEC组织或高粱组织。

另选地，选择性标记基因可以是“可筛选的标记基因”(或报告基因)，所述基因赋予通过观察或测试即通过“筛选”可识别的性状(例如，β-葡萄糖醛酸酶活性、荧光素酶活性、GFP活性或在未转化细胞中不存在的其他酶活性)。根据一种或多种核酸包含可筛选的标记基因的实例，所述方法包括培养已引入所述一种或多种核酸的DEC组织或高粱组织并选择表达所述可筛选的标记基因的组织，或由其产生的高粱植物。

如本文所述，标记基因和目标基因不必在相同的核酸构建体中连接或提供。此外，标记的实际选择并不重要，只要它结合本公开方法中使用的DEC组织或高粱组织起作用(即，是选择性的)即可。本文提供了对示例性选择性标记基因的进一步描述。

在一个实例中，适用于本文所述方法的选择性标记可以是荧光标记或生物发光标记。荧光标记或生物发光标记的实例包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、t-dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白、藻胆蛋白、荧光素酶、或这些物质中任一者的生物活性变体或片段。

荧光蛋白的一个非常著名的实例包括来自水母维多利亚水母(Aequoreavictoria)的绿色荧光蛋白和由分子生物学应用例如诱变和嵌合蛋白技术(Tsien，1998)产生的许多其他变体(GFP)。GFP基于其发色团的独特组分进行分类，每个类具有不同的激发和发射波长：第1类，中性酚和阴离子酚盐的野生型混合物；第2类，酚盐阴离子；第3类，中性酚；第4类，具有堆叠的s-电子***的阴离子；第5类，吲哚；第6类，咪唑；以及第7类，苯基。

已知并从许多发光生物体中分离了发光***，这些发光生物体包括细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼类、多足类、蝇、真菌、蠕虫、甲壳类动物和甲虫，特别是Pyrophorus属的叩头虫以及Photinus属、妖扫萤属(Photuris)和熠萤属(Luciola)的萤火虫。显示生物发光的其他生物体列于WO 00/024878、WO 99/049019和Viviani(2002)中。

一个众所周知的实例是称为萤光素酶的蛋白质类，它们催化产生能量的化学反应，其中特定的生物化学物质荧光素(一种天然存在的荧光团)被具有荧光素酶活性的酶氧化(Hastings，1996年)。多种多样的生物体(原生生物和真核生物皆有)，包括细菌、藻类、真菌、昆虫、鱼类和其他海洋形态的物种，可以这种方式发出光能，并且各自都具有特定的荧光素酶活性和化学性质不同于其他生物体的荧光素。荧光素/荧光素酶***在形式、化学和功能方面非常多样化。因此，具有荧光素酶活性的生物发光蛋白可以从各种来源或通过各种方式获得。具有荧光素酶活性的生物发光蛋白的实例可以在U.S.5,229,285、5,219,737、5,843,746、5,196,524和5,670,356中找到。最广泛使用的两种萤光素酶是：(i)海肾萤光素酶(Renilla luciferase)(来自海肾(R.reniformis))，35kDa蛋白质，其使用腔肠素作为底物并发射480nm的光(Lorenz等人，1991)；和(ii)萤火虫荧光素酶(来自北美萤火虫(Photinus pyralis))，61kDa蛋白质，其使用荧光素作为底物并发射560nm的光(de Wet等人，1987)。

Gaussia荧光素酶(来自Gaussia princeps)已用于生物化学测定(Verhaegen等人，2002)。Gaussia荧光素酶是20kDa蛋白质，其在快速反应中氧化腔肠素，导致在470nm的亮光发射。

可用于本公开的方法的萤光素酶还被表征为来自Anachnocampa属种(WO 2007/019634)。这些酶的大小为约59kDa，并且是ATP依赖性的萤光素酶，催化具有在光谱的蓝色部分内的发射光谱的发光反应。

可以使用天然存在的萤光素酶的生物活性变体，诸如海肾荧光素酶变体RLuc8(Leoning等人，2006)。

可用于本文所述方法的替代的非荧光素酶生物发光蛋白是可作用于合适的底物以产生发光信号的任何酶。这些酶的具体实例是β-半乳糖苷酶、内酰胺酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶和β-葡萄糖苷酶。这些酶的合成发光底物是本领域熟知的，并且可从诸如Tropix Inc.(Bedford,MA,USA)的公司商购获得。Hushpulian等人(2007)描述了过氧化物酶的实例。

优选地，荧光标记或生物发光标记是从植物细胞分泌的形式。如果在植物细胞中表达时不能固有地分泌，则可能需要进行多达两次修饰以确保分泌，即添加N末端信号序列以将蛋白质靶向内质网(ER)中和/或通常在C-末端添加信号以确保蛋白质不保留在ER中。

N末端信号序列是本领熟知的，并且包括但不限于病毒包膜糖蛋白信号区段、Nicotiana nectarin信号肽(US 5,939,288)、烟草伸展蛋白信号、大豆油质蛋白油体结合蛋白信号、拟南芥(Arabidopsis thaliana)液泡碱性几丁质酶信号肽和伴大豆球蛋白分泌肽。

就确保蛋白质未保留在ER中而言，每个荧光标记或生物发光标记将具有在ER中分泌一次的自身倾向。例如，GFP保留在细胞中。在标记保留在ER中的情况下，可通过标准技术，诸如通过在C末端添加3至10个或约4个甘氨酸进行操纵以确保标记被分泌。

例如，GFP通常保留在植物细胞中，但可通过以下方式使其分泌：在N末端添加伴大豆球蛋白分泌肽，在C末端添加4个甘氨酸以确保GFP分泌到质外体(Nishizawa等人，2003)。

根据选择性标记基因编码生物发光蛋白的实例，合适的底物是需要的。可以在其中一个培养步骤期间将底物提供给植物组织，但是至少在分析细胞和/或组织以确定细胞和/或组织是否已被转化时，底物是必需的。

底物的选择可以影响由生物发光蛋白产生的光的波长和强度。

众所周知的底物是腔肠素，其出现在刺胞动物、桡足动物、毛颚类动物、栉水母类动物、十足目虾、糠虾、放射虫和一些鱼类中(Greer和Szalay，2002)。例如，对于海肾荧光素酶，可以使用腔肠素类似物/衍生物，其导致418与512nm之间的光发射(Inouye等人，1997)。已描述了对于海肾荧光素酶，腔肠素类似物/衍生物(400A，DeepBlueC)发射出400nm的光(WO 01/46691)。腔肠素类似物/衍生物的其他实例是EnduRen和ViviRen。

另一类荧光素是在生物体中发现的能够生物发光的一类发光生物色素，这些发光生物色素在酶荧光素酶存在下被氧化产生氧化荧光素和光形式能量。荧光素，或2-(6-羟基苯并噻唑-2-基)-2-噻唑啉-4-羧酸最初是从萤火虫北美萤火虫中分离出来的。从那以后，从各种不同的生物体中已经发现了各种形式的荧光素并进行了研究，这些生物体主要来自海洋，例如是鱼类和鱿鱼；然而，许多荧光素发现于陆地栖息生物体，例如蠕虫、甲虫和其他各种昆虫(Day等人，2004；Viviani，2002)。

存在至少五种一般类型的荧光素，它们各自在化学上不同并且由化学上和结构上不同的萤光素酶使用多种不同的辅因子催化。第一类是萤火虫荧光素，即萤火虫荧光素酶的底物，其需要ATP进行催化(EC 1.13.12.7)。第二类是细菌荧光素，其也存在于一些鱿鱼和鱼类中，由长链醛和还原的磷酸核黄素组成。细菌荧光素酶是FMNH依赖性的。第三类是沟鞭藻荧光素，这是在沟鞭藻(海洋浮游生物)中发现的四吡咯叶绿素衍生物，沟鞭藻这种生物体是夜间海洋磷光的原因。沟鞭藻荧光素酶催化沟鞭藻荧光素的氧化，并由三种相同的且具有催化活性的结构域组成。第四类是咪唑并吡嗪介形虫萤光素(vargulin)，其存在于某些介形虫和深海鱼类例如光蟾鱼(Porichthys)中。最后一类是腔肠素(coelanterazine)(一种咪唑并吡嗪)，其是存在于放射虫、栉水母类动物、刺胞动物、鱿鱼、桡足动物、毛颚类动物、鱼和虾中的蛋白质水母发光蛋白的发光体。

细菌选择性标记的实例是赋予抗生素抗性诸如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素、四环素或卡那霉素抗性的标记。用于选择植物转化体的示例性选择性标记包括但不限于编码潮霉素B抗性的hyg基因；赋予卡那霉素、巴龙霉素、G418抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因；赋予谷胱甘肽来源的除草剂抗性的来自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因，例如如EP256223中所述；过表达时赋予谷氨酰胺合成酶抑制剂诸如草胺膦抗性的谷氨酰胺合成酶基因，例如如WO 87/05327中所述；赋予选择剂草胺膦抗性的来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰转移酶基因，例如如EP 275957中所述；赋予N-膦酰基甲基甘氨酸耐受性的编码5-烯醇莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，例如由Hinchee等人(1988)所述；赋予双丙氨膦抗性的bar基因，例如如WO91/02071中所述；赋予溴苯腈抗性的来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因，诸如bxn(Stalker等人，1988)；赋予甲氨蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等人，1988)；赋予咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制性化学品抗性的突变型乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP 154,204)；赋予5-甲基色氨酸抗性的突变型邻氨基苯甲酸合酶基因；或赋予除草剂抗性的茅草枯脱卤素酶基因。

除草剂选择性标记的实例是本领域已知的并在本文中描述。除草剂选择性标记的具体实例包括赋予对草甘膦、草铵膦或双丙氨膦的除草剂抗性的那些基因标记。

在特定代谢物存在下赋予转化体选择性优势的选择性标记的实例包括海藻糖-6-磷酸合酶(AtTPS1)基因、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因和磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因。在一个实例中，用于本公开的方法的核酸包含编码PMI的选择性标记基因，所述选择性基因赋予代谢甘露糖的能力(美国专利No.5,767,378和5,994,629，其以引用方式并入本文)。用PMI基因转化的植物细胞可以通过在仅含甘露糖或甘露糖加蔗糖的培养基上生长来选择。

一种或多种核酸可以一起或单独地提供在一种或多种表达载体中。如本文所用，表达载体是能够转化宿主细胞并实现一种或多种指定多核苷酸分子的表达的DNA载体。用于本公开的方法的优选表达载体可以指导植物细胞，特别是高粱细胞中的基因表达。可用于本公开的方法的表达载体含有调控序列，诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与高粱组织相容并控制引入高粱组织的一种或多种核酸的表达的其他调控序列。特别地，可用于本发明的多核苷酸或载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸、及终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，诸如启动子和增强子序列。合适的转录控制序列包括可以在本公开的转化的高粱细胞中起作用的任何转录控制序列。通常，所用调控序列的选择取决于靶生物体诸如植物和/或靶器官或目标组织。此类调控序列可以从任何真核生物诸如植物或植物病毒获得，或者可以通过化学方式合成。用于高粱的各种此类转录控制序列是本领域技术人员已知的。特别优选的转录控制序列是有效指导植物中的转录的启动子，可以是组成型或阶段性和/或组织特异性的，这取决于使用的是植物或其部分。

许多适用于稳定转染植物细胞或建立转基因植物的载体已描述于例如Pouwels等人，Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,增补1987；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989；和Gelvin等人，PlantMolecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990中。通常，植物表达载体包括，例如在5’和3’调控序列的转录控制下的一种或多种克隆的植物基因和显性选择性标记。此类植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，控制组成型或诱导型的、环境或发育调控的或细胞或组织特异性表达的调控区)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。

如本文所述，产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法包括这样的步骤：在培养基或一系列培养基上培养已引入一种或多种核酸的一个或多个DEC组织或一个或多个高粱组织，使得所述培养诱导从所述一个或多个DEC组织形成芽，从而产生一个或多个遗传修饰的芽。通常，从转化的植物外植体再生芽包括以一系列步骤在一系列培养基上培养组织外植体，其中所述一系列培养基中的每种培养基包含足以实现该步骤的目的(例如芽诱出和伸长、芽生长及生根)的量的植物细胞生长调节化合物。因此，本公开的方法预期在一系列培养基上培养已引入一种或多种核酸的一个或多个组织，以产生一个或多个遗传修饰的芽，包括产生具有根的芽。

在一个实例中，用于培养一个或多个组织并由此产生遗传修饰的芽的系列培养基中的至少一种培养基可以是如本文在产生DEC组织的上下文中所述的愈伤组织诱导培养基(CIM)。例如，可使用CIM培养基在一个或多个组织转化期间以及引入一种或多种核酸之后的休止期期间培养所述一个或多个组织。根据包括对转化组织的选择的方法的实施方案，可以在所需的时间将选择剂添加至CIM。另选地，可以将一个或多个组织转移至包含选择剂的新鲜CIM并培养足够的时间以允许选择一个或多个转化的组织，即一个或多个遗传修饰的组织。

在实施例4的表6中描述了可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的CIM的特别优选的实例。因此，可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的CIM可包含如表6中所述的CIM的用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素，任选地其中用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素中的任何一种或多种以与表6中描述的CIM相同的浓度存在。可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的CIM可还包含表6中描述的CIM的一种或多种或全部其他成分，任选地具有与表6中描述的CIM相同的浓度。

用于在本公开的方法中培养一个或多个组织的一系列培养基还可包含适于诱导嫩芽形成的培养基，即芽诱导培养基(SIM)。因此，本公开的方法可包括将一个或多个遗传修饰的组织从CIM转移至SIM，并培养足够长的一段时间以诱导从一个或多个组织生长出嫩芽。在一个实例中，SIM具有基本上类似于本文所述的CIM的配方，不同之处在于生长素和细胞***素将以足以诱导和/或刺激从一个或多个转化组织生长出嫩芽的相对量存在。例如，相对于CIM中存在的浓度，SIM可包含较低浓度的生长素和较高浓度的细胞***素。在一个实例中，SIM包含浓度为约1.0mg/L的BAP、浓度为约0.5mg/L的2,4-D和浓度为约1mg/L的硫辛酸例如α-硫辛酸。在实施例4的表6中描述了可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的SIM的特别优选的实例。因此，可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的SIM可包含如表6中所述的SIM的用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素，任选地其中用于减少氧化褐变的剂、生长素和细胞***素中的任何一种或多种以与表6中描述的SIM相同的浓度存在。可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的CIM可还包含表6中描述的SIM的一种或多种或全部其他成分，任选地具有与表6中描述的SIM相同的浓度。

用于在本公开的方法中培养一个或多个组织的一系列培养基还可包含适于诱导芽的生长/再生的培养基，即芽再生培养基(SRM)。因此，处于SIM中足够长的时间之后，所述方法可包括将一个或多个遗传修饰的组织从SIM转移至SRM，并培养组织足够长的一段时间以使芽伸长和生长。这可能涉及从已转化的组织外植体切除发育中的芽，并将发育中的芽转移至SRM以便于生长/伸长。在一个实例中，SRM具有基本上类似于SIM的配方，不同之处在于相对于培养基中细胞***素的量，生长素不存在或以非常低的量存在。还可能期望SRM相对于SIM包含更高浓度的细胞***素以刺激芽生长和伸长。在一个实例中，SRM可包含浓度为约1.0mg/L的BAP，和浓度为约1mg/L的硫辛酸例如α-硫辛酸，以及任选的浓度为0.5mg/L的另外的细胞***素化合物诸如TDZ。在实施例4的表6中描述了可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的SRM的特别优选的实例。因此，可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的SRM可包含如表6中所述的用于减少氧化褐变的剂和细胞***素，任选地其中用于减少氧化褐变的剂和细胞***素中的任何一种或多种以与表6中描述的SRM相同的浓度存在。可用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的CRM可还包含表6中描述的SRM的一种或多种或全部其他成分，任选地具有与表6中描述的SIM相同的浓度。

处于SRM中足够长的时间之后，可以将遗传修饰的芽转移至生根培养基(在本文实施例中描述为根诱导培养基(RIM))，以诱导从芽生长出根。这可能涉及从组织外植体切除发育的芽并将发育的芽转移至RIM以便于根诱导和生长。优选地，生根培养基含有如本领域已知的根诱导激素。一旦芽发出根，就可称其为苗。

所述方法还可包括另外的任选步骤：使遗传修饰的苗经历足以使苗硬化的环境条件。如本文所用，术语“硬化(harden)”或“硬化(hardening)”或类似形式是指使苗准备经历正常生长环境例如像土壤的过程。

当使用一系列培养基培养一个或多个组织时，可以根据需要重复本文所述的任何一个或多个培养步骤，方式是例如将所述一个或多个组织从相应培养基转移至包含相同类型的新鲜培养基的培养容器。

根据使用CIM在本公开方法中培养一个或多个组织的任何实例，CIM还可包含抗坏血酸和/或L-半胱氨酸。例如，CIM可包含抗坏血酸。例如，CIM可包含L-半胱氨酸。例如，CIM可包含抗坏血酸和L-半胱氨酸。如在实施例5和其表7中所证明的，向CIM添加抗坏血酸和/或L-半胱氨酸提高了转化效率。

在实施例4的表6中提供了用于根据本文公开的方法产生遗传修饰的芽的示例性培养基。就这一点而言，预期用于在本公开的方法中产生遗传修饰的高粱植物的一系列培养基包含实施例4的表6中描述的一种或多种或所有培养基。然而，本领域技术人员将理解，可以在不显著改变所述方法的结果的情况下对那些培养基的某些成分做出改变。

在每个前述实例中，产生遗传修饰的高粱植物的方法可包括在昏暗光条件下在所述一系列培养基中的一种或多种培养基上培养一个或多个高粱组织，然后在强度大于昏暗光条件的光条件下在所述一系列培养基中的一种或多种另外的培养基上培养所述一个或多个高粱组织。例如，所述方法可包括在昏暗光条件下在CIM中培养一个或多个组织，然后在强度大于昏暗光条件的光条件下在本文所述的CIM、SIM和/或SRM中的中的任何一者或多者中培养一个或多个组织。昏暗光条件可具有约10μmol s^-1m^-2至约55μmol s^-1m^-2、或约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2的光强度。在一个优选的实例中，昏暗光条件包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光。强度大于昏暗光条件的光条件可具有约55μmol s^-1m^-2至约90μmol s^-1m^-2、约60μmol s^-1m^-2至约85μmol s^-1m^-2、或约65μmol s^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的光强度。根据昏暗光条件包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光的实例，一个或多个组织的后续培养是在强度为约65μmol s^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的白光下进行。

在每个前述实施例中，预期在相应光条件下的一个或多个组织的培养以约12h至约20h、约14h至约18h、或约14h至约16h的光周期进行。例如，在相应光条件下的一个或多个组织的培养可以约12h、约14h、约16h、约18h或约20h的光周期进行。在优选的实例中，组织的培养以约14h至约16h例如16h的光周期进行。

根据本文的任何实例，在所述培养基上或在所述一系列培养基中的每种培养基上培养一个或多个高粱组织独立地进行约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或约6周。本领域技术人员将理解，在所述培养基或每种培养基中培养的长度可以根据光周期和要实现的高粱芽的长度而变化。

在一个特定实例中，产生遗传修饰的高粱植物的方法的步骤(b)中的一个或多个组织的培养包括：

(i)在包括以约30μmol m^-2s^-1至约45μmol m^-2s^-1的强度照射的白光的昏暗光条件下在如本文所述的CIM中以约16h的光周期持续约3-5周培养所述一个或多个组织，任选地在选择剂存在下进行；

(ii)将所述一个或多个组织从(i)转移至如本文所述的SIM，并在包括以约65μmols^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的强度照射的白光的光条件下以约16h的光周期持续约2周进行培养，任选地在选择剂存在下进行；以及

(iii)将所述一个或多个组织从(ii)转移至如本文所述的SRM，并在包括以约65μmol s^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的强度照射的白光的光条件下以约16h的光周期持续约2周进行培养，任选地在选择剂存在下进行；从而产生一个或多个遗传修饰的芽。

在每个前述实施例中，预期一个或多个组织的培养在适于高粱外植体再生以产生高粱芽的温度或一系列温度下进行。适当的温度将是本领域技术人员已知的。例如，培养可以在24±2℃的温度下进行。

另外，如本文所述的产生遗传修饰的高粱植物的方法可包括在引入一种或多种核酸后将一个或多个高粱组织各自分成两个或更多个部分的额外步骤。优选地，在从所述一个或多个高粱组织出现嫩芽之前***所述一个或多个组织。

从转化的外植体再生、发育和培养植物的方法在本领域中是公知的(Weissbach等人，Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,Calif.,(1988))。此再生和生长方法通常包括这样的步骤：选择转化的细胞或组织，培养那些个体化细胞或组织使其经过胚胎发育的常规阶段，直至生根苗阶段。然后将得到的遗传修饰的生根芽种植在适当的植物生长培养基诸如土壤中。

再生的遗传修饰的高粱植物可以自花授粉以提供纯合的遗传修饰的高粱植物。另外，从遗传修饰的高粱植物获得的花粉可以与种子生长的农艺学重要品系的植物杂交。相反地，使用来自这些重要品系的植物的花粉对使用本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物进行授粉。通过本公开的方法产生的含有所需核酸(外来的或其他方式的)的遗传修饰的植物可以使用本领域技术人员熟知的方法培养。

发明人已经表明，使用本公开的方法转化高粱的DEC组织实现了至少35％的转化效率，例如像至少40％的转化效率、至少45％的转化效率、至少50％的转化效率、至少55％的转化效率、至少60％的转化效率、至少65％的转化效率、至少70％的转化效率、至少75％的转化效率、至少80％的转化效率、至少85％的转化效率、或至少90％的转化效率。因此，本发明人已经表明，使用本文所述方法从DEC组织产生的遗传修饰的高粱植物可以至少35％的遗传修饰效率，例如像至少40％的转化效率、至少45％的转化效率、至少50％的转化效率、至少55％的转化效率、至少60％的转化效率、至少65％的转化效率、至少70％的转化效率、至少75％的转化效率、至少80％的转化效率、至少85％的转化效率、或至少90％的转化效率获得，其中遗传修饰效率表示为所述方法的步骤(b)中产生的遗传修饰的芽的数量与步骤(a)中使用的DEC组织的数量的百分比。

因此，在一个实例中，本公开的方法包括产生遗传修饰的高粱植物，其中获得了至少35％或至少40％的遗传修饰效率。如本文所用，术语“遗传修饰效率”是指使用本公开的方法从已引入核酸的高粱组织产生的遗传修饰的芽的数量，表示为与在例如转化期间引入核酸的组织的数量的百分比。

可以使用本领域已知的任何方法确定转化效率(和遗传修饰效率)。例如，可以通过使用本公开的方法检测引入高粱组织的一种或多种核酸的存在来确定遗传修饰效率。在一个实例中，可以使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或DNA印迹分析。引入高粱组织的一种或多种核酸的表达产物可以通过多种方式中的任一种进行检测，这取决于产物的性质，并且这些方式包括蛋白质印记和酶测定。还可以通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案检测转化。定量蛋白质表达以及检测不同植物组织中的复制的一种特别有用的方式是使用报告基因，诸如GUS。在一个实例中，通过计算每个组织的荧光或生物发光标记灶的数量来确定转化效率。一旦获得了遗传修饰的植物，就可以使它们生长以产生具有所需表型的植物组织或部分。预期每种前述方法在本文用于鉴定遗传修饰的高粱组织或植物，以及用于确定使用本公开的方法和DEC组织的转化效率(和遗传修饰效率)。此类方法还可用于确定核酸的转化是瞬时的还是稳定的。

本公开还提供了一种产生遗传修饰的高粱植物的子代的方法，所述方法包括自交或杂交使用本文所述的方法产生的遗传修饰的高粱植物，从而产生子代植物。

如本文所用，术语“自交”、“自体受精”、“自花授粉”或它们的变型形式意指来自同一个体的雄配子和雌配子的融合。因此，在本公开的上下文中，自交是指来自通过本文描述的方法产生的遗传修饰的高粱植物的雄配子和雌配子的融合。

如本文所用，术语“杂交”、“异花授粉”或它们的变型形式意指两种不同植物之间的杂交。因此，在本公开的上下文中，杂交是指使通过本文描述的方法产生的遗传修饰的高粱植物与另一种高粱植物杂交。

如本文所用，术语“子代”或“子代植物”或类似形式包括使用本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物的后代。术语“子代”旨在涵盖“直接子代”和“间接子代”。如本文所用，术语“直接子代”是指源自通过本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物的种子(或有时是其他组织)并且为紧接后一代的高粱植物。例如，对于给定的谱系，T2植物是T1植物的直接子代。如本文所用，“间接子代”是指源自通过本公开的方法产生的遗传修饰的高粱植物的直接子代的种子(或其他组织)或来自该谱系中的后续世代的种子(或其他组织)的高粱植物；例如，T3植物是T1植物的间接子代。

在一个实例中，产生遗传修饰的高粱植物的子代的方法还包括以下步骤：

(i)筛选子代植物是否存在遗传修饰或由遗传修饰赋予的表型；以及

(ii)选择包含遗传修饰和/或显示由遗传修饰赋予的表型的子代植物，从而产生一种或多种遗传修饰的高粱植物。

遗传修饰的高粱

本公开还提供了一种通过本文所述的方法产生的遗传修饰的高粱植物或其部分。术语“植物”在本文中用作名词时是指整个植物，但是作为形容词使用时是指存在于植物中、从植物获得、源自植物或与植物相关的任何物质，例如像植物器官(例如叶、茎、根、花)、单个细胞(例如花粉)、种子、植物细胞等。术语“植物部分”是指包含植物DNA的所有植物部分，包括营养结构，例如像叶或茎、根、花器官或结构、花粉、种子、种子部分(诸如胚胎、胚乳、盾片或种皮)；植物组织，例如像血管组织、细胞及其子代，只要植物部分包含通过本公开的方法引入的遗传修饰即可。

术语“种子”和“谷粒(grain)”在本文中可互换使用。“谷粒”是指成熟谷粒诸如已收获的谷粒，或仍然在植物上但准备收获的谷粒，但也可根据上下文指浸渗或发芽后的谷粒。成熟的谷粒或种子通常具有小于约18％-20％的含水量。如本文所用，“发育中的种子”是指成熟前的种子，通常存在于受精或开花后植物的繁殖结构中，但也可以指在成熟之前从植物中分离的此类种子。

在优选的实例中，遗传修饰的高粱植物对于已经引入的每种核酸是纯合的，使得其子代不会因所需的表型而分离。遗传修饰的高粱植物对于引入的一种或多种核酸也可以是杂合的，优选例如像在已从杂种种子生长的F1子代中对于引入的一种或多种核酸是均一杂合的。此类植物可提供本领域中熟知的诸如杂种上风的优势。

在一个实例中，本公开的遗传修饰的高粱植物优选作为大体上相同的至少1,000或1,000,000株植物的群体在田间生长，或在至少1公顷的区域中生长。种植密度根据植物种类、植物品种、气候、土壤条件、肥料率和本领域已知的其他因素而不同。如本领域已知的那样收获植物，可包括刈割、条铺和/或收割植物，然后脱粒和/或簸扬植物材料以将种子与植物部分中通常为糠形式的其余部分分离。另选地，可以单个过程(即联合)从田间中的遗传修饰的高粱植物收获种子。

分化胚胎发生愈伤(DEC)组织

还提供了能够以至少35％的效率进行遗传修饰的高粱DEC组织。在一个实例中，DEC组织能够以至少40％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少45％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少50％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少55％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少60％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少65％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少70％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少75％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少80％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少85％的效率进行遗传修饰。在一个实例中，DEC组织能够以至少90％的效率进行遗传修饰。能够遗传修饰DEC组织的效率计算为从已转化核酸的DEC组织产生的遗传修饰的芽的数量，表示为与在例如转化期间引入核酸的组织的数量的百分比。换句话说，DEC组织能够用一种或多种核酸转化以至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、或至少约90％的转化效率。当确定转化效率时，可以在确定转化效率之后或期间使用本公开的方法对DEC组织进行遗传修饰。

另选地或除此之外，DEC组织可已使用本公开的方法产生。

优选地，DEC组织是绿色组织。

在一个实例中，可以在本文所述的培养基，即描述用于在产生DEC组织的方法中使用的培养基中产生和/或提供DEC组织。

培养基

本公开还提供了一种适于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的培养基。已在产生DEC组织的方法的上下文中描述了愈伤组织诱导培养基(CIM)，除非另外明确指出，否则该CIM的特征应当加以必要的变更以便应用于所描述的培养基的以下每个实例。

在一个实例中，适用于制备高粱的DEC组织的培养基包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少氧化褐变的剂，其中所述一种或多种减少氧化褐变的剂以足以防止或减少高粱组织氧化褐变的浓度存在于培养基中；并且其中所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以相对于彼此足以在培养期间从IE产生DEC的量存在于培养基中。

在一个实例中，一种或多种减少氧化褐变的剂是选自由以下组成的组：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷(phenoxane)、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭。另选地或除此之外，一种或多种减少氧化褐变的剂以约0.1mg/L至约10mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的浓度存在。

在一个实例中，一种或多种生长素是选自由以下组成的组：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式。另选地或除此之外，一种或多种生长素以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L或约1mg/L的浓度存在。

在一个实例中，一种或多种细胞***素是选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)。另选地或除此之外，一种或多种细胞***素以约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的浓度存在。

在一个实例中，培养基被配制成包含生长素和细胞***素，其相对量足以诱导和刺激维持胚胎发生和器官发生潜力的分化细胞的结节状结构的生长，但不允许高粱组织大量分化成有组织的结构。在一个实例中，一种或多种生长素和一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于培养基中。

在优选的实例中，其中减少氧化褐变的剂是硫辛酸，例如α-硫辛酸。例如，硫辛酸可以约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的浓度存在于培养基中。

适于产生高粱的DEC组织的培养基可还包含一种或多种已知可用于植物组织培养的其他成分，包括宏量营养素、微量营养素、维生素、氨基酸或氮补充剂的来源、碳源、不确定的有机补充剂和固化剂。在一个实例中，培养基(除生长素、细胞***素和用于减少氧化褐变的剂以外)包含蛋白胨、铜源、渗透剂和/或固化剂。

例如，蛋白胨可以作为氮、维生素和/或氨基酸的来源包含在培养基中。在一个实例中，培养基包含浓度为约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L的蛋白胨。在一个实例中，蛋白胨以约0.8g/L的浓度存在于培养基中。

本公开的培养基还可包含铜源。例如，培养基可包含硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜。铜可以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的浓度存在于培养基中。

本文所述的培养基可包含渗透剂。用于植物细胞培养的合适的渗透剂在本领域中是已知的并且预期用于本文所述的培养基。例如，包含在本公开的培养基中的渗透剂可选自肌醇、蔗糖、甘露糖醇、甘油、山梨糖醇和麦芽糖。

可用于植物细胞培养基的固化剂在本领域中是已知的，例如琼脂，并且也预期包含在本公开的培养基中。

在一个实例中，基础培养基是MS培养基。

适用于生产高粱的DEC组织的示例性培养基包含浓度为约4g/L至约5g/L的MS培养基、浓度为约1mg/L的2,4-D、浓度约为0.5mg/L的BAP以及浓度约为1mg/L的硫辛酸。此外，培养基可包含浓度为约0.5g/L至约1g/L的L-脯氨酸、浓度为约0.5g/L至约1g/L的蛋白胨、浓度为约100mg/L至约200mg/L的肌醇、浓度为约0.5g/L至约1g/L的硫酸铜、浓度为约10g/L至约50g/L的麦芽糖以及浓度为约6g/L至约12g/L的琼脂中的一者或多者或全部。

培养基将优选地具有适于产生DEC组织的pH。例如，培养基可具有约pH 5.0至约pH6.0的pH。

可用于产生DEC组织的培养基的特别优选的实例描述于实施例1的表1中并且是本文所预期的。

如本文任何实例中所述的培养基，其用于在例如本文所述的方法中制备高粱的DEC组织。

实施例

实施例1.高粱(Sorghum bicolor L.)的DEC组织的制备

植物材料

使近交栽培品种TX-430(Miller 1984)的粒用高粱植物在28±1℃“日间”温度和20±1℃“夜间”温度的植物生长室(Conviron，PGC-20flex)中生长，光周期为16h，“日间”光强度为900-1000LUX。在开花之前，用白色半透明纸袋覆盖穗。在开花后12-15天从穗中收获未成熟胚胎。用水洗涤穗数次并分离大小均匀的发育中种子，并使用与0.1％Tween-20混合的20％市售漂白剂进行表面灭菌，持续15-20min。然后将它们用无菌蒸馏水洗涤3次，每次20min，并在层流罩中吸干。将长度在1.4至2.5mm范围内的未成熟胚胎(IE)在层流罩中无菌分离，并用作制备绿色再生组织的起始组织。

基础培养用培养基

本研究中使用的培养基是基于由PhytoTechnology Laboratories(M519)提供的MS(Murashige和Skoog，1962)。将培养基的pH调整至5.8，然后在121℃下灭菌15min。将热敏植物生长调节剂和其他添加剂诸如硫酸铜(CuSO₄)、硫辛酸、l-半胱氨酸、抗坏血酸、TDZ和遗传霉素(G418，Sigma-用作选择剂)过滤灭菌(0.2μm)并在灭菌后当培养基已冷却至约55℃时添加到培养基中。表1中概述了在转化和植物再生的不同步骤中使用的培养基。

培养方法和材料

将长度在1.4至2.5mm范围内的分离的IE放置在具有不同组成的愈伤组织诱导培养基(CIM)上，盾片朝上。除非另有说明，否则同愈伤组织再生培养基一样，经改良以改善自未成熟胚胎的愈伤组织质量和诱导频率的CIM包含α-硫辛酸(1至5mg/l)、褪黑激素(5至10mg/l)和2-氨基茚满-2-膦酸盐酸盐(1至2mg/l)。为了发育绿色组织，将未成熟胚胎在大约45-50μmol s^-1m^-2(16h/天)的荧光下在24±2℃的组织培养室中孵育。培养三天后，将未成熟胚胎的根和芽端无菌分离并重新接种到相同的培养基(CIM)上且维持在与上述条件相同的条件下。通过以下方式每两周对它们进行传代培养，持续6周：将愈伤组织切成2-3mm的部分，重新接种到相同的培养基(CIM)上并维持在上述相同条件下，然后评估组织培养物的愈伤组织质量、愈伤组织诱导效率和转化效率。愈伤组织诱导频率计算为获得的愈伤组织(～5mm)的数量与接种的未成熟胚胎的总数量的百分比。

在前3-4周在CIM上从IE萌生的愈伤组织大部分是胚胎发生的并且在具有结节状结构的胚胎发生愈伤组织中缓慢分化，所述结节状结构的颜色为从淡绿色到深绿色。选择具有绿色结节状结构的胚胎发生愈伤组织并维持在相同培养基(CIM)上，每2周进行传代培养持续长达6个月或更长时间，以用作转化的外植体。这种类型的组织在本文中称为“分化胚胎发生愈伤组织”或“DEC”组织，是因为这种组织形成维持胚胎发生和器官发生潜力的分化细胞的结节状结构，虽然所述组织实际上是愈伤组织细胞、形成结节状结构和颗粒状结构的细胞以及本发明人理解的位于愈伤组织(未分化细胞)与结节状结构之间某处发育途径上的中间细胞的混合物。有时，所述组织包括早期(球形)体细胞胚胎。

在CIM上六周后，将一些直径约4-7mm的均匀绿色DEC组织转移到芽诱导培养基(SIM)上并再培养2-3周以便开始器官发生。然后将已诱导嫩芽的组织转移至芽再生培养基(SRM)并再次培养2-3周。还在包含不同浓度的BAP(0.5-1.0mg/l)和TDZ(0.5-1.0mg/l)的SRM培养基上测试不同年龄(萌生后2-6个月)的DEC组织的再生性。在SRM上培养3周(包括在SIM上培养和SRM上培养在内，总共大约培养5周)后计芽的数量并计算再生频率(即，芽数/DEC组织数)。将长大约2-3cm的单个芽转移至芽长出(SOG)培养基并再培养2-3周。将发育良好的芽(长4-5cm)小心地从簇中分离并转移至根诱导培养基(RIM)并培养3-4周。对于芽诱导以完成植物再生，在24±2℃下在组织培养室中使用50-60μmol s^-1m^-2(16h/天)的荧光。将具有许多(通常15-20个)健康外观根的芽(长约8cm)转移到土壤中并在PC2温室中于28±1℃下生长至成熟。用于不同植物转化阶段(从愈伤组织诱导到植物自从未成熟胚胎诱导的绿色组织再生)的优化培养基组成呈现于表1中。

表1.用于高粱的DEC组织诱导和植物再生的培养基

实施例2.α-硫辛酸对DEC组织诱导频率和质量的影响

如实施例1中所述，将长度在1.4至2.5mm范围内的IE的组(每个组从一个穗分离)无菌分离并在CIM培养基上培养。将一些组在添加α-硫辛酸(LA，1mg/l或5mg/l)的情况下培养，其他组在不添加α-硫辛酸的情况下培养，以确定这种剂的影响。

培养6周(包括每两周在相同培养基上传代培养)后，评估DEC组织诱导频率和质量。数据呈现于表2中。在含LA的CIM上培养的小的未成熟胚胎(1.5-2mm)具有更大的DEC组织诱导频率(显著的，p<0.01)以及改善的结节状结构质量，相比之下，不含LA的CIM上的胚胎倾向于白色或淡黄色，具有颗粒状愈伤组织和较少的结节状结构。在这个背景下，改善的质量是指结节状结构的视觉外观，它们的颜色是淡绿色到深绿色而不是趋于棕色，这表明健康状况得到改善；以及开始形成体细胞胚胎的组织的相对数量，为约50％的球形期组织。当在LA存在下培养时，对于作为起始材料的较大未成熟胚胎(>2mm)观察到类似的改善趋势，但这种改善趋势在统计学上并不显著(p＝0.1)。与含LA的CIM相比，来自无LA情况下培养的未成熟胚胎(1.4-2mm或>2mm)的愈伤组织倾向于是白色/浅黄色到绿色，具有较少的结节状结构以及较少的球形期胚胎(表2)。相比1mg/ml，使用更高浓度的LA(5mg/l)未观察到显著的进一步改善。

表2.诱导培养基中有无LA的DEC组织诱导频率和质量的比较

值是平均值±报告的标准偏差(SD)。*显著的，p<0.013。**不显著的。

实施例3.α-硫辛酸对DEC组织收率的影响

如上文实施例2中所述，将长度在1.4至2.5mm范围内的四十五个IE(三个复制品，每个复制品15个IE)无菌分离并在添加和未添加LA(1mg/ml)的CIM培养基上培养。

培养4至12周后，计获得的DEC组织的数量。数据呈现于表3中。与使用不含LA的CIM相比，在含LA的CIM上12周时获得的DEC组织片(～5mm)的数量几乎是两倍。此外，与使用不含LA的培养基相比，在含LA的CIM上获得的DEC组织的质量得到改善。

表3.LA对高粱DEC组织收率的影响

实施例4.α-硫辛酸对再生效率和芽数/DEC组织数的影响

将在含或不含添加的LA的CIM培养基上诱导的各自具有结节状结构的均匀即用高质量绿色DEC组织(～5mm)转移至含或不含LA的芽诱导培养基(SIM)并再培养2-3周。然后将具有诱导嫩芽的组织转移至含或不含LA的芽再生培养基(SRM)并再次培养2-周。在含有不同浓度的BAP(0.5-1.0mg/l)和TDZ(0.5-1.0mg/l)的SRM培养基上测试不同年龄(萌生后2-6个月)的绿色组织的再生性。在含或不含LA的无激素培养基(SOG)上再次培养包含嫩芽的组织。在SRM上培养2周后计芽的数量并计算再生频率(芽数/DEC组织数)。

与仅使用BAP相比，使用具有BAP和TDZ组合的芽再生培养基是优越的。表4中呈现了不同年龄的DEC组织的再生频率和芽数/DEC组织数。在SIM和SRM培养基中不含LA的情况下，随着组织增老，再生频率和芽数/DEC组织数缓慢下降。然而，当两种培养基中都包含LA时，对于不同年龄的DEC组织再生频率和芽数/DEC组织数并未下降那么多。在图1中示出了自在含或不含LA的SIM和SRM中培养的高粱未成熟胚胎的DEC组织生成和植物再生。

表4.硫辛酸对再生频率的影响

值是平均值±报告的标准偏差(SD)。在计算芽数/愈伤组织数时，行中的不同字母是显著的(P<0.05)。*显著的，P＝0.004。**显著的，P＝<0.001。

实施例5.来自不同愈伤组织系的再生苗的DNA含量

在此实验中，使用流式细胞术(FCM)确定来自不同愈伤组织系(5个月至2年)的再生苗的相对DNA含量。

使用Partec PAII流式细胞仪确定来自不同年龄DEC组织(从未成熟胚胎诱导时间起18个月、12个月、9个月、6个月等)的再生高粱植物与WT(从种子生长起的植物)之间的倍性水平的变化。将来自WT和再生植物的50mg幼叶组织，使用剃刀刀片在培养皿中在1ml的Galbraiths缓冲液(45mM MgCl₂，20mM MOPS，30mM柠檬酸钠0.1％(v/v)Triton X-100，使用1M NaOH将pH调整至7)中切成小片。使用移液管将每个样品的匀浆混合数次，之后将核悬浮液通过38μM尼龙布过滤到1.5ml eppendorf管中并以1000rpm离心2.5分钟。除去每个样品的约800μl上清液，留下200μl匀浆，向其中添加10μl碘化丙啶溶液(1mg/ml，Sigma)。将含有碘化丙锭的匀浆转移到流式细胞仪管中，在室温下孵育1h并分析。

将WT种子用作分析对照以确定来自不同年龄愈伤组织系的2个独立选择的再生物中的相对DNA含量。基于内标物和样品的G1峰的荧光强度值计算2C DNA含量。未知样品的倍性水平和DNA含量计算如下：

倍性核DNA含量＝样品峰的平均位置/标准峰的平均位置X标准物的DNA含量。

高粱的核2C DNA含量被认为是1.74(Chae等人2013)。

FCM显示几乎所有植物都是二倍体，并且DNA含量与WT种子相当(表5)。通过单因素方差分析，WT和再生系之间DNA含量的差异在统计学上不显著(p＝0.19)。WT和来自不同愈伤组织系的再生植物的G2/G1比率小于2.0，并且在WT和再生植物的该比率之间没有显著差异。来自WT和从DEC组织再生的植物的叶子的相对核DNA含量的直方图未显示任何明显的G0/G1峰(图2)。

结论是，与维持超过6个月或更长时间的其他高粱组织培养方法不同，用于制备DEC组织的方法不会对组织的DNA含量产生负面影响也不会因此对倍性产生负面影响。因此，DEC组织方法更可能产生表型正常的转基因高粱植物和植物部分。

表5.从不同年龄愈伤组织系再生的叶组织的核DNA含量的2C值。

^a每次处理包括2株植物，重复2次。使用多对比较程序比较平均值，发现没有显著差异，p＝0.19。

实施例6.遗传霉素作为转化组织的选择剂

在实施例2-4中描述的用于培养和再生条件的实验未使用针对转化细胞的选择剂，因为未将遗传构建体引入细胞中。作为使用可再生DEC组织/体细胞胚胎发展转化方法的下一步，确定DEC组织/体细胞胚胎对遗传霉素的敏感性。

该实验使用6周龄的均匀、健康的绿色DEC组织进行，所述DEC组织大小为约5mm，并且含有一些体细胞胚胎，所述体细胞胚胎是在含有1mg/l LA的CIM上培养后产生的。使用的遗传霉素水平分别为0、15、25、35和45mg/L。对于每个测试遗传霉素浓度，使用三个复制品，每个复制品每个板15个绿色DEC组织片。将组织培养6周，每两周在包括相同遗传霉素浓度的相同培养基上传代培养。

培养6周后，计存活的绿色DEC组织的数量。数据呈现于表6中。

在培养3周内，DEC组织(约5mm)开始在选择性愈伤组织诱导培养基(含遗传霉素的CIM)上显示遗传霉素应激症状。不含遗传霉素(G0)的培养基中的DEC组织显示出持续的细胞增殖和健康的生长而没有任何愈伤组织损失。在具有不同浓度的遗传霉素(15、25、35和45mg/l)的CIM培养基上8周后，DEC组织显示出不同的生长反应。在含G25和35mg/l的CIM上8周后，大多数愈伤组织变成深棕色，没有存活迹象。极少数愈伤组织(2-6个)存活了，但具有死亡斑块。在此基础上，将25mg/l最终浓度的遗传霉素用于愈伤组织诱导培养基中进行3个循环(每个循环2周)，然后在芽诱导培养基中增加至30mg/l进行一个循环(表6)。CIM和SIM中含不同浓度的遗传霉素被认为是防止从非转化愈伤组织再生芽的最佳方法。

表6.在含有遗传霉素的培养基上DEC组织/体细胞胚胎的存活率

实施例7.粒子轰击绿色再生DEC组织

获得遗传载体，其含有设计用于在植物细胞中表达的uidA(GUS)和bar基因。uidA基因受玉米多聚泛蛋白启动子(pUbi)和根癌农杆菌章鱼碱合酶多聚腺苷酸化/终止子(ocs3’)序列的调控控制。启动子和蛋白质编码区之间的序列包括Ubi基因的5’UTR和第一个内含子。uidA报告基因在其蛋白质编码区内还含有来自蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子，所述蓖麻子过氧化氢酶基因阻止功能性GUS蛋白在农杆菌中的翻译，由此减少接种的植物组织中的背景GUS基因表达。因此，任何GUS表达都是由于植物细胞中uidA基因的表达。bar基因也受pUbi启动子的调控控制，并以农杆菌胭脂碱合酶3’调控序列(nos 3’)终止(Richardsom等人，2014)。uidA/bar载体示意性地呈现于图3A中。uidA/bar载体最初在实验中用于检测高粱DEC组织中的瞬时基因表达。

对于实验还获得了另一种二元质粒(pBSV003)以实现稳定的转化，所述二元质粒受pUbi启动子控制并以nos 3’区终止(图3B)，含有编码新霉素磷酸转移酶II(NptII)的提供抗生素遗传霉素抗性的基因。

根据制造商的说明，使用Zymopure^TM Maxiprep试剂盒(USA)分离质粒DNA。

将通过上述实施例中描述的方法产生并从萌生已培养6周至6个月的均匀健康的绿色再生DEC组织(大小4-5mm)用于利用质粒进行的微粒介导的转化(轰击)。将大约15个均匀的绿色DEC组织(各4-5mm)置于含有CIM渗透培养基(表7)的培养皿(直径15x 90mm)的中心，并在轰击前在黑暗中孵育约4h。如Liu等人(2014)所述，用PDS-1000He装置(Biorad,Hercules,CA)进行轰击。简而言之，将质粒DNA(1μg/μl)沉淀到0.6μm金粒子上，并使用1350psi破裂盘在26-27Hg真空下用氦压加速。轰击后，将DEC组织维持在相同的渗透培养基上过夜，并在第二天早晨转移到预选择培养基中并再培养3-4天。将轰击的愈伤组织在设定在24±1℃的组织培养室中在大约95-100μmol s^-1m^-2(16h/天)的荧光下孵育。

表7.用于转化、选择和再生的培养基的组成。

实施例8.L-半胱氨酸和抗坏血酸对轰击后组织恢复和基因表达的影响

在进行任何选择前将实施例7中用遗传载体质粒轰击的具有编码NptII的选择性标记(提供抗生素遗传霉素抗性)的绿色DEC组织转移至CIM-PS培养基(根据表7)维持3-4天，所述培养基中添加或不添加作为抗氧化剂的两种化合物，即L-半胱氨酸(50mg/l)和抗坏血酸(15mg/l)。在预选择培养基中未添加这些抗氧化剂的情况下，被轰击组织中许多组织变成棕色，一些组织颜色完全为深棕色，并且许多组织丧失了进一步生长的能力。在预选择培养基(含或不含L-半胱氨酸和抗坏血酸)上3-4天后，对被轰击组织进行GUS染色并在显微镜下观察以计独特的蓝色(GUS阳性)斑点数量。在所有被轰击DEC组织中观察到强GUS基因表达，为至少15个灶/愈伤组织。如GUS基因的瞬时表达所示的(表8)，在预选择培养基中包含两种抗氧化剂进一步提高了转化效率(至少20个灶/愈伤组织)。在含半胱氨酸和抗坏血酸的CIM上培养的DEC组织中观察到的GUS灶的平均数量为约27个GUS灶/愈伤组织，并且在全部组织(5-7mm)而不是成簇组织中观察到独特的GUS阳性斑点。除此之外，多个芽从单个DEC组织再生，包括从用遗传霉素选择的组织再生，促进了对能够从单个DEC外植体获得多个事件的改良选择程序的评定。为了探索这一点，将一些被轰击组织分成两个大致相等的部分(如图4所示)，并如下文实施例9中所述进行培养。

表8.轰击后L-半胱氨酸和抗坏血酸的影响

值是平均值±报告的标准偏差。*不显著的(p＝0.083)；**显著的(p＝0.039)。

实施例9.优化条件下转基因植物的选择和再生

轰击并在不含选择剂(遗传霉素)的预选择培养基上培养3-4天后，来自实施例8的被轰击组织的大小已从4-5mm增加到约6-7mm。将这些组织转移至含有25mg/l遗传霉素的选择性培养基CIM/G25，并再培养4周(2个循环)。将一些组织分成两个大致相等的片，而其他组织不分，试图看每个组织是否可以获得更多的转化体(图4)。将所有组织在如表7中所述的培养基上培养并维持以便再生推定的转基因植物。

在这些培养基上生长后，植物有效再生。将每个被轰击组织和从其获得的芽单独传代培养并维持以计算各组的转化效率。对从芽样品分离的植物基因组DNA进行PCR，显示存在选择性标记基因，借此确认阳性转化。转基因高粱的选择和转化如图6所示。计算每输入DEC组织转化体的数量。即，转化效率(TE％)计算为独立再生事件的数量/被轰击外植体的总数x100。转化效率的数据呈现于表9中。

虽然从单个选择的***愈伤组织获得了更多的芽(>5)，但认为所有芽都是相同愈伤组织的克隆。对于单个被轰击构建体，从***组织获得的平均转化效率为约46％，这可以与非***组织的27％的转化效率相比较。***被轰击组织时获得的转化效率是Liu和Godwin(2012)先前在TX430中使用未成熟胚胎所报告的转化效率的两倍以上。

与未被***的组织相比，从已分成两部分的组织再生的转基因植物的数量显著增加。由于多个转化灶，这实现了从单个被轰击组织中恢复多个芽。

表9.转化效率

实施例10.T0转化体的分子分析

对在实施例7中用pBSV003轰击的20个随机选择的推定转化体的DNA进行PCR分析，以使用NptII引物确认NptII基因的存在。所有植物都是形态正常的，雄性和雌性可育的，并产生种子。

如Mieog等人(2013)所述略进行修改从推定的转基因芽的幼叶分离基因组DNA。简而言之，使用tissuelyser-II(Qiagen)在具有不锈钢球轴承的96孔板的各个孔中将冷冻干燥的叶组织(1cm²)粉碎。向粉碎的各组织中添加375μl的DNA提取缓冲液(0.1M Tris-HClpH 8.0，0.05M EDTA pH 8.0，1.25％SDS)。然后将混合物在65℃下孵育1h，之后添加187μl的6M乙酸铵，并将样品在4℃下再孵育30min。然后将样品在室温下以3000rpm离心30min。从每个样品中回收340μl上清液，并将其转移到每个孔中含有220μl异丙醇的新96孔板中以沉淀DNA。将DNA用70％乙醇冲洗一次，短暂干燥并溶于220μl无菌蒸馏水中，并在4℃下放置过夜。为确认NptII基因的存在，使用NPTII-正向引物：5’-ATGATTGAACAAGATGGATTG-3’(SEQID NO:1)和NPTII-反向引物：5’-GCTATGTCCTGATAGCGGTCC-3’(SEQ ID NO:2)引物并对推定的转基因芽的基因组DNA进行PCR分析。PCR的热循环曲线是：94℃初始变性，15min；35个循环的94℃60s，56℃30s，72℃1min；最后72℃，10min。将扩增产物在TAE缓冲液中的1％w/v琼脂糖凝胶上进行大小分级。在80伏下进行凝胶电泳40min，然后用BioRad QuantiOne UV透照仪和软件观察DNA条带。

所有推定的转化体对于NptII转基因均为阳性的，并且具有来自该基因内部区段的预期的750bp扩增子(图7)。在WT DNA中未检测到条带。在所有推定的转化体中都存在NptII转基因，表明遗传霉素选择对DEC组织是合适且有效的。

然后通过ddPCR使用两个引物组分析转基因拷贝数，所述两个引物组中一个设计来靶向NptII(转基因)，另一个靶向内源参照基因ENOL-2(Xue等人，2014)，这种基因在高粱中以两个拷贝存在。通过微滴数字PCR(Digital Droplet PCR)(Katarzyna等人，2016)，使用表10中描述的特异于NptII选择性标记和高粱ENOL-2参照基因(Xue等人，2014)的引物和探针确定转基因拷贝数。将BamH1和EcoR1消化的基因组DNA以每25μl PCR反应20ng和120ngDNA之间的浓度添加到ddPCR主混合物中。反应中Sigma引物和IDT探针的最终浓度分别为400nM和200nM。根据制造商的说明，使用微滴生成器QX200(Bio-Rad,Australia)产生微滴。将40μl油包微滴乳液转移至96孔板并装入C1000热循环仪(Bio-Rad,Australia)中。PCR热循环程序包括95℃10min；40个循环的94℃30s和59℃1min，然后是98℃10min，每步上升2.5℃/s。扩增后，将板装到QX100微滴读数器(Bio-Rad,Australia)上以检测单个微滴中的扩增子。使用Quanta soft软件(版本1.7.4.0917；Bio-Rad,Australia)进行数据分析。

表10.用于拷贝数检测的引物和探针

通过在随机选择的31个独立T0事件中计算参照和转基因的浓度来确定转基因拷贝数的变化。31个转基因事件中有8个显示<2个拷贝(22.5％)，而约26％的事件显示每个二倍体基因组有2-3个拷贝。预测剩余的转基因事件(48.3％)每个二倍体基因组含有多于3个拷贝(图5)。

发明人得出结论，使用DEC组织的转化方法提供了一种有效的相对快速的方法，该方法产生了形态正常的、可育的高粱植物，在再生植物群体中没有检测到非转基因植物。转基因在子代植物中得到遗传，证明转基因整合到高粱基因组中。

实施例10-农杆菌介导的绿色再生DEC组织的转化

将通过上述实施例中描述的方法产生并从萌生已培养6周至6个月的均匀健康的绿色再生DEC组织(大小4-5mm)用于农杆菌介导的转化。

获得遗传载体，以便使用农杆菌介导的转化转化绿色再生DEC组织。遗传载体含有设计用于在植物细胞中表达的uidA(GUS)和bar基因。uidA基因受玉米多聚泛蛋白启动子(pUbi)和根癌农杆菌章鱼碱合酶多聚腺苷酸化/终止子(ocs 3’)序列的调控控制。启动子和蛋白质编码区之间的序列包括Ubi基因的5’UTR和第一个内含子。uidA报告基因在其蛋白质编码区内还含有来自蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子，所述蓖麻子过氧化氢酶基因阻止功能性GUS蛋白在农杆菌中的翻译，由此减少接种的植物组织中的背景GUS基因表达。因此，任何GUS表达都是由于植物细胞中uidA基因的表达。bar基因也受pUbi启动子的调控控制，并以农杆菌胭脂碱合酶3’调控序列(nos 3’)终止。

获得了合适的根癌农杆菌菌株，例如如Lazo等人(1991)所述的AGL1，并且通过热激法将遗传载体引入根癌农杆菌菌株中。

将携带遗传构建体的农杆菌培养物在合适的培养基例如LB培养基中以及适当的条件下生长以产生农杆菌接种物，之后用农杆菌接种物感染均匀健康的绿色再生DEC组织。将感染的DEC组织在无菌滤纸上吸干以除去过量的农杆菌并转移至共培养培养基(任选地补充有抗氧化剂)，并在黑暗中在大约22℃-24℃下孵育2-4天。孵育后，将DEC组织用适当的剂处理以杀死农杆菌，在无菌水中洗涤，转移至适当的培养基并使其生长。4-6周后，切下芽并在芽伸长培养基上培养，然后使用适当的测定法检测推定的转基因芽。

本领域技术人员将理解，在不脱离本公开的广泛总体范围的情况下，可对上述实施方案进行多种变更和/或修改。因此，本发明的实施方案被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。

本文所讨论和/或参考的所有出版物都整体并入本文。

对已经被包含在本说明书中的文档、法案、材料、装置、物品等的任何讨论都仅仅是为了提供本发明的背景。而不应由于它在本申请的每项权利要求的优先权日之前已经存在，就将其视作承认这些主题中的任一个或全部构成现有技术基础的一部分、或者是本发明相关领域中的公知常识。

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Zhao et al.(2000).Plant Mol Biol 44：789-798.

序列表

<110> 联邦科学技术研究组织

<120> 改进高粱的遗传转化的方法

<130> 525553

<150> AU 2016902278

<151> 2016-06-10

<160> 8

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTII-正向引物

<400> 1

atgattgaac aagatggatt g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTII-反向引物

<400> 2

gctatgtcct gatagcggtc c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTII正向引物

<400> 3

tacgcttgat ccggctac 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTII反向引物

<400> 4

cttccatccg agtacgtg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NPTII探针序列

<400> 5

gaaacatcgc atcgagcg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENOL-2正向引物

<400> 6

tgaggaccct tttgatcagg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENOL-2反向引物

<400> 7

caagccttct tgccaatagc 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ENOL-2探针序列

<400> 8

tggagttcat gggcatcatt gca 23

Claims (45)

1.一种用于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的方法，所述方法包括将来自高粱的分离的未成熟胚胎(IE)在愈伤组织诱导培养基(CIM)中在足以从所述IE产生DEC组织的时间内和条件下培养，其中所述CIM包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少氧化褐变的剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CIM具有以下特征中的一个或多个或全部：

(i)所述一种或多种减少氧化褐变的剂是选自由以下组成的组：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭；

(ii)所述一种或多种减少氧化褐变的剂以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的浓度存在于所述CIM中；

(iii)所述一种或多种生长素是选自由以下组成的组：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式；

(iv)所述一种或多种生长素以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、或约0.5mg/L至约1mg/L的浓度存在于所述CIM中；

(v)所述一种或多种细胞***素是选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)；

(vi)所述一种或多种细胞***素以约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的浓度存在于所述CIM中；

(vii)所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以相对于彼此足以从所述IE产生和/或维持所述DEC的量存在于所述CIM中；并且

(viii)所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于所述CIM中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述CIM包含硫辛酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CIM包含浓度为约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的硫辛酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述CIM还包含以下中的一种或多种或全部：

(i)浓度为约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L的蛋白胨；

(ii)呈硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜形式的铜；

(iii)其中当存在铜时，所述铜以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的浓度存在；和/或

(iv)渗透剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述IE的培养在昏暗光条件下进行，持续足以产生所述DEC组织的时间。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述IE的所述培养在光强度为约10μmol s^-1m^-2至约55μmol s^-1m^-2、或约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2的昏暗光条件下进行。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述IE的培养以约12h至约20h、约14h至约18h或约16h的光周期进行。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述足以产生所述DEC组织的时间为至少约2至约6周、约3至约5周、或约4周。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括至少一个传代培养步骤，所述至少一个传代培养步骤包括将DEC组织转移至新鲜CIM并在所述新鲜CIM中培养所述DEC组织。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一个传代培养步骤包括在与用于产生如前述权利要求中任一项所定义的DEC组织的条件基本上相同的条件下在新鲜CIM中培养所述转移的DEC组织。

12.根据权利要求11所述的方法，其中每2至4周重复所述传代培养步骤以维持所述DEC组织。

13.根据权利要求12所述的方法，其中重复所述传代培养步骤以从自所述IE产生所述DEC组织时起将所述DEC组织维持至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月和/或长达12个月。

14.一种产生遗传修饰的高粱细胞的方法，所述方法包括将一种或多种核酸引入高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织中。

15.一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)对一个或多个DEC组织执行如权利要求14所述的方法；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的所述一个或多个DEC组织，使得所述培养诱导从所述一个或多个DEC组织形成芽，从而产生一个或多个遗传修饰的芽；

(c)从步骤(b)的所述一个或多个遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

16.一种产生遗传修饰的高粱植物或其再生部分的方法，所述方法依序包括以下步骤：

(a)将一种或多种核酸引入高粱组织群体中；

(b)在培养基或一系列培养基上培养已引入所述一种或多种核酸的所述高粱组织，使得所述培养以每100个已引入所述一种或多种核酸的高粱组织至少35个遗传修饰的芽的效率诱导从所述高粱组织形成芽，从而产生遗传修饰的芽；以及

(c)从步骤(b)的所述遗传修饰的芽产生一种或多种遗传修饰的高粱植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物；以及任选地

(d)从步骤(c)的所述一种或多种遗传修饰的植物获得再生部分。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种核酸中的至少一种包含选择性标记基因，并且步骤(b)包括选择已引入所述选择性标记基因的一个或多个组织。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中通过细菌介导的转化、微粒介导的转化、电穿孔、显微注射、聚乙二醇(PEG)诱导的融合或脂质体介导的转移，将所述一种或多种核酸引入所述一个或多个高粱组织中。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中用于在步骤(b)中培养所述一个或多个高粱组织的所述培养基或所述一系列培养基中的至少一种培养基包含如权利要求1至5中任一项所定义的CIM。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在昏暗光条件下在所述一系列培养基中的一种或多种培养基上培养所述一个或多个高粱组织，然后在强度大于所述昏暗光条件的光条件下在所述一系列系列培养基中的一种或多种另外的培养基上培养所述一个或多个高粱组织。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述昏暗光条件的特征在于光强度为约10μmols^-1m^-2至约55μmol s^-1m^-2、约30μmol s^-1m^-2至约50μmol s^-1m^-2、或约45μmol s^-1m^-2至约50μmols^-1m^-2。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中强度大于所述昏暗光条件的所述光条件具有约55μmol s^-1m^-2至约90μmol s^-1m^-2、约60μmol s^-1m^-2至约85μmol s^-1m^-2、或约65μmol s^-1m^-2至约80μmol s^-1m^-2的光强度。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述培养以约12h至约20h、约14h至约18h、或约16h的光周期进行。

24.根据权利要求15至23中任一项所述的方法，其中在所述培养基上或在所述一系列培养基中的每种培养基上培养所述一个或多个高粱组织独立地进行约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、或约6周。

25.根据权利要求15至24中任一项所述的方法，其还包括在引入所述一种或多种核酸后将所述一个或多个高粱组织各自分成两个或更多个部分。

26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述一系列培养基中的一种或多种包含L-半胱氨酸和/或抗坏血酸。

27.根据权利要求15至26中任一项所述的方法，其中获得了至少35％或至少40％的遗传修饰效率，其中所述遗传修饰效率表示为步骤(b)中产生的遗传修饰的芽的数量与步骤(a)中使用的DEC组织或高粱组织的数量的百分比。

28.根据权利要求14或权利要求15或权利要求17至27中任一项所述的方法，当从属于权利要求14或权利要求15时，其还包括：

(i)获得所述一个或多个高粱DEC组织；

(ii)获得通过如权利要求1至13中任一项所述的方法产生的一个或多个DEC组织；或者

(iii)通过执行如权利要求1至13中任一项所述的方法产生所述一个或多个高粱DEC组织。

29.一种产生遗传修饰的高粱植物的子代的方法，所述方法包括自交或杂交使用如权利要求15至28中任一项所述的方法产生的遗传修饰的高粱植物，从而产生子代植物。

30.根据权利要求29所述的方法，其还包括：

(i)筛选所述子代植物是否存在遗传修饰或由所述遗传修饰赋予的表型；以及

(ii)选择包含所述遗传修饰和/或显示由所述遗传修饰赋予的表型的子代植物，从而产生所述一种或多种遗传修饰的高粱植物。

31.一种使用根据权利要求15至30中任一项所述的方法产生的遗传修饰的高粱植物、子代或其部分，其中所述高粱植物、子代或其部分包含通过所述方法引入的遗传修饰。

32.一种适用于制备高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织的培养基，所述培养基包含适于培养植物细胞的基础培养基，所述基础培养基补充有一种或多种生长素、一种或多种细胞***素和一种或多种减少氧化褐变的剂，其中所述一种或多种减少氧化褐变的剂以足以防止或减少所述高粱组织的氧化褐变的浓度存在于所述培养基中；并且其中所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以相对于彼此足以在培养期间从所述IE产生DEC的量存在于所述培养基中。

33.根据权利要求32所述的培养基，其包括以下特征中的一个或多个或全部：

(i)所述一种或多种减少氧化褐变的剂是选自由以下组成的组：硫辛酸、褪黑激素、2-氨基茚满-2-膦酸、抗坏血酸、α-生育酚、3,5-二丁基-4-羟基甲苯(BHT)、半胱氨酸、***盐、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、二硫苏糖醇(DTT)、非那宗和苯噁烷、硝酸银、柠檬酸盐、谷胱甘肽、植酸、去甲二氢愈创木酸(NDGA)和活性炭；

(ii)所述一种或多种减少氧化褐变的剂以约0.1mg/L至约10mg/L、约0.5g/L至约5g/L、约1g/L至约5g/L、或约1g/L的浓度存在；

(iii)所述一种或多种生长素是选自由以下组成的组：吲哚-3-乙酸(IAA)、4-氯吲哚-3-乙酸、苯乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)、2-萘氧基乙酸、4-氯苯氧基乙酸、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸、毒莠定以及这些物质中任一者的盐形式；

(iv)所述一种或多种生长素以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.1mg/L至约3mg/L、约0.3mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L或约1mg/L的浓度存在；

(v)所述一种或多种细胞***素是选自由以下组成的组：苄基氨基嘌呤(BAP)、玉米素、激动素、2IP、玉米素核糖核苷、二苯基脲和噻苯隆(TDZ)；

(vi)所述一种或多种细胞***素以约0.01mg/L至约2mg/L、约0.1mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约2mg/L、约0.5mg/L至约1mg/L、或约0.5mg/L的浓度存在；以及

(vii)所述一种或多种生长素和所述一种或多种细胞***素以约1.25:1、约1.5:1、约1.75:1、约2:1、约2.25:1、约2.5:1、约2.75:1、或约3:1的重量比(生长素:细胞***素)存在于培养基中。

34.根据权利要求32或权利要求33所述的培养基，其中所述减少氧化褐变的剂是硫辛酸。

35.根据权利要求34所述的培养基，其中所述硫辛酸以约0.5mg/L至约2.0mg/L、或约1mg/L的浓度存在于所述培养基中。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的培养基，其包含以下中的一种或多种或全部：

(i)浓度为约0.2g/L至约2g/L、约0.5g/L至约1.5g/L、约0.7g/L至约1g/L、或约0.8g/L的蛋白胨；

(ii)呈硫酸铜、氯化铜、硝酸铜、葡糖酸铜或乙酸铜形式的铜；

(iii)其中当存在铜时，所述铜以约0.1mg/L至约5mg/L、约0.3mg/L至约3mg/L、约0.5mg/L至约1.5mg/L、约0.7mg/L至约1mg/L、或约0.8mg/L的浓度存在；和/或

(iv)渗透剂。

37.根据权利要求32至36中任一项所述的培养基，其中所述基础培养基是MS培养基。

38.根据权利要求32至37中任一项所述的培养基，其包含浓度为约4g/L至约5g/L的MS培养基、浓度为约1mg/L的2,4-D、浓度约为0.5mg/L的BAP以及浓度约为1mg/L的硫辛酸。

39.根据权利要求38所述的培养基，其还包含以下中的一种或多种或全部：

(i)浓度为约0.5g/L至约1g/L的L-脯氨酸；

(ii)浓度为约0.5g/L至约1g/L的蛋白胨；

(iii)浓度为约100mg/L至约200mg/L的肌醇；

(iv)浓度为约0.5g/L至约1g/L的硫酸铜；

(v)浓度为约10g/L至约50g/L的麦芽糖；以及

(vi)浓度为约6g/L至约12g/L的琼脂。

40.根据权利要求32至39中任一项所述的培养基，其具有约pH 5.0至约pH 6.0的pH。

41.根据权利要求32至40中任一项所述的培养基，其用于制备高粱的DEC组织。

42.一种高粱的分化胚胎发生愈伤(DEC)组织，其能够以至少35％的效率进行遗传修饰。

43.根据权利要求42所述的DEC组织，其能够以至少45％的遗传修饰效率进行遗传修饰。

44.根据权利要求42或权利要求43所述的DEC组织，其中所述遗传修饰效率是如通过使用所述DEC组织执行如权利要求15至27中任一项所述的方法并计算遗传修饰的效率所确定的。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的DEC组织，其在如权利要求32至41中任一项所述的培养基中产生和/或提供。