CN109481454B - 抗肿瘤组合物及其在制备抗肿瘤或抑制癌细胞药物方面的应用、抗肿瘤药物 - Google Patents

抗肿瘤组合物及其在制备抗肿瘤或抑制癌细胞药物方面的应用、抗肿瘤药物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤组合物及其在制备抗肿瘤或抑制癌细胞药物方面的应用、抗肿瘤药物，属于药物制备技术领域。本发明的抗肿瘤组合物包括包括第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分，第一抗肿瘤组分为卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的组合或卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的盐；第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，第一抗肿瘤组分与双氢青蒿素的摩尔比为1：1‑20；或第二抗肿瘤组分为青蒿素类衍生物，第一抗肿瘤组分与青蒿素或代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1：1‑20，代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物为青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合。本发明的抗肿瘤组合物的组分有协同增效作用。

Description

抗肿瘤组合物及其在制备抗肿瘤或抑制癌细胞药物方面的应 用、抗肿瘤药物
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤组合物及其在制备抗肿瘤或抑制癌细胞药物方面的应用、抗肿瘤药物，属于药物制备技术领域。
背景技术
恶性肿瘤至今仍无法治愈，已成为当今全球突出的公共卫生问题。世界卫生组织称，目前全球平均每8个死亡病例中就有1人死于癌症，比艾滋病、疟疾和结核病导致的死亡人数总和还要高。国际癌症研究中心(IARC)的数据表明，2002年全世界恶性肿瘤新发病例约为1090万例，死亡670万例。IARC提供的研究报告显示，到2020年全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。WHO统计表明，2012年全球癌症新增病例和死亡人数出现惊人的增长，中国更是高居榜首。国家癌症中心发布的最新一期“中国恶性肿瘤发病和死亡分析报告”显示，2014年全国新发恶性肿瘤病例约380.4万例，死亡病例229.6万例。中国分别约占全球恶性肿瘤新发病例与死亡病例的21.8％和27％，在184个国家和地区中，位居中等偏上水平。这意味着平均每分钟有7人被确诊为癌症，4人因癌症死亡。目前癌症治疗的方式主要有手术治疗、放射治疗、化学疗法、生物治疗等，其中，化学药物治疗仍是主要的治疗方式。
治疗癌症的化学药物中，卡培他滨(Capecitabine)是一种可以在体内转变成5-FU的抗代谢氟嘧啶脱氧核苷氨基甲酸酯类药物，商品名称为希罗达，能够抑制细胞***和干扰RNA和蛋白质(protein)合成。主要用于晚期原发性或转移性乳腺癌、直肠癌、结肠癌和胃癌的治疗，特别是适用于紫杉醇和包括有蒽环类抗生素化疗方案治疗无效的晚期原发性或转移性乳腺癌的进一步治疗。
阿糖胞苷很快被腺苷脱氨酶作用而失活，氟达拉滨却不会被这种酶灭活。磷酸氟达拉滨在体内被快速地去磷酸化成为2F-ara-A，后者可以被细胞摄取，然后被细胞内的脱氧胞苷激酶磷酸化后成为有活性的三磷酸盐，可抑制DNA合成。对B-细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)疗效显著。
羟基脲(Hydroxycarbamide)，是一种核苷二磷酸还原酶抑制剂，可以阻止核苷酸还原为脱氧核苷酸，因而选择性地抑制DNA的合成，能抑制胸腺嘧啶核苷酸掺入DNA，并能直接损伤DNA，但对RNA及蛋白质的合成并无抑制作用。作用于S期，并能使部分细胞阻滞在G1/S期的边缘，对慢性粒细胞白血病(CML)有效，并可用于对马利兰耐药的CML；对黑色素瘤、肾癌、头颈部癌有一定疗效，与放疗联合对头颈部及宫颈鳞癌有效。
青蒿为常用中药，是一年生菊科植物黄花蒿(Aretemisiaannua L.)的干燥地上部分。古本草书记述的“草蒿”及“青蒿”与“黄花蒿”无异，中药习称“青蒿”，而植物学通称为“黄花蒿”。
中药青蒿具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄的功效，在我国有两千多年的应用历史。1971年我国屠呦呦研究团队首次从中药植物黄花蒿中提取出了青蒿素(Artemisinin，ART)，并于1972年确定其化学结构为倍半萜类化合物。青蒿素是我国首创、国际认可的抗疟药物。在青蒿素的基础上，研究人员保留过氧桥活性结构，相继研制出青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***、双氢青蒿素、马来酸蒿***胺(SM934)等一系列青蒿素衍生物。
青蒿素及几种常见的青蒿素衍生物的化学结构如下：
Figure GDA0002886508600000021
近年来多项研究证实，青蒿素及其衍生物药理作用广泛，不仅对疟疾、弓形虫等寄生虫疾病有治疗作用，还具有抗炎、抗肿瘤以及免疫调节的功能，对红斑狼疮、风湿等均有显著疗效，对白血病、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、***、***癌等均有治疗作用。其作用机制主要表现为抑制细胞周期、促进细胞凋亡、铁离子介导的细胞毒作用、抗血管形成、放化疗增敏及多药耐药肿瘤细胞的逆转作用等方面。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素经硼氢化钠还原的化合物，是青蒿素的活性代谢产物。DHA抗肿瘤活性良好；值得注意的是，DHA是上述青蒿素类衍生物共有的活性代谢产物，是现有青蒿素类衍生物的典型代表。青蒿素及其衍生物潜在的临床新适应症符合当前全球疾病谱演变规律，针对当前新分子实体药物研发疲软现状，设计该类药物应用组合物蕴藏巨大开发潜力。卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲与青蒿素及其衍生物的药物组合物应用于肿瘤治疗还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够协同增效的抗肿瘤组合物。本发明的目的还在于提供一种能够协同增效的抗肿瘤组合物在制备抗肿瘤或抑制癌细胞的药物方面的应用。本发明的目的还在于提供一种具有协同增效作用的抗肿瘤药物。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种抗肿瘤组合物，包括第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分，所述第一抗肿瘤组分为卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的组合或卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的盐；所述第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，所述第一抗肿瘤组分与双氢青蒿素的摩尔比为1-10：1-20；或者所述第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物，所述第一抗肿瘤组分与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1-10：1-20，所述能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物为青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合。
本发明的抗肿瘤组合物采用的第一抗肿瘤组分为卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的组合，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素或青蒿素或代谢能产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物，使得两种抗肿瘤组分在对肿瘤细胞作用时能够相互协同，提高了对肿瘤细胞的抑制作用。第一抗肿瘤组分为抑制DNA合成类抗肿瘤化合物，其与青蒿素或青蒿素衍生物联合作用，可以优势互补，减少单药用量避免毒性反应，提高抗肿瘤活性，扩大临床适应症范围，降低或减缓产生耐药性的风险。
所述第一抗肿瘤组分为羟基脲，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，羟基脲与双氢青蒿素的摩尔比为10:1。此时的抗肿瘤组合物中的羟基脲和双氢青蒿素协同具有良好的协同增效作用，对抑制肝癌细胞有良好的作用。
第一抗肿瘤组分为羟基脲，第二抗肿瘤组分为青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合，羟基脲与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为10:1。此时的抗肿瘤组合物中的第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素，与羟基脲协同具有良好的协同增效作用，对抑制肝癌细胞有良好的作用。
所述第一抗肿瘤组分为卡培他滨，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，卡培他滨与双氢青蒿素的摩尔比为1:2。此时的抗肿瘤组合物中的卡培他滨和双氢青蒿素协同具有良好的协同增效作用，对白血病有良好的治疗作用。
第一抗肿瘤组分为卡培他滨，第二抗肿瘤组分为青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合，卡培他滨与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1:2。此时的抗肿瘤组合物中的第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素，与卡培他滨协同具有良好的协同增效作用，对白血病有良好的治疗作用。
所述第一抗肿瘤组分为氟达拉滨，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，氟达拉滨与双氢青蒿素的摩尔比为1:10-20。此时的抗肿瘤组合物中氟达拉滨与双氢青蒿素协同具有良好的协同增效作用，对白血病、乳腺癌、结肠癌均有较好的治疗作用。
第一抗肿瘤组分为氟达拉滨，第二抗肿瘤组分为青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合，氟达拉滨与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1:10-20。此时的抗肿瘤组合物中第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素，与氟达拉滨协同具有良好的协同增效作用，对白血病、乳腺癌、结肠癌均有较好的治疗作用。
一种上述的抗肿瘤组合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。由于上述的抗肿瘤组合物中的两种抗肿瘤组分具有协同增效作用，将该抗肿瘤组合物用来制备抗肿瘤药物，对肿瘤细胞具有较好的抑制作用，具有良好的抗肿瘤效果。
一种上述的抗肿瘤组合物在制备抑制癌细胞药物方面的应用，所述癌细胞为白血病、结肠癌、肝癌、乳腺癌细胞中的至少一种。本发明的抗肿瘤组合物对白血病、结肠癌、肝癌、乳腺癌细胞有明显的作用，能够用来制备抑制癌细胞的药物。
一种抗肿瘤药物，包括主药和辅料，所述主药包括第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分，所述第一抗肿瘤组分为卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的组合或卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的盐；所述第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，所述第一抗肿瘤组分与双氢青蒿素的摩尔比为1：1-20；或者所述第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物，所述第一抗肿瘤组分与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1：1-20，所述能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物为青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合。本发明的抗肿瘤药物具有良好的抗肿瘤作用。
附图说明
图1为本发明的抗肿瘤组合物的实施例1作用于慢性粒细胞白血病K562细胞的试验结果示意图；
图2为本发明的抗肿瘤组合物的实施例2作用于慢性粒细胞白血病K562细胞的试验结果示意图；
图3为本发明的抗肿瘤组合物的实施例4作用于慢性粒细胞白血病K562细胞的试验结果示意图；
图4为本发明的抗肿瘤组合物的实施例3作用于乳腺癌细胞的试验结果示意图；
图5为本发明的抗肿瘤组合物的实施例3作用于结肠癌细胞的试验结果示意图；
图6为本发明的抗肿瘤组合物的实施例3作用于肝癌细胞的试验结果示意图。
具体实施方式
本发明的抗肿瘤组合物包括第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分，所述第一抗肿瘤组分为卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的组合或卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的盐；所述第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素，所述第一抗肿瘤组分与双氢青蒿素的摩尔比为1-10：1-20；或者所述第二抗肿瘤组分为青蒿素或能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物，所述第一抗肿瘤组分与青蒿素或第二抗肿瘤组分代谢产生的双氢青蒿素的摩尔比为1-10：1-20，所述能够代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物为青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种或几种的组合。
本发明的抗肿瘤药物包括主药和辅料，其中主药为上述抗肿瘤组合物。本发明的抗肿瘤组合物和抗肿瘤药物中的第二抗肿瘤组分可以是双氢青蒿素或代谢产生双氢青蒿素的抗肿瘤化合物，当第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素时，第一抗肿瘤组分与第二抗肿瘤组分的摩尔比直接采用第一抗肿瘤组分与双氢青蒿素的摩尔比计量。当第二抗肿瘤组分不是双氢青蒿素而是代谢能够产生双氢青蒿素的化合物时，以该化合物代谢产生的双氢青蒿素的摩尔数来进行计量。当第二抗肿瘤组分为青蒿素时，直接以青蒿素的摩尔数来进行计量。
本发明的抗肿瘤组合物和抗肿瘤药物中的卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲中的一种或几种的盐为盐酸盐、草酸盐、柠檬酸盐或甲磺酸盐，也可以为钠盐、钾盐或镁盐。
本发明的抗肿瘤药物包括主药和辅料。辅料可以根据药物制剂的剂型，采用现有技术中的辅料，如填充剂、润湿剂、粘合剂等。例如，当剂型为片剂或者胶囊时，辅料可以为糊精、淀粉、蔗糖等。
本发明的抗肿瘤药物的制备方法没有限制，可以将两种抗肿瘤组分直接混合做成制剂，或分别和\或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规方式包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合做成制剂。
本发明的抗肿瘤药物可以为适于胃肠道给药的药物制剂，也可以为非胃肠道给药的药物制剂。优选为胃肠道给药的药物制剂。
本发明的抗肿瘤组合物及抗肿瘤药物中的第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分在给药时可以同时给药，也可以以任何先后顺序分开给药。对于分开给药的方式，两者给药的时间间隔没有特别要求，优选的，二者给药的时间间隔不超过一天。或者也可以采取两种组分交替给药的方式。
本发明的抗肿瘤药物中的第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分同时给药的方案中，第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分可以制成包含这两种组分的同一种制剂，如片剂或胶囊。也可以将两种组分制成分别包含这两种组分的两种不同的药物制剂，如片剂或胶囊，此时可以将两种制剂按照常规方法包装或组合在一起，患者可按照药品说明书提示同时服用。
本发明的抗肿瘤药物的第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分先后给药的方案中，可以将第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分制成分别包含这两种组分的两种不同的药物制剂，如片剂或胶囊，此时可以将两种制剂按照常规方法包装或组合在一起，患者可按照药品说明书提示的先后顺序先后服用。也可以将采用常规方法将上述两种组分制成一种控释的制剂，先释放一种组分，然后再释放另一种组分，患者只需要服用该控释制剂即可。
本发明的抗肿瘤药物的第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分交替给药的方案中，可以将第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分分别制成不同的制剂，将两种制剂按照常规方法包装或组合在一起，患者可按照药品说明书提示的交叉顺序进行服用。或者将上述两种组分制成交叉释放的控释制剂，患者只需要服用该控释制剂即可。
本发明的抗肿瘤药物为溶液剂时，溶剂可以为蓖麻油、医用玉米油、乙醇、吐温-80中的一种。优选的，当第二抗肿瘤组分为青蒿琥酯时，将抗肿瘤组分与碳酸氢盐、水混合制成注射剂。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明。
下面实施例中采用的实验材料及仪器如下：
1)实验材料。
细胞株：
本发明所采用的肿瘤细胞株慢性粒细胞白血病K562细胞及人乳腺癌细胞MCF-7，购自中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心；采用的人肝癌细胞HepG2、结肠癌细胞HT29由中国中医科学院中药研究所李琦教授惠赠。
2)实验仪器：
本发明所采用的二氧化碳培养箱由Thermo公司生产，多功能酶标仪由MolecularDevices公司生产。
3)实验试剂：
本发明所采用的细胞培养基及胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司，0.25％胰酶、青链霉素购自Hyclone公司，CCK8检测试剂购自日本同仁化学试剂公司。
双氢青蒿素(DHA)购自重庆华方武陵山制药有限公司。
卡培他滨(2C)、氟达拉滨(4F)、羟基脲(5H)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
抗肿瘤组合物的实施例1
本实施例的抗肿瘤组合物由第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分组成，第一抗肿瘤组分为卡培他滨(2C)，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素(DHA)，第一抗肿瘤组分与第二抗肿瘤组分的摩尔比为1：2。
抗肿瘤组合物的实施例2
本实施例的抗肿瘤组合物由第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分组成，第一抗肿瘤组分为氟达拉滨(4F)，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素(DHA)，第一抗肿瘤组分与第二抗肿瘤组分的摩尔比为1：20。
抗肿瘤组合物的实施例3
本实施例的抗肿瘤组合物由第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分组成，第一抗肿瘤组分为氟达拉滨(4F)，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素(DHA)，第一抗肿瘤组分与第二抗肿瘤组分的摩尔比为1：10。
抗肿瘤组合物的实施例4
本实施例的抗肿瘤组合物由第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分组成，第一抗肿瘤组分为羟基脲(5H)，第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素(DHA)，第一抗肿瘤组分与第二抗肿瘤组分的摩尔比为10：1。
抗肿瘤药物的实施例1
本实施例的抗肿瘤药物为混合物，由上述抗肿瘤组合物的实施例1-4中的第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分按照对应摩尔比直接混合后得到。
抗肿瘤药物的实施例2
本实施例的抗肿瘤药物为片剂，包括主药和辅料，主药为上述抗肿瘤组合物的实施例1-4中的抗肿瘤组合物，辅料为现有技术中常用的辅料。
试验例
下面试验例中双氢青蒿素(DHA)溶液、卡培他滨(2C)溶液、氟达拉滨(4F)溶液、羟基脲(5H)溶液均为培养基溶液，培养基溶液中DMSO体积百分比不大于0.5％。
(1)作用于慢性粒细胞白血病K562细胞的试验
取慢性粒细胞白血病K562细胞用含10％(质量分数)的FBS、100U/mL的青链霉素的DMEM培养基在37℃温度下、5％(体积百分比)的CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25％的胰酶消化液消化制备单细胞悬液，以每孔8000个细胞的浓度接种于96孔板中。
培养12小时后用50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.562μmol/L、0.781μmol/L的双氢青蒿素(DHA)溶液以及12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.56μmol/L、0.78μmol/L、0.39μmol/L、0.195μmol/L的卡培他滨(2C)溶液、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.63μmol/L、0.31μmol/L、0.156μmol/L、0.078μmol/L、0.039μmol/L的氟达拉滨(4F)溶液、500μmol/L、250μmol/L、125μmol/L、62.5μmol/L、31.25μmol/L、15.62μmol/L、7.81μmol/L的羟基脲(5H)溶液分别作用于培养后的细胞，并用上述双氢青蒿素(DHA)溶液与卡培他滨(2C)分别以摩尔比2:1联合作用于培养后的细胞、用上述双氢青蒿素(DHA)溶液与氟达拉滨(4F)分别以摩尔比20:1联合作用于培养后的细胞、用上述双氢青蒿素(DHA)溶液与羟基脲(5H)分别以摩尔比1:10联合作用于培养后的细胞。以相同体积分数的DMSO逐级倍比稀释作为对照。
作用48h后，每孔加入10μL的CCK8检测试剂，继续培养2h。用全波长酶标仪检测OD450nm处的吸光值，然后根据如下公式计算抑制率：
抑制率(GI)＝(C-T)/C*100％，其中C为对照组肿瘤细胞活性，T为药物治疗组肿瘤细胞活性。
应用Calcusyn软件计算联合用药指数(Combination Index，CI)，根据Chou-Talaly定义，CI＜1表示两药(组分)协同增效，CI＝1表示两药(组分)具有叠加效应，CI＞1表示两药(组分)具有拮抗作用。
两药联用Chou-Talaly公式为CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2(公式及各参数的含义可参考文献：Chou T C.Theoretical basis，experimental design，and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].Pharmacological Reviews，2006，58(3):621-681.)。
结果如表1及图1、图2、图3所示。
表1作用于慢性粒细胞白血病K562细胞的试验结果
用药类别 浓度(μM) 抑制率(％) CI
DHA 1.563 34.17 -
2C 0.781 3.63 -
DHA+2C 1.563+0.781 43.18 0.392
DHA 6.25 51.94 -
2C 3.125 3.95 -
DHA+2C 6.25+3.125 54.43 0.536
DHA 3.125 43.4 -
2C 1.563 2.15 -
DHA+2C 3.125+1.563 48.31 0.479
DHA 6.25 51.94 -
2C 3.125 3.95 -
DHA+2C 6.25+3.125 54.43 0.536
DHA 1.563 34.17 -
4F 0.078 0.1 -
DHA+4F 1.563+0.078 40.84 0.492
DHA 3.125 43.4 -
4F 0.156 1.47 -
DHA+4F 3.125+0.156 51.15 0.366
DHA 3.125 43.4 -
5H 31.25 8.8 -
DHA+5H 3.125+31.25 47.48 0.554
由表1和图1、图2、图3可知，卡培他滨(2C)、氟达拉滨(4F)、羟基脲(5H)在适当浓度范围内与DHA有明显的协同增效作用。
(2)作用于乳腺癌细胞的试验
取人乳腺癌MCF-7细胞用含10％(质量分数)的FBS、100U/mL的青链霉素的DMEM培养基在37℃温度下、5％(体积百分比)的CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25％的胰酶消化液消化制备单细胞悬液，以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中。
培养12小时后用200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L的双氢青蒿素(DHA)溶液、20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.63μmol/L、0.31μmol/L的氟达拉滨(4F)溶液分别作用于培养后的细胞，并用上述双氢青蒿素(DHA)溶液与氟达拉滨(4F)分别以摩尔比10:1联合作用于培养后的细胞。以相同体积分数的DMSO逐级倍比稀释作为对照。
作用48h后，每孔加入10μL的CCK8检测试剂，继续培养2h。用全波长酶标仪检测OD450nm处的吸光值，然后根据如下公式计算抑制率：
抑制率(GI)＝(C-T)/C*100％，其中C为对照组肿瘤细胞活性，T为药物治疗组肿瘤细胞活性。
应用Calcusyn软件计算联合用药指数(Combination Index，CI)，根据Chou-Talaly定义，CI＜1表示两药(组分)协同增效，CI＝1表示两药(组分)具有叠加效应，CI＞1表示两药(组分)具有拮抗作用。
两药联用Chou-Talaly公式为CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2(公式及各参数的含义可参考文献：Chou T C.Theoretical basis，experimental design，and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].Pharmacological Reviews，2006，58(3):621-681.)。
结果如表2及图4所示。
表2作用于乳腺癌细胞的试验结果
用药种类 浓度(μM) 抑制率(％) CI
DHA 12.5 6.76 -
4F 1.25 60.69 -
DHA+4F 12.5+1.25 60.8 0.723
DHA 25 13.12 -
4F 2.5 76.61 -
DHA+4F 25+2.5 75.6 0.461
由表2和图4可知，氟达拉滨(4F)在适当浓度范围内与DHA有明显的协同增效作用。
(3)作用于结肠癌细胞的试验
取人结肠癌HT29细胞用含10％(质量分数)的FBS、100U/mL的青链霉素的DF-12培养基在37℃温度下、5％(体积百分比)的CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25％的胰酶消化液消化制备单细胞悬液，以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中。
培养12小时后用100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.563μmol/L的双氢青蒿素(DHA)溶液以及10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.63μmol/L、0.31μmol/L、0.156μmol/L的氟达拉滨(4F)溶液分别作用于培养后的细胞，并用上述双氢青蒿素(DHA)溶液与氟达拉滨(4F)分别以摩尔比10:1联合作用于培养后的细胞。以相同体积分数的DMSO逐级倍比稀释作为对照。
作用48h后，每孔加入10μL的CCK8检测试剂，继续培养2h。用全波长酶标仪检测OD450nm处的吸光值，然后根据如下公式计算抑制率：
抑制率(GI)＝(C-T)/C*100％，其中C为对照组肿瘤细胞活性，T为药物治疗组肿瘤细胞活性。
应用Calcusyn软件计算联合用药指数(Combination Index，CI)，根据Chou-Talaly定义，CI＜1表示两药(组分)协同增效，CI＝1表示两药(组分)具有叠加效应，CI＞1表示两药(组分)具有拮抗作用。
两药联用Chou-Talaly公式为CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2(公式及各参数的含义可参考文献：Chou T C.Theoretical basis，experimental design，and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].Pharmacological Reviews，2006，58(3):621-681.)。
结果如表3及图5所示。
表3作用于结肠癌细胞的试验结果
用药种类 浓度(μM) 抑制率(％) CI
DHA 6.25 1.97 -
4F 0.625 32.31 -
DHA+4F 6.25+0.625 36.43 0.465
DHA 12.5 1.17 -
4F 1.25 45.31 -
DHA+4F 12.5+1.25 47.36 0.57
由表3和图5可知，氟达拉滨(4F)在适当浓度范围内与DHA有明显的协同增效作用。
(4)作用于肝癌细胞的试验
取人肝癌HepG2细胞用含10％(质量分数)的FBS、100U/mL的青链霉素的RPMI1640培养基在37℃温度下、5％(体积百分比)的CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期，用0.25％的胰酶消化液消化制备单细胞悬液，以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中。
培养12小时后用200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L的双氢青蒿素(DHA)溶液以及20μmol/L、10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25μmol/L、0.63μmol/L、0.31μmol/L的氟达拉滨(4F)溶液分别作用于培养后的细胞，并用上述双氢青蒿素(DHA)溶液、氟达拉滨(4F)溶液分别以摩尔比10:1联合作用于培养后的细胞。以相同体积分数的DMSO逐级倍比稀释作为对照。
作用48h后，每孔加入10μL的CCK8检测试剂，继续培养2h。用全波长酶标仪检测OD450nm处的吸光值，然后根据如下公式计算抑制率：
抑制率(GI)＝(C-T)/C*100％，其中C为对照组肿瘤细胞活性，T为药物治疗组肿瘤细胞活性。
应用Calcusyn软件计算联合用药指数(Combination Index，CI)，根据Chou-Talaly定义，CI＜1表示两药(组分)协同增效，CI＝1表示两药(组分)具有叠加效应，CI＞1表示两药(组分)具有拮抗作用。
两药联用Chou-Talaly公式为CI＝(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2(公式及各参数的含义可参考文献：Chou T C.Theoretical basis，experimental design，and computerizedsimulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].Pharmacological Reviews，2006，58(3):621-681.)。
结果如表4及图6所示。
表4作用于肝癌细胞的试验结果
Figure GDA0002886508600000121
Figure GDA0002886508600000131
由表4和图6可知，氟达拉滨(4F)在适当浓度范围内与DHA有明显的协同增效作用。
当第二抗肿瘤组分为青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚、蒿***中的一种时，由于其与双氢青蒿素的结构相似性，其在适当浓度范围内也与卡培他滨、氟达拉滨、羟基脲有协同增效作用。

Claims (4)

1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括第一抗肿瘤组分和第二抗肿瘤组分，所述第二抗肿瘤组分为双氢青蒿素；所述第一抗肿瘤组分为氟达拉滨，氟达拉滨与双氢青蒿素的摩尔浓度分别为0.078、1.563μM或0.156、3.125μM或0.625、6.25μM或1.25、12.5μM；或者，所述第一抗肿瘤组分为羟基脲，羟基脲与双氢青蒿素的摩尔浓度分别为31.25、3.125μM。
2.一种如权利要求1所述的抗肿瘤组合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
3.一种如权利要求1所述的抗肿瘤组合物在制备抑制癌细胞药物方面的应用，其特征在于，所述癌细胞为白血病、结肠癌、肝癌细胞中的至少一种。
4.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括主药和辅料，所述主药为如权利要求1所述的抗肿瘤组合物。
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