CN109479717A - 一种珍珠彩桂外植体消毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，包括珍珠彩桂外植体材料选择、珍珠彩桂外植体处理、珍珠彩桂外植体培养等步骤。本发明的最佳处理方法为流水中冲洗30 min、2 wt%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min、无菌水冲洗3遍、75wt%的酒精处理35‑50 s、无菌水冲洗3遍、0.1wt%的HgCl2消毒8 min、无菌水冲洗4‑5遍、无菌滤纸吸去外植体表面的水分。本发明方法简单易行，珍珠彩桂外植体消毒后，污染率降低至16%，成活率显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种珍珠彩桂外植体消毒的方法。
背景技术
珍珠彩桂是木樨属桂花的变种，叶子呈椭圆形有锯齿，叶片相较于普通绿叶桂花较厚。叶子可以随着四季不断变换颜色。初春嫩芽为紫红玫红，后转为桃红，进而转金黄色至白色。再由中央主叶脉开始向两边渐变绿色。直至深绿，在气候条件适宜的条件下一年四季不断有嫩芽冒出，因此整个植珠从上到下五色斑斓，姹紫嫣红。
目前，在植物外植体消毒的过程中，使用单一或两种消毒剂的较多。使用单一消毒剂处理，很难获得无菌材料；使用两种消毒剂处理，可以获得无菌外植体，但获得无菌材料无菌率不高，且在后期的组培过程中，会出现不同程度的细菌污染，甚至在培养7-10d霉菌污染率增高，致使无菌率较低；本发明通过使用三种消毒剂联合处理外植体材料，不仅可以达到彻底消毒的效果，而且可以获得较高的无菌率。使用三种消毒剂联合处理珍珠彩桂外植体，可以在一年四季随时采集材料，进行消毒处理，并可获得较高的无菌材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种珍珠彩桂外植体消毒的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，包括以下步骤：
（1）珍珠彩桂外植体材料选择：从健壮、无病虫害、生长良好的珍珠彩桂母株上选取芽点饱满、一年生、半木质化的枝条作为外植体材料，保湿处理备用；
（2）珍珠彩桂外植体处理：将步骤（1）的枝条切成0.5 cm-1.5 cm小段，去掉叶片和叶柄，在流水中冲洗30 min，用柔软的牙刷清洗外植体表面，用NaClO溶液处理后，再用酒精处理，最后用HgCl2消毒，无菌水冲洗4 - 5遍后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，装入无菌瓶中备用； 30 d后统计污染率和成活率；
（3）珍珠彩桂外植体培养条件：培养温度25±3℃,光照时间12 h d-1，光照强度3500Lux。
所述NaClO溶液处理方法为：用2wt%的NaClO溶液浸泡2 min。
所述酒精处理方法为：用75wt%的酒精处理35 s-50 s。
所述HgCl2消毒方法为：用0.1wt%的HgCl2消毒5- 11min。
本发明的优点在于：一般针对外植体消毒会使用单一或两种消毒剂进行消毒处理，本发明通过使用三种消毒剂联合处理外植体材料，不仅可以达到彻底消毒的效果，而且可以获得较高的无菌率。使用三种消毒剂联合处理珍珠彩桂外植体，可以在一年四季随时采集材料，打破了仅于春季采集外植体可获得无菌材料的局限，通过此方法，可获得较高的无菌材料，为工厂化育苗提供理论基础。利用本发明消毒方法对珍珠彩桂外植体进行消毒后，外植体污染率下降至16%，成活率显著提高，可达到73.3%，本发明效果显著，简单易行，为珍珠彩桂工厂化生产提供技术支持。
具体实施方式
下面将通过实例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
1.试验材料
供试材料来源广西桂林荔浦新林桂花苗木场。从健壮、无病虫害、生长良好的母株上选取芽点饱满、一年生、半木质化的枝条作为外植体材料，保湿处理带回组培室。
2.试验方法
将枝条切成0.5 cm - 1.5 cm，去掉叶片和叶柄，在流水中冲洗30 min，用柔软的牙刷清洗外植体表面，在2wt%的NaClO溶液中浸泡2 min，再用75wt%的酒精处理35 s和50 s两个梯度，最后用0.1wt%的HgCl2消毒5、8和11min（按表1中的处理方法进行分组处理），无菌水冲洗4 - 5遍后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，装入无菌瓶中备用。每个消毒处理三次重复，各85个茎段，共接种1530个茎段。比较不同消毒时间的灭菌效果，30 d后统计污染率和成活率。培养条件：培养温度25±3℃,光照时间12 h d-1，光照强度3500 Lux。
3.试验结果
从表1中可以看出，珍珠彩桂外植体消毒采用75wt%的酒精和0.1wt%HgCl2组合处理，随着消毒时间的延长，污染率逐渐较低。0.1wt%HgCl2灭菌时间5min时，处理1和处理4的污染率均高于20%。使用75wt%的酒精消毒35s或50s、0.1wt%HgCl2消毒8min，污染率分别是16%和17%，成活率是68.3%和73.3%，这两个处理污染率较低，成活率较高，且这两个处理间无显著差异，都可以作为珍珠彩桂外植体消毒的方法。
表1不同灭菌处理对外植体灭菌效果的影响
注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母代表差异显著（P<0.05）。
根据上述分析，珍珠彩桂最佳的消毒处理方法为：流水中冲洗30 min、2wt%的次氯酸钠溶液中浸泡2 min、无菌水冲洗3遍、75 %的酒精处理35 s或50 s、无菌水冲洗3遍、0.1wt%的HgCl2消毒8 min、无菌水冲洗4-5遍、无菌滤纸吸去外植体表面的水分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）珍珠彩桂外植体材料选择：从健壮、无病虫害、生长良好的珍珠彩桂母株上选取芽点饱满、一年生、半木质化的枝条作为外植体材料，保湿处理备用；
（2）珍珠彩桂外植体处理：将步骤（1）的枝条切成0.5 cm-1.5 cm小段，去掉叶片和叶柄，在流水中冲洗30 min，用柔软的牙刷清洗外植体表面，用NaClO溶液处理后，再用酒精处理，最后用HgCl2消毒，无菌水冲洗4 - 5遍后用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，装入无菌瓶中备用； 30 d后统计污染率和成活率；
（3）珍珠彩桂外植体培养条件：培养温度25±3℃,光照时间12 h d-1，光照强度3500Lux。
2.根据权利要求1所述一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，其特征在于，所述NaClO溶液处理方法为：用2wt%的NaClO溶液浸泡2 min。
3.根据权利要求1所述一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，其特征在于，所述酒精处理方法为：用75wt%的酒精处理35 s-50 s。
4.根据权利要求1所述一种珍珠彩桂外植体消毒的方法，其特征在于，所述HgCl2消毒方法为：用0.1wt%的HgCl2消毒5- 11min。
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