CN109477135B - 样品加工设备中的细胞表面标记物-排除 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供了用于实施全血样品的定量分析的方法、设备和试剂盒。描述了所公开的方法、设备和试剂盒的各种变形。
Description
公开领域
本公开内容涉及样品加工设备,其包括多个区段以及至少一个经配置用于进行全血样品的细胞表面标记物-排除(depletion)步骤的区段。
背景
目前,在资源受限的背景下,通过病毒量测试的HIV-1定量在中心实验室中通过基于PCR的方法使用血浆样品进行。已经采用干燥血点作为替代样品类型,并且尽管这类替代物可能出于多种原因是有益的,但干燥血样对于病毒量测试的适用性是有疑问的,并且取决于使用的测定,存在于干燥血点中的原病毒DNA和细胞内病毒RNA干扰RNA定量。
在资源受限的背景下或者在不可靠地使用或不能使用静脉切开放血术或实验室设备的其他基于现场的背景下,血浆的收集和加工是具有挑战性的或不可能的。床旁测试(point of care testing)是具有促进最大数目患者的护理的潜力的替代方案,并且床旁设备可以用于分析易于使用手指或足跟刺收集且无需额外的器械加工的全血样品。然而,与血浆相比,对于全血样品,通过RT-PCR测量的HIV病毒量中存在的相关性差。全血中的白细胞的T细胞亚群具有HIV原病毒DNA、mRNA和细胞结合的病毒粒体。因此,使用全血的定量经常高于使用血浆的定量,特别是在低的滴度。这可以导致在其他情况下低于1e3拷贝/ml的临床阈值的病毒量高于1e3拷贝/ml。已经使用新鲜和冷冻的全血,以及干燥血点,观察到这些结果。
因为在资源受限的背景下收集血浆样品的困难,所以期望找到给出与血浆相当的定量结果的分子床旁病毒量测试的解决方案。
概述
本文描述的方法用于实施全血样品的病毒或肿瘤量的定量分析。所述方法中使用的全血样品包含含有病毒或肿瘤细胞表面标记物的多个细胞,并且所述方法包括:(a) 将全血样品添加到不包括滤器的设备或其组件,其中所述设备或组件包括表面,所述表面包括固定的抗病毒或抗肿瘤细胞表面标记物抗体;(b) 将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和(c) 在所述设备中测量所述排除的样品中的病毒或肿瘤量。
一方面,提供了实施全血样品的靶核酸的定量分析的方法,其中所述全血样品包含含有与所述靶核酸相关的细胞表面标记物的多个细胞,所述方法包括:(a) 将所述全血样品添加到包括限定流体流动通道的管并且包括表面的设备,所述表面包括固定的抗细胞表面标记物抗体;(b) 将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在所述流动通道中没有滤器的情况下并且在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和(c) 在所述设备中测量所述排除的样品中的靶核酸。
另一方面,提供了实施全血样品的肿瘤量的定量分析的方法,其中所述全血样品包含含有肿瘤细胞表面标记物的多个细胞,并且所述方法包括:(a) 将全血样品添加到不包括滤器的设备或其组件,其中所述设备或组件包括表面,所述表面包括固定的抗肿瘤细胞表面标记物抗体;(b) 将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和(c) 在所述设备中测量所述排除的样品中的肿瘤量。
又另一方面,提供了实施全血样品的病毒量的定量分析的方法,其中所述全血样品包含含有病毒细胞表面标记物的多个细胞,并且所述方法包括:(a) 将全血样品添加到不包括滤器的设备或其组件,其中所述设备或组件包括表面,所述表面包括固定的抗病毒细胞表面标记物抗体;(b) 将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和(c) 在所述设备中测量所述排除的样品中的病毒量。
在进一步的方面,提供了实施全血样品的病毒或肿瘤量的定量分析的方法,其中所述全血样品包含含有病毒或肿瘤的细胞表面标记物的多个细胞,所述方法包括:(a) 将所述全血样品添加到包括限定流体流动通道的管的设备,所述管包括表面,所述表面包括固定的抗细胞表面标记物抗体;(b) 将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在所述流动通道中没有滤器的情况下并且在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和(c) 在所述设备中测量所述排除的样品中的病毒或肿瘤量。
在一个实施方案中,所述设备包括放置在其中的样品预处理室,所述样品预处理室从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,并且所述混合步骤包括选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径。在一个实施方案中,所述内部区段流动通道直径在第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的25-50%之间。在一个实施方案中,所述内部区段流动通道直径是第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的约33%。在一个实施方案中,所述设备包括样品预处理室,并且所述表面是所述预处理室的内壁。在一个实施方案中,所述排除的样品包含< 2.5%的含有所述细胞表面标记物的细胞。在另一个实施方案中,所述排除的样品包含< 1%的含有所述细胞表面标记物的细胞。在一个实施方案中,所述方法进一步包括在步骤(b)后,在所述设备中,将所述排除的样品与固定有细胞表面标记物细胞的表面分离。在一个实施方案中,所述方法达到< 100拷贝/mL的病毒或肿瘤的检测极限。在一个实施方案中,所述细胞表面标记物选自:CD4、CD45、β-微球蛋白或其混合物。在某些实施方案中,所述细胞表面标记物是CD4。在一个实施方案中,所述病毒或肿瘤量测量分别与在取自提供所述全血样品的患者的血浆样品中的病毒或肿瘤量测量线性相关。
在具体实施方案中,所述方法在设备中进行,所述设备经配置以进行一种或多种病毒或肿瘤相关的靶寡核苷酸序列的核酸分析,其中所述设备包括样品预处理室,其没有滤器并且包括表面,所述表面包括固定的抗病毒或抗肿瘤细胞表面标记物抗体,所述方法包括:
a. 将全血样品添加到样品预处理室;
b. 使所述样品预处理室经历足以将所述表面和样品混合以形成排除的样品和细胞表面标记物细胞结合的表面的条件,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述病毒或肿瘤细胞表面标记物的细胞,并且所述混合在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;
c. 从所述表面分离排除的样品;
d. 将排除的样品从样品预处理室转移到所述设备的核酸分析区域;
e. 在所述设备中使排除的样品经历核酸分析;和
f. 在所述设备中检测排除的样品中的一种或多种靶寡核苷酸;和
g. 基于检测步骤(f)计算病毒或肿瘤量。
在一个实施方案中,提供了在设备中进行的方法,所述设备经配置以进行一种或多种病毒靶寡核苷酸序列的核酸分析,其中所述设备包括样品预处理室,其没有滤器并且包括表面,所述表面包括固定的抗病毒细胞表面标记物抗体,所述方法包括:
a. 将全血样品添加到样品预处理室;
b. 使所述样品预处理室经历足以将所述表面和样品混合以形成排除的样品和细胞表面标记物细胞结合的表面的条件,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述病毒细胞表面标记物的细胞,并且所述混合在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;
c. 从所述表面分离排除的样品;
d. 将排除的样品从样品预处理室转移到所述设备的核酸分析区域;
e. 在所述设备中使排除的样品经历核酸分析;和
f. 在所述设备中检测排除的样品中的一种或多种病毒靶寡核苷酸;和
g. 基于检测步骤(f)计算病毒量。
在一个实施方案中,提供了在设备中进行的方法,所述设备经配置以进行一种或多种肿瘤靶寡核苷酸序列的核酸分析,其中所述设备包括样品预处理室,其没有滤器并且包括表面,所述表面包括固定的抗肿瘤细胞表面标记物抗体,所述方法包括:
a. 将全血样品添加到样品预处理室;
b. 使所述样品预处理室经历足以将所述表面和样品混合以形成排除的样品和细胞表面标记物细胞结合的表面的条件,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述病毒细胞表面标记物的细胞,并且所述混合在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;
c. 从所述表面分离排除的样品;
d. 将排除的样品从样品预处理室转移到所述设备的核酸分析区域;
e. 在所述设备中使排除的样品经历核酸分析;和
f. 在所述设备中检测排除的样品中的一种或多种肿瘤靶寡核苷酸;和
g. 基于检测步骤(f)计算肿瘤量。
另一方面,提供了经配置用于进行全血样品中的一种或多种靶寡核苷酸序列的定量核酸分析的设备,所述全血样品包含含有细胞表面标记物的多个细胞,所述设备包括:(a) 样品预处理室,其没有滤器并且包括磁性颗粒,所述磁性颗粒包括固定的细胞表面标记物抗体;和(b) 包括一个或多个额外室的核酸分析区,所述额外室的每一个经配置用于实施所述核酸分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测;其中所述样品预处理室经配置以生成包含< 5%的含有细胞表面标记物的细胞的排除的样品。
在一个实施方案中,提供了经配置用于进行全血样品中的一种或多种靶寡核苷酸序列的定量PCR分析的设备,所述全血样品包含含有细胞表面标记物的多个细胞,所述设备包括限定流体流动通道的管和置于其中的多个区段,所述设备包括:(a) 限定样品预处理室的所述流体流动通道中的第一组区段,其从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,和固定在一个或多个所述区段中的抗细胞表面标记物抗体,其中所述样品预处理室不包括滤器;(b) 接近所述样品预处理室的限定PCR分析区域的所述流体流动通道中的第二组区段,所述PCR分析区域包括一个或多个额外区段,所述额外区段的每一个经配置用于实施所述PCR分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测;和(c) 多个挤压部件,其可操作地与所述多个区段连接并且经配置以选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径;其中所述设备经配置以在所述样品预处理室中生成排除的样品,其包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞。在具体实施方案中,所述设备包括置于其中的样品预处理室,所述样品预处理室从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,并且所述混合步骤包括选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径。在具体实施方案中,所述内部区段流动通道直径在第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的25-50%之间,并且更具体地,所述内部区段流动通道直径是第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的约33%。
在一个实施方案中,所述设备经配置用于进行全血样品中的一种或多种病毒或肿瘤靶寡核苷酸序列的定量PCR分析,所述全血样品包含含有病毒或肿瘤的细胞表面标记物的多个细胞,所述设备包括限定流体流动通道的管和置于其中的多个区段,所述设备包括:(a) 限定样品预处理室的所述流体流动通道中的第一组区段,其从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,和固定在一个或多个所述区段中的抗细胞表面标记物抗体,其中所述样品预处理室不包括滤器;(b) 接近所述样品预处理室的限定PCR分析区域的所述流体流动通道中的第二组区段,所述PCR分析区域包括一个或多个额外区段,所述额外区段的每一个经配置用于实施所述PCR分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测;和(c) 多个挤压部件,其可操作地与所述多个区段连接并且经配置以选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径;其中所述设备经配置以在所述样品预处理室中生成排除的样品,其包含<5%的含有所述细胞表面标记物的细胞。在所述设备的一个实施方案中,所述内部区段流动通道直径在第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的25-50%之间。在一个实施方案中,所述内部区段流动通道直径是第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的约33%。在一个实施方案中,所述设备具有< 100拷贝/mL的病毒或肿瘤的检测极限。在一个实施方案中,所述细胞表面标记物选自:CD4、CD45、β-微球蛋白或其混合物。在某些实施方案中,所述细胞表面标记物是CD4。
在本文公开的方法和设备的具体实施方案中,所述多个细胞包括单核细胞和T-细胞,并且所述表面结合所述单核细胞和T-细胞上的细胞表面标记物。所述排除的样品可以包含< 2.5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且更具体地< 1%的所述细胞。所述方法可以达到< 200,并且更具体地< 100拷贝/mL的靶的检测极限。所述细胞表面标记物可选自:CD4、CD45、β-微球蛋白或其混合物,并且所述表面可以是颗粒,例如磁性颗粒,或所述设备的预处理室的内壁。所述设备和方法可用于评估靶核酸的值,包括但不限于样品中HIV的病毒量,以及其他病毒的病毒量,包括但不限于肝炎(例如甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)和戊型肝炎(HEV),并且特别是乙型肝炎和丙型肝炎)、EB (EBV)、西尼罗病毒(WNV)、巨细胞病毒(CMV)、日本脑炎(JNV)、屈曲(CHIK)、登革热、BK病毒、寨卡(Zika)、巴贝虫(Babesia)及其组合。在具体实施方案中,所述设备和方法用于评估HIV、HBV或HCV的病毒量。
附图简述
图1显示示例性样品加工设备。
图2A-2B显示血浆中cobas® LIAT® HIV定量测定的动态范围。
图3A-3B显示全血中cobas® LIAT® HIV定量测定的动态范围。
图4显示血浆和全血中cobas® LIAT® HIV定量测定的检测极限(LOD)。
图5显示五名患者样品的HIV病毒量测量,包括血浆、全血(WB)和使用CD4抗体颗粒处理的全血(WB/颗粒)。CD4抗体颗粒处理改进了两个样品的病毒量相关性(编号3和5)。
图6A-6B显示CD4抗体颗粒预处理如何改进全血和血浆的病毒量相关性。在图6A中,显示了CD4抗体颗粒处理前的病毒量相关性,且在图6B中,显示了在CD4抗体预处理后的病毒量相关性。
图7A-7D显示样品加工设备的样品预处理室的配置(图7A),其经配置以进行常规裂解(图7B)、苛刻裂解(图7C)和细胞排除(图7D)。
图8A-8B显示与用于细胞排除(图8B)中的相比,用于常规和苛刻裂解(图8A)中的挤压部件电动机转速。
详述
定义
除非本文另有定义,与本公开内容共同使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地,除非上下文另有所需,单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。本文使用冠词“一”(“a”和“an”)以指一个或多于一个(即,至少一个)的冠词的语法对象。例如,“一个部件”是指一个部件或多于一个部件。
在本申请中使用的术语“检测”(“detect”, “detecting”, “detection”)和类似术语泛指发现或测定某事物的存在或不存在,以及程度、值或水平或出现的概率的方法。例如,当关于靶核酸序列使用时,术语“检测”可以表示发现或测定序列的存在、不存在、水平或值,以及存在或不存在的概率或可能性。应理解,表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量的检测。例如,定量检测包括测定样品中的HIV-相关的核酸序列的水平、值或量。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物(例如,核糖核苷酸或脱氧核糖-核苷酸),并且包括天然存在(腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)、非天然存在的和修饰的核酸。所述术语不受聚合物的长度(例如,单体数目)的限制。核酸可以是单链或双链的,并且通常将含有5'-3' 磷酸二酯键,尽管在一些情况下,核苷酸类似物可具有其他键。单体一般称作核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团,或在其结构中包含非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸、生物素化、胺化、脱氨基的、烷基化、苄化和荧光团(fluorophor)标记的核苷酸。
术语“引物”是指充当在适当条件下通过核酸聚合酶的多核苷酸链合成的起始点的短核酸(寡核苷酸)。多核苷酸合成和扩增反应一般包括适当的缓冲液、dNTPs和/或rNTPs,和一种或多种任选的辅因子,并且在适当的温度下进行。引物一般包括与靶序列至少基本互补的至少一个靶杂交的区域。这个区域的长度一般为约15至约40个核苷酸。“引物对”是指正向引物和反向引物(有时称作5'和3'引物),其与靶序列的相反链互补,并且被设计用于扩增靶序列。正向和反向引物在彼此可扩增的距离内排列在靶序列上,例如约10-5000个核苷酸,或约25-500个核苷酸。
如本文使用的,“探针”是指能够选择性地结合特别期望的靶生物分子(例如,将由所述探针结合、捕获或杂交的目标核酸序列)的任何分子。
词语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如,序列5'-A-G-T-3' (对于RNA为5'-A-G-U-3')与序列3'-T-C-A-5'(对于RNA为3'-U-C-A-5')互补。互补性可以是部分的,其中仅一些核酸按照碱基配对匹配,或者是完全的,其中所有核酸都按照碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分互补,则其被认为是对靶序列“特异的”。取决于条件,与靶序列的互补性程度对于较短核酸(例如引物)一般高于对于较长序列的(例如,高80%、90%、95%或更高)。
术语“扩增条件”或类似表述是指允许引物的杂交和模板依赖性延伸的核酸扩增反应(例如,PCR扩增)中的条件。术语“扩增子”是指核酸分子,其含有靶核酸序列的全部或片段,并且作为通过任何适合的扩增方法的体外扩增的产物形成。各种PCR条件描述于PCRStrategies(Innis等人,1995, Academic Press, San Diego, CA),第14章;PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (Innis等人Academic Press, NY,1990)中。
术语“热稳定核酸聚合酶”或“热稳定聚合酶”是指聚合酶,其当与例如来自大肠杆菌(E. coli)的聚合酶相比时,在升高的温度下相对稳定。热稳定聚合酶适合于在聚合酶链反应(“PCR”)特有的温度循环条件下使用。示例性的热稳定聚合酶包括来自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、栖热菌属物种(Thermus sp.)Z05 (参见例如美国专利号5,674,738)和栖热菌属物种Z05聚合酶的突变体、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属物种sps17、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、热泉(Hot Spring)家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)的那些,及其修饰的变形。
术语“样品”或“生物样品”是指含有或假定含有来自个体的核酸的任何组合物。该术语包括纯化或分离的细胞、组织或血液的组分,例如DNA、RNA、蛋白、无细胞部分或细胞裂解物。在具体实施方案中,对全血样品实施分析。如本文使用的,“全血样品”包括从身体抽出的血液,尚未从其中除去组分(例如血浆或血小板)。通常,除了存在抗凝剂,样品未经修饰。样品也可指其他类型的生物样品,例如血浆、血清、血液组分(血沉棕黄层(buffycoat))和干燥血点。样品也可包括从个体获得的细胞的体外培养物的成分和组分,包括细胞系。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制造品(例如包装或容器),包括固体支持体,如本文所述用于特异性地扩增、捕获、标记/转化或检测如本文所述的靶核酸序列。试剂盒可以进一步包括使用说明书、在本文所述的方法或其步骤中使用的补充试剂和/或组件或模块。
方法
本公开内容提供了实施全血样品的靶核酸序列的定量分析的方法,其中所述样品包含含有细胞表面标记物的多个细胞。在具体实施方案中,靶核酸序列是病毒的,并且细胞表面标记物是病毒细胞表面标记物。所述方法包括以下步骤:
a. 将全血样品添加到包括表面的设备,所述表面包括固定的抗细胞表面标记物抗体;
b. 将所述表面和样品在所述设备中混合以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和
c. 在所述设备中测量排除的样品中的靶核酸序列的量。
如果靶核酸序列是病毒的,则排除的样品中的靶核酸序列的量与样品中的病毒量相关。另一方面,如果靶核酸序列与肿瘤相关,则步骤(a)中在表面上使用抗肿瘤细胞表面标记物抗体,并且排除的样品中的靶核酸序列的量与样品中的肿瘤量相关。
在具体实施方案中,在不从样品过滤细胞表面标记物的情况下进行混合步骤。
在本文所述方法中测试的全血样品包含含有细胞表面标记物的多个细胞类型,包括但不限于单核细胞和T-细胞,以及巨噬细胞和树突细胞。在具体实施方案中,所述多个细胞包括单核细胞和T-细胞。
在具体实施方案中,本文所述的方法和设备用于分析HIV病毒量,并且用于本文所述方法中的HIV感染的细胞标记物可以是CD4、CD45、β-微球蛋白或其组合。在具体实施方案中,HIV感染的细胞标记物是CD4。其他的HIV感染的标记物可以包括但不限于CD27、TNFR-II、IL-12和/或CD38。所述设备和方法用于评估HIV以及其他病毒的病毒量,包括但不限于肝炎(例如甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)和戊型肝炎(HEV),并且特别是乙型肝炎和丙型肝炎)、EB (EBV)、西尼罗病毒(WNV)、巨细胞病毒(CMV)、日本脑炎(JNV)、屈曲(CHIK)、登革热、BK病毒、寨卡、巴贝虫及其组合。在具体实施方案中,所述设备和方法用于评估HIV、HBV或HCV的病毒量。
此外,本文所述的设备和方法也可用于评估任何靶核酸序列的量,其中靶序列的存在与给定细胞表面标记物相关。细胞表面标记物是在细胞表面上表达的蛋白,其充当患者中的具体疾病状态或状况特有的特异性细胞类型的标记物。例如,病毒细胞表面标记物是病毒感染的标记物,并且同样地,肿瘤细胞标记物是不同形式的癌症的标记物。如果在评价中的是病毒细胞标记物,则评估样品中的病毒量,而如果在评价中的是肿瘤细胞标记物,则评估样品中的肿瘤量。常见的肿瘤标记物包括但不限于:ALK、AFP、B2M、β-hCG、BRCA1、BRCA2、BCR-ABL、BRAF V600突变、C-kit/CD117、CA15-3/CA27.29、CA19-9、CA-125、降钙素、CEA、CD20、CgA、上皮来源的循环肿瘤细胞、细胞角蛋白片段21-1、EGFR、ER、PR、血纤蛋白、血纤蛋白原、HE4、HER2/neu、IgGs、KRAS、乳酸脱氢酶、NSE、核基质蛋白22、PD-L1、PSA、甲状腺球蛋白、uPA及其组合。此外,也可以使用本文所述的方法分析给定疾病或状况特有的其他细胞标记物。例如,可以使用本文所述的方法和设备检测母体血浆中的胎儿遗传标记物。
本文所述的方法和设备可采用对病毒的细胞表面受体特异性的抗体或其他结合试剂。术语“抗体”包括完整抗体分子(包括通过抗体亚单位的体外重新组合而组装的杂合抗体),包括抗体的抗原结合结构域的抗体片段和重组蛋白构建体(如例如Porter, R. R.和Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 (Suppl); 51-64 (1966)和Hochman, l. Inbar,D.和Givol, D. Biochemistry 12: 1130 (1973)中所述),以及已经化学修饰的抗体构建体。本文使用的抗体可以是单克隆或多克隆的。在具体实施方案中,抗体是单克隆的。此外或另一方面,所述方法和设备可采用对病毒细胞表面受体具有结合特异性的其他结合试剂。结合试剂可以是天然衍生的,或完全或部分合成的,并且包括但不限于配体、酶、寡核苷酸或适体。
因此,本文所述的表面包括细胞表面标记物的多种结合试剂。在一个实施方案中,细胞表面标记物是HIV感染的细胞标记物,包括但不限于抗-CD4、抗-CD45、抗-β-微球蛋白、抗-CD27、抗-TNFR-II、抗-IL-12和/或抗-CD38。在另一示例性的实施方案中,细胞表面标记物是肿瘤标记物,包括但不限于抗-ALK、抗-AFP、抗-B2M、抗-β-hCG、抗-BRCA1、抗-BRCA2、抗-BCR-ABL、抗-BRAF V600突变、抗-C-kit/CD117、抗-CA15-3/CA27.29、抗-CA19-9、抗-CA-125、抗降钙素、抗-CEA、抗-CD20、抗-CgA、抗上皮来源的循环肿瘤细胞、抗细胞角蛋白片段21-1、抗-EGFR、抗-ER、抗-PR、抗血纤蛋白、抗血纤蛋白原、抗-HE4、抗-HER2/neu、抗-IgGs、抗-KRAS、抗乳酸脱氢酶、抗-NSE、抗核基质蛋白22、抗-PD-L1、抗-PSA、抗甲状腺球蛋白或抗-uPA。在具体实施方案中,颗粒包括多种,例如两种或更多种不同的细胞标记物,例如以下的两种或更多种:抗-CD4、抗-CD45、抗-β-微球蛋白、抗-CD27、抗-TNFR-II、抗-IL-12和/或抗-CD38;或以下的两种或更多种:抗-ALK、抗-AFP、抗-B2M、抗-β-hCG、抗-BRCA1、抗-BRCA2、抗-BCR-ABL、抗-BRAF V600突变、抗-C-kit/CD117、抗-CA15-3/CA27.29、抗-CA19-9、抗-CA-125、抗降钙素、抗-CEA、抗-CD20、抗-CgA、抗上皮来源的循环肿瘤细胞、抗细胞角蛋白片段21-1、抗-EGFR、抗-ER、抗-PR、抗血纤蛋白、抗血纤蛋白原、抗-HE4、抗-HER2/neu、抗-IgGs、抗-KRAS、抗乳酸脱氢酶、抗-NSE、抗核基质蛋白22、抗-PD-L1、抗-PSA、抗甲状腺球蛋白或抗-uPA。
更具体地,所述表面包括多个的以下的两种或更多种:抗-CD4、抗-CD45和/或抗-β-微球蛋白。另一方面,所述表面包括抗-HIV感染的细胞标记物的均一群体。在具体实施方案中,所述表面包括多个的抗-CD4抗体;或多个的抗-CD45抗体;或多个的抗-β-微球蛋白抗体。
适合的表面包括珠或颗粒,以及位于在其中实施所述方法的设备的室(例如预处理室)的内部朝向溶液的壁上的结合表面。在一个实施方案中,所述表面包括珠或颗粒,例如常用在其他类型的基于颗粒的测定中的颗粒(包括但不限于胶体或珠),例如磁性、聚丙烯和乳胶颗粒,一般用在固相合成中的材料,例如聚苯乙烯和聚丙烯酰胺颗粒,以及一般用在层析应用中的材料,例如二氧化硅、氧化铝、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯。所述材料也可以是纤维,例如碳纤丝。颗粒可以是无生命的,或另一方面,可以包括有生命的生物实体,例如细胞、病毒、细菌等。
用于本方法的颗粒可以包含任何材料,其适合用于附着至一种或多种结合试剂并且可以通过例如离心、重力、过滤或磁性收集而被收集。可以附着至结合试剂的多种不同类型的颗粒在商业上销售,用于在结合测定中使用。这些包括非磁性颗粒,以及包含允许使用磁场收集所述颗粒的可磁化材料的颗粒。在一个实施方案中,所述颗粒包含导电和/或半导电的材料,例如胶体金颗粒。
所述颗粒可具有多种大小和形状。作为示例而非限制,颗粒可以在5纳米和100微米之间。例如,颗粒具有20 nm-10微米的大小。在具体实施方案中,颗粒为0.1 um-10 um,并且更具体地,高至5 um。例如,颗粒在1-5 um之间。颗粒可以是球形的、椭圆的、棒状的等,或者它们可以形状不规则。
在备择的实施方案中,用于实施本文所述方法的设备包括已经修饰以包括病毒表面标记物的多个固定的结合试剂的表面。在这个实施方案中,所述方法包括将全血样品添加到样品预处理室,所述样品预处理室包括在其上固定了病毒感染的细胞表面标记物的多个结合试剂的内部朝向样品的壁。随后,使预处理室经历足以形成排除的样品和包括固定的病毒表面标记物细胞的表面的条件,从而使得所述排除的样品包含< 5%的含有所述病毒细胞表面标记物的细胞。在具体实施方案中,所述使预处理室经历所述条件的步骤在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行。随后,从预处理室分离排除的样品,并转移到核酸分析区,如下文更详细地描述的。
本文所述的方法可以用于分析任何致病的HIV株,包括HIV-1和HIV-2,以及其任何组或亚型。例如,所述方法可用于分析HIV-1组M、N、O、P及其组合。在具体实例中,所述方法用于分析HIV-1组M和/或O,以及任选地一种或多种其他HIV-1组。所述方法还可以用于分析HIV-1的一种或多种亚型,包括但不限于亚型A、A1、A2、CRF19、B、C、D、F、G、CRF02_AG、H、CRF04_cpx、J、K及其组合。此外,所述方法还可以用于检测HIV-2组A-H,并且特别是HIV-2组A和B。此外,所述方法还可以用于检测乙型肝炎、丙型肝炎或CMV。
在具体实施方案中,本文所述的方法设计用于生产包含< 10%的具有细胞表面标记物的细胞的排除的样品。更具体地,所述排除的样品包含< 5%的具有细胞表面标记物的细胞,更具体地< 3%的细胞,且甚至更具体地,< 1%的具有细胞表面标记物的细胞。在进一步的具体实施方案中,本文所述的方法可以获得小于1e3拷贝/ml的全血病毒和/或肿瘤量。
样品加工设备
本文所述的方法在样品加工设备中执行,所述设备经配置以进行核酸扩增技术。从生物样品提取的核酸可以通过使用至少一种以下示例方法扩增核酸而进一步加工:聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和链置换扩增反应(SDAR)。在一些实施方案中,从生物提取的核酸可以是核糖核酸(RNA),并且其加工可以包括偶联的逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR),其使用例如Tth聚合酶和Taq聚合酶或逆转录酶和Taq聚合酶的酶组合。在一些实施方案中,可以使用T4DNA连接酶或AmpligaseTM和引导核酸,例如DNA或RNA 靶,使带切口的环状核酸探针环化,随后在体外选择过程后检测闭合环化的探针的形成。这种检测可以使用熟悉本领域的人员已知的酶通过PCR、TMA、RCA、LCR、NASBA或SDAR进行。在示例的实施方案中,可以通过使用荧光标记的核酸探针或DNA嵌入染料以及分子分析仪中的光度计或电荷偶联的设备以检测核酸扩增期间的荧光增加,来实时检测核酸的扩增。这些荧光标记的探针使用熟悉本领域的人员众所周知的检测方案(即TaqManTM,molecular beaconsTM,荧光共振能量转移(FRET)探针,scorpionTM探针),并且通常使用荧光猝灭以及猝灭的释放或从一个报道分子到另一个的荧光能量转移,来检测具体核酸的合成或存在。
在一个实施方案中,本文公开的方法在设备中进行,所述设备包括独立的(self-contained)微尺度至大尺度的通道、腔、储器、检测和加工区域。所述设备可以是药筒、设备、容器或袋,如例如美国专利号6,440,725;6,783,934;6,818,185;6,979,424;8,580,559;和8,940,526中所述的,以及设备,例如可得自Cepheid Corp.、Idaho Technology,Inc.和/或Biofire Diagnostics, Inc.的那些。
例如,本文所述的方法可以在独立的核酸分析袋中进行,所述核酸分析袋包括细胞裂解区、核酸制备区、第一阶段扩增区、第二阶段扩增区,如美国公开号201000056383的图1中所示的。所述袋包括各种大小的多种通道和泡,并且这样排列以致于使样品流过***和各种区,并因此被加工。样品加工发生在定位在袋内的各种泡中。提供许多通道以使样品在加工区内和之间移动,同时提供其他通道以向样品递送流体和试剂或从样品除去这种流体和试剂。通过压力,例如气压(pneumatic pressure),使袋中的液体在泡之间移动。在具体实施方案中,本文所述的细胞排除步骤在细胞裂解区之前的区中进行。
在备择的实例中,本文所述的方法可以在独立的核酸分析药筒中进行,如美国专利号9,322,052的图3-5和9中所示的。所述药筒除了别的以外还包括多个腔,其包括用于容纳通过入口引入的流体样品的样品腔,用于容纳洗涤溶液的洗涤腔,用于容纳裂解试剂的试剂腔,裂解腔,用于接收用过的样品和洗涤溶液的废物腔,用于容纳中和剂的中和剂腔,以及用于容纳主混合物(例如,扩增试剂和荧光探针)并且用于将试剂和探针与从流体样品分离的分析物混合的主混合物腔,反应容器和检测腔。在这个具体实施方案中,本文所述的细胞排除步骤在裂解腔之前的腔中进行。
在具体实施方案中,本文所述的方法在样品加工设备中实施,例如美国专利号7,718,421中所述的。分区段(segmented)设备,例如美国专利号7,718,421中描述的那些,提供了用于接收、储存、加工和/或分析生物样品的方便容器。在某些实施方案中,分区段设备便于涉及多个加工步骤的样品加工规程。在某些实施方案中,可以将样品收集在样品设备中,并且随后将所述设备放置在操纵所述设备及其内容物以加工样品的分析仪中。
具体实施方案包括柔性设备,其已经通过易碎密封件(seal)分区段成室。个别区段可含有用于加工样品的各种试剂和缓冲液。可以将夹具和调节器以各种组合和各种时间控制应用于设备以引导流体移动并导致易碎密封件破裂。这种易碎密封件的破裂可留下基本没有流体流动的障碍物的内部设备表面。在一个实施方案中,随加工进展,生物样品的流动可被指向设备的远端,同时可迫使废物的流动以相反方向移动,朝向样品最初被输入的设备的开口。可以通过具有锁定机构的盖密封这个样品入口,可能是永久地,并且废物腔可位于盖中以接受废物用于储存。这个方法的显著益处在于加工的样品不与已经被未加工的样品触及的表面接触。因此,可能包被设备的壁的存在于未加工的样品中的痕量反应抑制剂不太可能污染加工的样品。
样品加工设备显示于图1中,并且可包括透明柔性设备10,其能够被配置成多个区段,例如16、110、120、130、140、150、160、170、180和/或190,并且通过挤压被基本上压平。在实施方案中,设备可具有至少两个区段。在实施方案中,设备可具有至少三个区段。柔性设备可以提供大约2-105℃之间的操作功能性(functionality),与样品、靶和试剂的相容性,低透气性,最小限度的荧光性质,和/或在反复挤压和弯曲循环期间的回弹能力。所述设备可由多种材料制成,其实例包括但不限于:聚烯烃,例如聚丙烯或聚乙烯,聚氨基甲酸酯,聚烯烃共聚物,和/或提供合适特性的其他材料。
在额外的实施方案中,滤器可以嵌入在设备区段中。在一个实施方案中,可以通过堆叠多层的柔性滤器材料而形成滤器。与样品直接接触的滤器的最上层可具有选择用于过滤的孔径大小;滤器的底层可包括具有大得多的孔径大小的材料,以在过滤期间当施加压力时为最上层提供支持结构。在这个优选实施方案中,可以折叠滤器以形成袋,其开口端的边缘牢固地附着至设备壁。具有滤袋(filter bag)的区段可以能够通过挤压设备的外部而基本上被压平。
在具体实施方案中,所述样品预处理室不包括滤器。
此外,可以改造所述设备的样品入口以接收细胞排除模块,所述细胞排除模块包括结合样品中的病毒细胞标记物的病毒感染的细胞标记物固定基质或介质,从而允许排除的样品流过所述基质或介质且流入设备的样品入口。这种模块可用于进行具有介质/样品的手动混合的细胞排除方法。
在示例的实施方案中,可以将一种或多种试剂作为干燥物质和/或作为液体溶液储存在设备区段中。在试剂可以以干燥形式储存的实施方案中,可以将液体溶液储存在邻接区段中,以促进试剂溶液的重构。一般试剂的实例包括:裂解试剂、洗脱缓冲液、洗涤缓冲液、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、螯合剂、中和试剂、离液盐溶液、去污剂、表面活性剂、抗凝剂、萌发溶液(germinant solution)、异丙醇、乙醇溶液、抗体、核酸探针、肽核酸探针和硫代磷酸酯(phosphothioate)核酸探针。在试剂之一是离液盐溶液的实施方案中,优选的组分是异氰酸胍或盐酸胍或其组合。在一些实施方案中,试剂可以在设备中相对于样品通过其输入的开口储存的顺序反映了所述试剂可以用于利用管的方法中的顺序。在优选的实施方案中,试剂包括能够特异性结合样品的预选组分的物质。例如,物质可以特异性结合核酸,或核酸探针可特异性结合具有具体碱基序列的核酸。
在具体实施方案中,除了上文讨论的排除表面之外,所述设备还可包括基底,例如一种颗粒或多种颗粒,以促进核酸的选择性吸附。所述颗粒是例如,二氧化硅颗粒、磁性颗粒、二氧化硅磁性颗粒、玻璃颗粒、硝化纤维素胶体颗粒和磁化的硝化纤维素胶体颗粒。在颗粒可以是顺磁性的一些实施方案中,可以通过磁场捕获所述颗粒。可允许核酸分子选择性吸附到官能团包被的表面的试剂的实例描述于例如美国专利号5,705,628;5,898,071;和6,534,262。可以通过操纵溶液的离子强度和聚(亚烷基)二醇浓度,以选择性沉淀并可逆地吸附核酸至固相表面,来完成分离。当这些固相表面是顺磁性微粒时,可以在保留核酸但不保留其他分子的条件下,洗涤已经吸附了靶核酸分子的磁性颗粒。通过这个方法分离的核酸分子适合用于:毛细管电泳、核苷酸测序、逆转录、克隆、转染、转导、哺乳动物细胞的显微注射、基因疗法规程、RNA探针的体外合成、cDNA文库构建以及聚合酶链反应(PCR)扩增。若干公司提供基于磁性的纯化***,例如QIAGEN的MagAttractTM、Cortex Biochem的MagaZorbTM和Roche Life Science的MagNA Pure LCTM。这些产品使用带负电的颗粒,并且操纵缓冲液条件以使多种核酸与所述颗粒选择性结合,洗涤颗粒,并在水性缓冲液中洗脱颗粒。这些公司使用的很多产品使用离液盐以帮助核酸沉淀到磁性颗粒上。实例描述于美国专利号4,427,580;4,483,920;和5,234,809。
优选的示例性实施方案可包括2个或更多的设备区段110、120、130、140、150、160、170、180和/或190的线性排列(图1)。线性排列便于以受控方式移动样品和作为结果而产生的废物和靶通过管。可以通过设备的第一区段110中的第一开口12输入样品,例如全血样品。此后,可以将来自加工的样品的废物朝第一开口向后移动,同时将靶推向相反端,从而使靶被可能已附着至设备壁的反应抑制剂的污染最小化,并将靶限制在设备的清洁区段,其可含有用于靶的进一步操作的合适试剂。一些实施方案可使用多个区段,每一个区段都含有至少一种试剂。在一些实施方案中,这些区段可以以下顺序含有试剂:第二区段可以包括包含固定的结合试剂的排除颗粒和/或表面和稀释缓冲液;第三区段可划分成两个分段,第一分段包括蛋白酶K且第二分段包括二氧化硅磁珠或其他合适的颗粒;第四区段中的试剂可以是裂解试剂;第五区段中的试剂可以是洗涤缓冲液;第六至第八区段中的试剂可以是洗涤缓冲液、中和试剂、悬浮缓冲液、洗脱试剂或核酸扩增和检测试剂。在一些实施方案中,区段可以连续排列,而在其他实施方案中,这些区段可以通过位于其间的另一区段或多个区段分开。
在一些实施方案中,预期通过使用在上述段落中描述的装置从生物样品提取核酸的方法。在某些实施方案中,在此种测试中的事件的顺序可包括:1) 使用收集工具收集生物样品,2) 柔性设备,其可以包括多个可含有在测试期间所需的试剂的区段,并且可使用设备中的第一开口将收集的样品放置在其中,3) 可设定在受控温度和/或其他条件以在设定的温育时间段期间捕获靶生物或核酸的至少一个基底,4) 未加工的样品中的生物或分子,其可能不结合基底并且可因此通过将液体转移至废物储器而被除去,5) 在废物储器中储存废物,其可以通过挤压在设备上的夹具和/或调节器而与靶分开,6) 从设备的另一区段释放的洗涤缓冲液,其可以除去反应抑制剂,7) 来自另一区段的洗脱试剂,其可以在于受控温度温育后,释放与基底结合的靶,和8) 可以通过熟悉本领域的人员众所周知的技术检测,或通过设备中的第二开口收集的核酸。在示例的实施方案中,随着测试进展,样品的流动可以是从第一开口朝向设备的远端,同时废物的流动可以是朝向设备的关闭的样品输入开口,在那里设备的盖中的废物腔接收废物用于储存。因此,避免了加工的样品与反应容器中已经被未加工的样品触及的表面之间的不期望的接触,从而预防由于存在于未加工的样品中并且可能包被反应容器壁的痕量反应抑制剂导致的反应抑制。
一些实施方案可包含以下的使用来加工样品:试管1,其具有分成多个区段(例如区段16、110、120、130、140、150、160、170、180和/或190)的柔性设备10,其可以横切所述设备的纵轴,并且其可含有试剂,例如试剂210、221、222、230、240、250、260、270、280和/或290;以及分析仪,其可具有多个挤压部件,例如调节器312、322、332、342、352、362、372、382和/或392,夹具,例如夹具310、320、330、340、350、360、370、380和/或390,以及块体,例如314、344和/或394 (为简单起见,其他未编号);与调节器和夹具相对。这些调节器、夹具和/或块体的各种组合可以用于有效地夹紧闭合的设备,从而分开流体。在示例的实施方案中,至少一个调节器或块体可具有热控制部件以控制用于样品加工的设备区段的温度。样品加工装置可进一步具有至少一个能够向区段施加磁场的磁场源430。样品加工装置可进一步具有检测设备492,例如光度计或CCD,以监控设备内发生或完成的反应。
通过使用中心定位的调节器,及其侧翼夹具(如果有的话)挤压设备,以形成通过每个区段的具有约1至约500 um,优选约5至约500 um的间隙的流动通道,可以驱动流体通过流动通道。邻近的调节器温和挤压与流动通道液体连通的邻近区段,以产生补偿内部压力,以确保流动通道的基本均匀的间隙。随后,两个侧翼调节器可以交替地在其各自区段上在设备上挤压和释放压力,以生成受控流速的流动。可以包含任选的流动、压力和/或力传感器以使得流动行为的闭环(closed-loop)控制成为可能。流动通道方法可以用于洗涤、增强基底结合效率和检测。
颗粒固定和重悬浮方法可用于从样品液体分离颗粒。可以将通过磁性源430 (图1)生成的磁场施加至含有磁性颗粒悬浮液的区段,以将颗粒捕获并固定到管壁。在捕获过程期间,可以使用搅拌方法。在另一实施方案中,可以在具有施加的磁场的区段中形成流动通道,并且可以在流动中捕获磁性颗粒以提高捕获效率。为了重悬浮固定的颗粒,可以关闭或除去磁场,并且可以使用搅拌或流动通道方法用于重悬浮。
在某些实施方案中,从生物样品提取的核酸可以通过使用至少一种以下方法扩增核酸而进一步加工:聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和链置换扩增反应(SDAR)。在一些实施方案中,从生物提取的核酸可以是核糖核酸(RNA),并且其加工可以包括偶联的逆转录和聚合酶链反应(RT-PCR),其使用例如Tth聚合酶和Taq聚合酶或逆转录酶和Taq聚合酶的酶组合。在一些实施方案中,可以使用T4 DNA连接酶或AmpligaseTM和引导核酸,例如DNA或RNA 靶,使带切口的环状核酸探针环化,随后在体外选择过程后检测闭合环化的探针的形成。这种检测可以使用熟悉本领域的人员已知的酶通过PCR、TMA、RCA、LCR、NASBA或SDAR进行。在示例的实施方案中,可以通过使用荧光标记的核酸探针或DNA嵌入染料以及分子分析仪中的光度计或电荷偶联的设备以检测核酸扩增期间的荧光增加,来实时检测核酸的扩增。这些荧光标记的探针使用熟悉本领域的人员众所周知的检测方案(即TaqManTM,molecular beaconsTM,荧光共振能量转移(FRET)探针,scorpionTM探针),并且通常使用荧光猝灭以及猝灭的释放或从一个报道分子到另一个的荧光能量转移,来检测具体核酸的合成或存在。
可以通过使用连接至块体(例如块体490)的传感器492 (图1),例如光度计、分光计、CCD,实现对来自设备区段的信号的实时检测。在示例的实施方案中,可以通过调节器392在设备区段190上施加压力,以适当地限定设备区段的形状。信号的形式可以是特定波长的光(例如荧光)的强度、波谱和/或图像,例如细胞或人造部件例如量子点的图像。对于荧光检测,可以使用来自光学***的光激发照射反应,并且可以通过光度计检测发射光。为了检测具有具体波长的多个信号,可以通过专用检测通道或分光计,连续或平行地检测不同的波长信号。
试剂盒
在一些实施方案中,用于执行本发明公开的方法的试剂、材料和设备包括在试剂盒中。在一些实施方案中,试剂盒包括用于获得、储存和/或制备样品的组分。这种组分包括例如无菌针和注射器、排除模块、衬EDTA的管、缓冲液(例如,用于使核酸结合和从基质洗脱)、RNA酶抑制剂和/或DNA酶等。
此外,试剂盒包括测定加工设备,例如上文所述的,以及任选地,用于获得、储存和/或制备样品的一种或多种组分,包括但不限于如上文所述的排除模块。在具体实施方案中,测定加工设备包括储存在所述设备的一个或多个区段中的执行本文公开的方法所需的各种试剂。
试剂盒可进一步包括对照,例如待检测的序列为野生型的多核苷酸,或包括待检测的序列的多核苷酸。
试剂盒还可以包括额外的设备,例如样品管或小瓶;反应容器(例如,管、多孔板、微观流体(microfluidic)芯片或腔等),以及使用说明或网站参考。
实施例
实施例1:从全血分离并检测病毒RNA
RNA分离和RNA序列检测可以在管1 (图1)中完成,其包括具有通过可剥密封件分开的九个区段并含有预装试剂的柔性设备,和具有安置在其中的废物储器的盖。如本文所述,通过在所述设备的一个或多个区段或分段内可操作地连接的一个或多个调节器和夹具的选择性衔接,控制从所述设备的一个区段或分段向另一个的流体流动。所述设备的第一区段可以接受全血样品。第二区段含有560 ug的缀合至抗-CD4抗体的Dynal Particles™(Dynal Biotech),其悬浮在具有100 ul 的磷酸缓冲盐水(PBS) (137 mM NaCl、2.7 mMKCl、4.3 mM Na2HPO4、1.4 mM KH2PO4,pH 7.3)的稀释缓冲液中。第三区段含有定量标准物。第四区段划分成两个分段,第一分段含有200 ug蛋白酶K,且第二分段包括250 ug二氧化硅磁性颗粒,其中所述分段通过可剥密封件分开。第五区段含有200 ul的包含离液盐的裂解缓冲液,其含有4.7 M盐酸胍、10 mM尿素、10 mM Tris HCl,pH 5.7, 和2% triton X-100。第六区段含有80 ul的洗涤缓冲液(包括例如50%乙醇,20 mM NaCl,10 mM Tris HCl,pH7.5)。第七区段含有80 ul的20 mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液,pH 5.3。MES缓冲液的pH经过调整,从而使其可以足够低以避免从颗粒洗脱DNA。第八区段含有40 ul洗脱缓冲液(例如,10 mM Tris HCl,pH 8.5,或适合用于PCR的任何缓冲液)。洗脱缓冲液的pH经过调整,从而使其可以足够高以将DNA从颗粒表面洗脱到缓冲液中。第九区段含有PCR试剂(其可以含有每一种各10 nmol的dATP、dCTP和dGTP;20 nmol dUTP,2.5 mmol的KCl,200 nmol的MgCl2,1-5单位的Taq DNA聚合酶,1-5单位的Tth DNA聚合酶,各20-100 pmol 的寡核苷酸引物,和6-25 pmol的TaqMan探针)。第十区段可含有二价金属辅因子,例如MgCl2。第九(或第十)区段的末端可以被永久密封或含有用于收集扩增反应的产物的压力门,以通过DNA测序或本领域技术人员已知的一些其他测试确认基因型分型测试的结果。
对于病毒RNA分离和检测,将100 ul的全血加载至第一区段中。随后,可以将设备通过盖封闭并***分析仪中。样品加工可包括以下步骤。
(a) 细胞排除和样品裂解。除第一夹具外,将设备上的所有夹具都关闭。与第一区段可操作地连接的调节器用于调整血液体积,以在区段中保持约100 ul,并且随后,使用有关的区段夹具封闭第一区段。与第二区段可操作地连接的调节器,完全或部分地挤压第二区段的第一分段,以破坏第一、第二和第三区段之间的可剥密封件,并将抗-CD4颗粒与样品和定量标准物混合。与第一分段可操作地连接的调节器可以交替地挤压所述分段,以将颗粒与样品混合。随后,可以通过靠近第三区段的磁性源生成磁场以捕获颗粒。通过衔接该区段/分段中有关的调节器和夹具,将细胞排除的样品移动至第四区段,关闭第四区段之上的夹具,以防止排除的细胞与下游排除的样品混合,并且随后移动至第五区段,以将裂解缓冲液与细胞排除的样品混合。第四和第五区段中的混合物在50℃温育2分钟。
(b) 核酸捕获。在裂解温育后,调节器交替地挤压其各自的区段,以将混合物在室温搅拌并温育2分钟,以促进DNA与颗粒的结合。随后,通过靠近区段的磁性源生成磁场,以捕获悬浮液中的颗粒。调节器可交替地挤压区段以捕获颗粒。调节器和夹具序贯地打开和关闭,以将未结合样品和废物移动至废物储器。
(c) 洗涤。洗涤过程在捕获过程之后发生,以从将用于进一步样品加工的颗粒以及区段除去残余碎片和反应抑制剂。基于稀释的洗涤与乙醇洗涤缓冲液一起使用,并且基于流动的洗涤与MES洗涤缓冲液一起使用。首先打开夹具和调节器,并且随后关闭调节器以将乙醇缓冲液移动至第六区段,随后关闭夹具。除去磁场;调节器和至少一个邻近的调节器交替地挤压其各自的区段,以生成流动以重悬浮所述颗粒。随后,打开磁场以捕获基本所有的颗粒,并且将液体移至废物储器。完成第一次洗涤后,将MES洗涤缓冲液从一个区段移动至另一个,并且使用相应调节器和夹具的序贯应用和释放来操纵缓冲液,以确保洗涤缓冲液通过流动通道的基本层流。洗涤完成时,关闭调节器和夹具,并且将基本上所有的废物移动至废物储器。
(d) 核酸洗脱。使用如上文所述类似的过程,将洗脱缓冲液从第八区段移动。可以除去磁场,并且在第四和第五区段之间流动期间,将颗粒重悬浮在洗脱缓冲液中。将颗粒悬浮物在稳流或搅拌条件下于95℃温育2分钟。随后,打开磁场并固定基本所有的颗粒,并可以通过序贯打开和关闭调节器和夹具,将洗脱的核酸溶液移动至第八区段。调节器可以挤压第八区段,以将洗脱的核酸溶液的体积调整至40 ul,并且随后可以关闭对设备的夹具,以完成DNA提取过程。
(e) 核酸扩增和检测。随后,可以将核酸溶液转移至第九区段,混合,并与UNG 280于37℃温育1分钟,以降解可能已存在于生物样品中的任何污染PCR产物。温育后,可将温度提高至95℃,以将核酸和UNG变性2分钟。随后,可以将核酸溶液转移至第十区段,并与RT-PCR试剂于65℃混合10分钟,随后于60℃温育,以启动热启动PCR。通过将第八区段设定在95℃且将第九区段设定在60℃,并通过关闭和打开有关的调节器,使反应混合物在区段之间交替地转移,可以实施95℃ 2秒和60℃ 15秒的50个循环的典型2-温度扩增测定。通过将第八区段设定在95℃、将第九区段设定在72℃且将第十区段设定在60℃,并通过关闭和打开有关的调节器,使反应混合物在区段之间交替地转移,可以实施95℃ 2秒、60℃ 10秒和72℃ 10秒的50个循环的典型3-温度扩增测定。任选地连接至第九腔的检测传感器,例如光度计,可以监控通过设备壁的一部分的来自报道染料的实时荧光发射。测定完成后,报告测试结果。
实施例 2:离线CD4排除和分析
使用Roche cobas® 6800/8800 HIV-定量校准实验对象组(panel)测定血浆动态范围。下表1中提供了实验对象组的组分。
表1:Roche HIV-1定量校准实验对象组
对每个Roche实验对象组成员都在cobas® LIAT®分析仪上测试三次重复。为了在cobas® LIAT®分析仪上运行测试,将100 uL的每个实验对象组成员材料与100 uL的稀释缓冲液(1x PBS,0.1% BSA,0.1%叠氮化钠)混合,并且随后将稀释的材料添加到预先装填了如下文所述的测定试剂的cobas® LIAT®设备。在cobas® LIAT®分析仪中分析所述设备,并且在测定完成时,将Ct和靶输入水平用于动态范围回归分析。结果显示在图2A-2B中,其显示血浆中的6 log线性(log linearity),并且HIV对测定的定量标准物性能没有抑制。
对于全血动态范围,将Roche HIV-1定量校准实验对象组成员(参见表2)用汇合的正常人EDTA全血以1:20比例掺料。例如,为了制备掺料入HIV-1的1 mL全血样品,将50 uL的实验对象组成员与950 uL的正常人全血(Bioreclamation IVT, Cat #: HMWBEDTA2)组合,通过移液混合。对全血动态范围,制备四个测试样品,如下表2中所示。
表2:全血动态范围测试样品
样品 | 浓度 | 靶 | 基质 |
样品 1 | 5.00E+05 Cp/mL | HIV LAV 8E5 | EDTA全血 |
样品2 | 5.00E+04 Cp/mL | HIV LAV 8E5 | EDTA全血 |
样品3 | 5.00E+03 Cp/mL | HIV LAV 8E5 | EDTA全血 |
样品4 | 5.00E+02 Cp/mL | HIV LAV 8E5 | EDTA全血 |
对每个样品都在cobas® LIAT®分析仪上测试三次重复。为了在cobas® LIAT®分析仪上运行测试,将100 uL的全血样品与100 µL的稀释缓冲液混合,并且随后装载到预先装填了填充的其他测定试剂的cobas® LIAT®设备。在cobas® LIAT®分析仪中分析所述设备,并且在测定完成时,将Ct和靶输入水平用于动态范围回归分析。结果显示在图3A-3B中,其显示全血中的至少4 log线性,并且HIV对测定的定量标准物性能没有抑制。此外,图4中显示了与全血相比血浆中的测定检测极限(LOD)。
对于每个患者血液样品,评价血浆和全血中的病毒量,以及测定在CD4抗体细胞排除后,全血中的病毒量。
为了从全血分离血浆,在Sorvall离心机上将Vacutainer Lavender血液收集管中的10 mL全血于室温在1200g离心10分钟。将上清液(血浆)转移到标记的50mL离心管。在Eppendorf管中,添加80 uL稀释缓冲液,随后添加100 uL的全血样品。在将血液样品添加至Eppendorf管之前,通过颠倒样品管直到血液变均一,随后移液3-5次,来混合全血样品。通过移液6次,混合血液和稀释缓冲液。
将CD4抗体颗粒涡旋15秒以重悬浮颗粒,并且随后将二十(20)uL的CD4抗体Dynabeads添加至Eppendorf管(100-500 ug,取决于CD4抗体颗粒的类型)。将混合物涡旋2次(1秒/次),以将样品与颗粒混合。将管装载到旋转器(Rotator)上,并在室温旋转温育10分钟(旋转器设定在60°倾斜和10 rpm)。将管在磁性支架中放置1分钟,并且随后将所有液体(~200 uL)转移到cobas® Liat®设备。除了管在第二区段不包括颗粒之外,如实施例1中所述,在管中完成排除的样品中的RNA分离和序列检测。相反,所述第二区段包括定量标准物。
对于每个患者样品,将与100 uL的稀释缓冲液混合的100 uL血浆、与100 uL的稀释缓冲液混合的100 uL EDTA全血以及具有CD4抗体细胞排除的100 uL EDTA全血装载到cobas® LIAT®设备上,并在cobas® LIAT®分析仪上测试。在测试运行结束后,收集数据。使用对血浆或全血的动态范围回归中生成的方程式,计算每种样品类型的病毒量。评价血浆和全血之间,或血浆和具有CD4细胞排除的全血之间的病毒量相关性。
遵循上述规程,一轮使用CD4磁性颗粒的结合能够从未冷冻的全血样品排除96%的CD4阳性细胞。结果显示在表3以及图5和6A-6B中。图5显示CD4排除处理改进了样品3和5中的病毒量相关性。图6A显示在CD4排除之前的病毒量相关性,且图6B显示在处理后的病毒量相关性。
表 3:5个患者血液样品的病毒量测量结果
在测试的5个患者样品中,两个样品的血浆病毒量测量结果小于1e3拷贝/ml,并且两个患者样品的直接全血病毒量测量结果高于1e3拷贝/ml。使用CD4抗体颗粒对两个患者全血样品的预处理改进了全血和血浆病毒量相关性。在使用抗-CD4颗粒预处理后,以前研究的两个相同样品的全血病毒量小于1e3拷贝/ml。
实施例3:cobas® LIAT®设备中CD4排除的最优化条件
基于期望的细胞裂解程度,评价管中各种流体流动驱动机制。如上所述,通常,通过使用中心定位的调节器及其侧翼夹具挤压管的选择的区段,以在设备中形成具有约1至约500 um (0.001- .5 mm),例如约5至500 um (0.005- .5 mm)的间隙(即流动通道的直径)的流动通道,来控制图1中所示设备中的流体流动。邻近的调节器温和挤压与流动通道液体连通的邻近区段,以产生补偿内部压力,以确保流动通道的基本均匀的间隙。发现可以通过相对于实现完全细胞裂解所用的,在预处理室的较小跨度上改变间隙,可以改变细胞裂解的程度。因此,使用这个方法,可以在不使用放置在样品预处理室中的滤器的情况下实现无细胞裂解的细胞排除。
设计了三种不同的流体流动机制以用于样品预处理室(即,放置在样品引入口和用于核酸捕获的区段之间的设备部分)中:
a) 常规裂解流体流动:具有细胞裂解的低剪切混合;
b) 苛刻裂解流体流动:具有细胞裂解的高剪切混合;和
c) 细胞排除流体流动:无细胞裂解的低剪切混合。
样品预处理室包括多个区段,例如,多至5个区段,并且对于常规裂解和苛刻裂解,所述室的每个区段都被使用,从而使得在所述室的流体流动通道的全长上进行流体混合。比较起来,为了实现细胞排除和随后细胞排除的样品的核酸提取,可以使用所述室中的区段的子集合,例如,可以使用少至5个区段中的3个或多至所述室的所有区段。发现相对于常规和苛刻裂解,可以在较少区段中进行流体流动机制,并且改变混合/裂解过程期间区段中和区段之间的流动通道的直径。用于常规裂解、苛刻裂解和细胞排除的最优化条件显示如下:
表4:相对调节器位置、裂解类型&流动通道间隙
调节器 | 常规裂解 (一般混合) | 苛刻裂解(生成剪切力) | 无裂解的细胞排除 |
P0 | 可变间隙,0-3 mm | 可变间隙,0-3 mm | 可变间隙,0.4-3 mm |
P1 | 可变间隙,0-3 mm | 可变间隙,0-3 mm | 窄的固定间隙,0-1 mm |
P2 | 可变间隙,0-3 mm | 窄的固定间隙,0-.15 mm | 可变间隙,0.4-3 mm |
P3 | 可变间隙,0-3 mm | 可变间隙,0-3 mm | 关闭 |
P4 | 可变间隙,0-3 mm | 可变间隙,0-3 mm | 关闭 |
为了实现常规裂解(表的第二列中所示),选择性地衔接/解脱调节器和夹具,以使液体在贯穿预处理室的流动通道中移动。为了实现苛刻裂解,使流动通道的最内部区段(P2)相对于侧接内部区段的间隙保持在较窄的固定间隙,从而使流动途径的内部区段中的流体经历生成相对苛刻裂解条件的剪切力。最内部区段的间隙相对于侧翼区段中的间隙显著缩小并保持固定,即,P2中的0.15 mm对P0-P1和P3-P4中的高至3 mm。相反,为了实现无细胞裂解的细胞排除,整个混合步骤可以在包括设备的较少区段(例如P0-P2)的较短流体流动通道中进行,并且最内部区段被挤压到高至1.1 mm的间隙,其是侧翼区段中的间隙大小的约三分之一,从而实现不导致细胞裂解的温和混合。在一个实施方案中,所述间隙可以减少侧翼区段中的通道的直径的25-50%,例如所述直径的33%。
图7A-7D中举例说明了所述过程。图7A中举例说明了样品加工设备的一部分,其中管701包括样品预处理室702,其包括与样品加工设备708中区段的剩余部分流体连通的多个区段703-707。流体流动通道709跨越预处理室进入样品加工设备区段的剩余部分。当与预处理室连通的调节器(P0-P4)和夹具(C0-C5)没有与管衔接时,流体流动通道具有约5 mm的直径,但是,当管位于设备中时,控制调节器和夹具位置的电动机(未显示)紧靠着管的外壁驱动调节器和夹具,稍微挤压管,从而使得流体流动通道具有约3 mm的直径,这被称作室的完全开放位置。图7B显示在常规裂解期间流体流动通道的相对尺寸;流体流动通道跨越P0-P5并且通道具有高至3 mm的直径。图7C显示在苛刻裂解期间流体流动通道的相对尺寸;流体流动通道跨越P0-P5,其中最内部区段P2减少到高至0.15 mm的直径。因此,在苛刻裂解期间,相对于侧翼区段,流体流在P2中经历高压,从而引入导致苛刻细胞裂解的高剪切力。比较起来,图7D显示在细胞排除期间流体流动通道的相对尺寸;流体流动通道跨越P0-P2,其中在最内部区段P1中的通道直径从高至3 mm (在P0和P2中)减少到高至1.1 mm。最内部通道没有被挤压到如其在苛刻裂解期间相同的程度,从而导致不裂解流体中的细胞的更温和的混合循环。
除了改变的流体流动机制之外,调整与调节器和夹具中的每一个可操作连接的电动机的转速,以避免在细胞排除期间的细胞裂解。在常规和苛刻裂解期间,与调节器和夹具衔接的每个电动机以相等的速率快速衔接和解脱调节器和夹具。然而,为了实现无细胞裂解的细胞排除,调整解脱期间的电动机转速,从而使得电动机相对于加速速率对数减速。图8A-8B中举例说明了这一点,其中图8A显示电动机在常规和苛刻裂解期间的运动,且图8B显示电动机在细胞排除期间的运动。
使用本文和实施例1中所述的方法来评价样品加工设备中的患者样品的病毒量,并且结果显示如下:
表 5:在配置用于进行细胞排除的设备中的病毒量测试
表5中显示的结果与使用实施例2中所述的离线加工实现的那些结果类似。
Claims (16)
1.包括限定流体流动通道的管和置于其中的多个区段的设备在制备用于进行实施全血样品的病毒或肿瘤量的定量分析的方法的试剂盒中的用途,其中所述全血样品包含含有病毒或肿瘤的细胞表面标记物的多个细胞,所述方法包括:
a. 将所述全血样品添加到包括限定流体流动通道的管的设备,所述流体流动通道包括置于其中的形成样品预处理室的第一组区段和第二组区段,所述样品预处理室在一个或多个所述区段中包括表面且不包括滤器,所述表面包括固定的抗细胞表面标记物抗体;
b. 在所述样品预处理室中将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在所述流动通道中没有滤器的情况下并且在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和
c. 使用核酸扩增技术在所述设备中测量所述排除的样品中的病毒或肿瘤量,
其中所述抗细胞表面标记物抗体特异性结合细胞表面标记物;
其中所述设备进一步包括可操作地与所述第一组和第二组区段连接的多个挤压部件;
其中置于所述流体流动通道中的形成样品预处理室的所述第一组区段从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,并且所述混合步骤包括通过所述多个挤压部件的至少一个挤压部件选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于所述第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径;和
其中所述设备包括接近所述样品预处理室的限定核酸分析区域的所述流体流动通道中的第二组区段,所述核酸分析区域包括一个或多个额外区段,所述额外区段的每一个经配置用于实施所述核酸分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测。
2.权利要求1的用途,其中所述内部区段流动通道直径在第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的25-50%之间。
3.权利要求1或2任一项的用途,其中所述内部区段流动通道直径是第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的直径的约33%。
4.权利要求1-3任一项的用途,其中包括在所述样品预处理室中的所述表面包括珠、颗粒或所述预处理室的内壁。
5.权利要求1-4任一项的用途,其中所述排除的样品包含< 2.5%的含有所述细胞表面标记物的细胞。
6.权利要求1-5任一项的用途,其中所述排除的样品包含< 1%的含有所述细胞表面标记物的细胞。
7.权利要求1-6任一项的用途,其进一步包括在步骤(b)后,在所述设备中,将所述排除的样品与固定有细胞表面标记物细胞的表面分离。
8.权利要求1-7任一项的用途,其中所述细胞表面标记物选自:CD4、CD45、β-微球蛋白或其混合物。
9.权利要求1-8任一项的用途,其中所述病毒或肿瘤量测量分别与在取自提供所述全血样品的患者的血浆样品中的病毒或肿瘤量测量线性相关。
10.经配置用于进行全血样品中的一种或多种病毒或肿瘤靶寡核苷酸序列的定量PCR分析的设备,所述全血样品包含含有病毒或肿瘤的细胞表面标记物的多个细胞,所述设备包括限定流体流动通道的管和置于其中的多个区段,所述设备包括:
a. 限定用于从所述全血样品生成排除的样品的样品预处理室的所述流体流动通道中的第一组区段,其从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,和固定在一个或多个所述区段中的表面上的抗细胞表面标记物抗体,其中所述样品预处理室不包括滤器,且其中所述抗细胞表面标记物抗体特异性结合细胞表面标记物;
b. 用于使用在所述样品预处理室中生成的排除的样品进行定量PCR分析的接近所述样品预处理室的经配置用于通过限定PCR分析区域进行定量PCR分析的所述流体流动通道中的第二组区段,所述PCR分析区域包括一个或多个额外区段,所述额外区段的每一个经配置用于实施所述PCR分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测;和
c. 多个挤压部件,其可操作地与所述多个区段连接并且经配置以选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径;
其中所述设备经配置以通过使所述样品预处理室经历足以从全血样品生成排除的样品的条件来生成排除的样品,同时所述表面包括固定的细胞表面标记物细胞,从而使得所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞。
11.权利要求10的设备,其中所述内部区段流动通道直径在第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的25-50%之间。
12.权利要求10-11任一项的设备,其中所述内部区段流动通道直径是第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径的约33%。
13.权利要求10-12任一项的设备,其中所述设备具有< 100拷贝/mL的病毒或肿瘤的检测极限。
14.权利要求10-13任一项的设备,其中所述细胞表面标记物选自:CD4、CD45、β-微球蛋白或其混合物。
15.权利要求10-14任一项的设备,其中所述样品预处理室的一个或多个所述区段中的所述表面包括珠、颗粒或所述预处理室的内壁。
16.实施全血样品的病毒或肿瘤量的定量分析的非诊断目的的方法,其中所述全血样品包含含有病毒或肿瘤的细胞表面标记物的多个细胞,所述方法包括:
a. 将所述全血样品添加到包括限定流体流动通道的管的设备,所述流体流动通道包括置于其中的形成样品预处理室的第一组区段和第二组区段,所述样品预处理室在一个或多个所述区段中包括表面且不包括滤器,所述表面包括固定的抗细胞表面标记物抗体;
b. 在所述样品预处理室中将所述表面和样品在所述设备中混合,以形成排除的样品,其中所述排除的样品包含< 5%的含有所述细胞表面标记物的细胞,并且所述混合步骤在所述流动通道中没有滤器的情况下并且在不裂解所述样品中的细胞的条件下进行;和
c. 使用核酸扩增技术在所述设备中测量所述排除的样品中的病毒或肿瘤量,
其中所述抗细胞表面标记物抗体特异性结合细胞表面标记物;
其中所述设备进一步包括可操作地与所述第一组和第二组区段连接的多个挤压部件;
其中置于所述流体流动通道中的形成样品预处理室的所述第一组区段从近端到远端包括:第一侧翼区段、内部区段和第二侧翼区段,并且所述混合步骤包括通过所述多个挤压部件的至少一个挤压部件选择性地挤压所述样品预处理室的一个或多个区段,以在所述样品预处理室中形成流动通道,从而使得内部区段流动通道直径小于所述第一和第二侧翼区段中的流动通道的直径;和
其中所述设备包括接近所述样品预处理室的限定核酸分析区域的所述流体流动通道中的第二组区段,所述核酸分析区域包括一个或多个额外区段,所述额外区段的每一个经配置用于实施所述核酸分析的一个或多个步骤,包括试剂制备、靶富集、抑制剂去除、核酸提取、扩增和实时检测。
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