CN109470791A - 一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法及试剂盒 - Google Patents

一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱‑串联质谱检测血清***的试剂盒和方法，试剂盒包括洗脱液、稀释液、萃取剂、质控品和色谱柱，萃取剂为乙酸乙酯/正己烷；检测血清中***的方法，包括如下步骤：(1)样本预处理；(2)色谱分离；(3)质谱检测；(4)利用系列浓度的***标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中***的含量。采用本发明的检测试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅需要一步液液萃取过程，就能有效提取样本中的***，时间大大缩短，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的***同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性。

Description

一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及激素检测技术领域，尤其是一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法及试剂盒。
背景技术
***为脂溶性类固醇小分子物质，主要来源于卵泡内膜细胞和卵泡颗粒细胞，包括雌酮(Estrone，E1)、17β-***(17β-Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)，它们对于建立和维持女性的***、妊娠等有着不可替代的重要作用，此外对内分泌***、心血管***以及肌体和骨骼的代谢等都有重要影响。激素的检测在过去是医学实验室检测项目中公认的难题，主要原因是其在血液中含量低(通常在pmol水平)、结构类似物众多，因此，对检测方法的灵敏度和特异性要求很高。***检测的广泛研究始于20世纪70年代。当时采用的方法主要是放射免疫法(RIA)法。近年来，定量检测血清***的方法不断出现，主要有酶联免疫法(EIA)、酶联免疫吸附法(ELSIA)、化学发光法(CLIA)、质谱法(气相色谱串联质谱法和液相色谱串联质谱法)等。
RIA存在放射性核素对人体损害较大并造成环境污染，EIA、ELSIA等由于检测灵敏度较低、精密度较差以及自动化程度不高，逐步被新的CLIA取代，CLIA法是目前临床实验室的常规检测技术。然而以抗原-抗体免疫反应为基础的方法，不可避免的带来了非特异性反应的问题而使得测定结果有明显***误差，同时各实验室使用不同生产厂家的试剂导致结果可比性差，直接影响了检测结果在疾病筛查中的可信度。基于质谱技术的内分泌疾病生化诊断是目前应用广泛且较为成熟的方法。由于生物样本中存在浓度相当的与***分子的色谱性质及质谱碎片性质十分相近，使得其特异性检测难度加大。目前多采用气相色谱质谱联用(GC-MS)分析法检测分析血清中的***浓度，但其灵敏度不足，通常需采用衍生化的方法，前处理复杂、分析时间长。
国外虽有少量使用同位素稀释液相色谱串联质谱法(Isotope-Dilution LiquidChromatography-tandem Mass spectrometry，ID-LC-MS/MS)检测血浆中***的报道，但仍需要进行衍生化、固相提取等前处理步骤才能将***的异构体分开。目前缺乏相应的质谱检测试剂盒应用于临床检测，限制了其在临床上的应用。因此，开发稳定的基于LC-MS/MS技术的检测***的方法，并研制相应的检测试剂盒能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，对提高国内内分泌疾病的诊断治疗水平具有重要意义。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法和试剂盒，采用该方法检测血清***，具有简单、方便、耗时显著缩短的优点，同时检测结果更准确。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下三个方面：
在第一个方面，本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的试剂盒，所述试剂盒包括洗脱液、稀释液、萃取剂、质控品和色谱柱，所述萃取剂为乙酸乙酯/正己烷。需要说明的是，本发明的试剂盒通过萃取剂对样品前处理进行改良，不需要衍生化和/或固相提取过程，前处理更加简单、快捷，可实现批量处理。
优选地，所述萃取剂中乙酸乙酯与正己烷的体积比为1∶1。
优选地，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，其中，所述洗脱液A为氟化铵水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈。更优选地，氟化铵缓冲液的浓度为0.2mmol/L。
优选地，所述稀释液为空白血清基质，所述质控品为以所述稀释液作溶剂的溶液。
优选地，所述质控品有9种，其中溶质分别是：浓度分别为36.5、432.0、864.4pg/mL的雌酮，148、276、483pg/mL的17β-***以及28.13、386.43、853.22pg/mL的雌三醇。
优选地，所述试剂盒还包括复溶液、标准品和内标液，所述复溶液为乙腈∶水(50∶50，v∶v)溶液；
所述标准品为***与所述复溶液的混合溶液，所述***分别为20、40、200、500、1000、2000、5000和10000pg/mL的雌酮、17β-***和雌三醇的混合物；
所述内标液为***溶液与所述复溶液的混合溶液，所述***溶液为超纯水配制的λ-雌酮-d2、17β-***-13C3和雌三醇-13C3的混合溶液，其浓度优选为25ng/mL。
优选地，所述色谱柱为Phenomenex Knietex C18，2.6μm，100×2.1mm柱。需要说明的是，本发明的试剂盒利用Phenomenex Knietex C18，2.6μm，100×2.1mm色谱柱，以及条件优化实现了***和其结构类似物的有效分离，方法特异性好。
在第二个方面，本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清中***的方法，包括如下步骤：
(1)样本预处理：将血清样本用乙酸乙酯/正己烷处理，取上清，氮气吹干，乙腈水溶液复溶；乙酸乙酯/正己烷的体积比优选为50/50；
(2)色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10～50μL上样至Phenomenex KnietexC18，2.6μm，100×2.1mm色谱柱，在流速为0.2～0.4mL/min，柱温40℃条件下，以梯度洗脱8min；
其中洗脱液A为0.1～1.0mmol/L的氟化铵缓冲液，洗脱液B为乙腈；
梯度条件如下：0～0.5min，30％B；0.5～5.0min B相从30％增加至78％；5.0～5.1min B相从78％增加至99％；5.1～6.6min，99％B；6.6～6.7min B相从99％降低至30％；6.7～8.0，30％B；
(3)质谱检测：取步骤(1)预处理后的样本，选择ESI负离子模式上样，采用多反应监测技术检测***，其中，
质谱参数如下：碰撞气(CAD)为4Psi、气帘气(CUR)为20Psi、温度为650℃，质谱扫描模式采用多反应检测的；
(4)利用系列浓度的***标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中***的含量；***包括雌酮、17β-***和雌三醇。需要说明的是，该检测方法利用ESI离子化模式，优化了质谱条件，大大提高了检测信号的灵敏度；方法学考察结果显示，该方法精密度、准确度、稳定性均满足定量分析要求。
优选地，所述步骤(1)还包括在进行血清样本前处理前加入内标化合物，所述内标化合物选自雌酮-d2，17β-***-13C3和雌三醇-13C3。
优选地，所述步骤(3)中多反应监测(MRM)技术检测***的参数如下：
雌酮离子对，m/z：269-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为50V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为14V；
17β-***离子对，m/z：271-145，去簇电压(DP)为110V、碰撞电压(CE)为51V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为17V；
雌三醇离子对，m/z：287-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为53V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为16V；
雌酮-d2离子对，m/z：271-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为51V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为17V；
17β-***-13C3离子对，m/z：274-148，去簇电压(DP)为110V、碰撞电压(CE)为53V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为15V；
雌三醇-13C3离子对，m/z：290-148，去簇电压(DP)为160V、碰撞电压(CE)为55V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为16V。
优选地，所述步骤(2)取预处理的样本25μL上样，以流速0.3ml/min洗脱；优选地，洗脱液A为0.2mmol/L的氟化铵缓冲液，洗脱液B为质谱纯乙腈。
优选地，所述步骤(1)具体操作如下：取500μL血浆于15mL离心管中，加入10μL，25ng/mL雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3内标化合物，斡旋混匀后于室温平衡10min，加入乙酸乙酯/正己烷(50/50，v/v)，置于37℃温箱温育震荡10min，13000rpm离心5min，取上清，氮气吹干，以300μL30％乙腈水溶液复溶。
在第三个方面，本发明还提供了第一个方面所述试剂盒在同位素稀释液相色谱串联质谱法检测血清***方法中的应用。
综上所述，本发明的有益效果包括如下：
(1)本发明的ID-LC-MS/MS(高效液相色谱-串联质谱)检测血清***的方法及试剂盒，样品前处理更加简单、方便，仅仅需要一步液液萃取过程，就能有效提取样本中的***，时间大大缩短，不需要衍生化和/或固相提取步骤，通过色谱条件优化，能将生物体内存在的***同分异构体实现基线分离，提高了定量的特异性和准确性；发明人通过开发本发明的ID-LC-MS/MS检测方法的相应的检测试剂盒，能够为临床提供更加准确可靠的检测方法，进而提高国内***的检测水平；
(2)本发明的检测方法具有准确度高、重现性好，稳定、可靠的特点，可用于血清中***的同步定量检测；
(3)与GC-MS/MS方法相比，本发明的检测方法提高了灵敏度，操作简单，节约分析成本，所需分析时间较短，利于开展大批量样本检测，适于进行人群中相关疾病的筛查；为我国血清***的检测提供了切实可行的方法和检测试剂盒。
附图说明
图1为血浆中雌酮、17β-***、雌三醇、17α-***、16-表雌三醇、17-表雌三醇、睾酮、标雌酮-d2、17β-***-13C3、雌三醇-13C3的LC-MS/MS图谱，其中，intensity表示强度，time表示时间，testoterone表示***。
具体实施方式
本发明涉及生物标记物体外检测领域，具体涉及一种***的同位素稀释液相色谱-串联质谱技术检测方法及试剂盒，特别为一种用于同步检测血清标本中雌酮、17β-***和雌三醇的专用检测方法和试剂盒。
本发明提供了一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的方法及试剂盒，通过前处理、色谱柱、色谱条件、质谱类型、质谱参数的优化选择，实现了血清***的检测，特别是实现了血清中雌酮、17β-***和雌三醇的同步定量检测，对其干扰物实现了基线分离；本发明用于检测血清中***时，简单快捷，具有良好的特异性、精密度、准确度、稳定性，能够为临床提供更加准确可靠的检测方法。
在一些实施例中，本发明提供了一种同位素稀释液相色谱串联质谱技术检测血清***的方法，包括如下步骤：
采用同位素稀释液相色谱串联质谱技术同步检测经过预处理的血清样本中三种***，利用同位素稀释液相色谱将目标***：雌酮、17β-***、雌三醇与杂质分离，再利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，分别计算雌酮、17β-***、雌三醇的含量。
在一些实施例中，本发明提供了检测血清样本中***的方法，采用同位素稀释液相色谱串联质谱检测血清样本中***，***包括雌酮(Estrone，E1)、17β-***(17β-Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)包括如下步骤：
(1)样本预处理：将血清样本用乙酸乙酯/正己烷(50/50，v/v)处理，取上清，氮气吹干，乙腈水溶液复溶。
(2)色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10-50μL上样至Phenomenex KnietexC18，2.6μm，100×2.1mm色谱柱，在流速为0.3ml/min，朱文40℃条件下，以梯度洗脱8min；
其中洗脱液A为乙腈，洗脱液B为含0.1-1.0mmol/L的氟化铵缓冲液；
梯度条件如下：0-0.5min，30％B；0.5-5.0min B相从30％增加至78％；5.0-5.1minB相从78％增加至99％；5.1-6.6min，99％B；6.6-6.7min B相从99％降低至30％；6.7-8.0，30％B。
(3)质谱检测：选择ESI负离子模式。
质谱参数如下：碰撞气(CAD)为4Psi、气帘气(CUR)为20Psi、温度为650℃。
(4)利用系列浓度的***标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆样本中***的含量。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的实施例中涉及的仪器、材料与试剂说明如下：
串联质谱仪(AB Sciex API 5500)，高效液相(Shimadzu LC-20AD XR system)。17β-***(纯度＞99.3％)，17β-***-2，3，4-13C3(99atom％13C)，雌三醇，雌三醇-2，3，4-13C3(99atom％13C)，雌酮，17α-***，17α-乙炔基***、17β-***-3，17-双硫酸盐，17α-羟孕酮、孕酮、睾酮、胆固醇、醛固酮、16-表雌三醇、17-表雌三醇、皮质醇均是从Sigma公司的产品。活性炭吸附血清从Equitech-Bio，Inc.(美国)购买。LC级乙醇购自J.T.Baker公司，质谱级乙腈购自Merck公司，15-mL离心管购自Kirgen公司，容量瓶购自BRAND GMBH+CO KG(德国)。纯水是通过Millipore Simplicity UA纯水仪纯化得到。
本发明中的标准品和内标液的配制方法，采用如下步骤：
(1)标准品母液制备
分别精确称取20mg雌酮、17β-***、雌三醇标准品并混合，用20mL 50％乙腈水溶解，用50mL容量瓶定容，得0.2mg/mL的储备液。用50％乙腈水将储备液稀释成1μg/mL的标准品母液。
(2)标准品配制
将标准品母液用50％乙腈水稀释成8个不同浓度的校准品：20，40，200，500，1000，2000，5000和10000pg/mL，不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。
(3)内标液雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3混合溶液制备
分别称取雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3并混合，用50％乙腈水溶解后配制成0.2mg/mL的储备液。将储备液用50％乙腈水稀释至1μg/mL即得实验用内标母液，继续稀释至25ng/mL即得实验用内标溶液。
实施例1检测条件的优化
(1)色谱条件的优化：色谱柱选择
预实验中使用PEEKzwitterionic column，3.5μm，100mm×2.1mm柱；Phenomenex Kinetex-C18，2.6μm，100×2.1mm；赛默飞世尔Hypersil gold，5μm，50×2.1mm；岛津Shim-parkXR-ODS II，2.2μm，7.5×2.0mm等4款不同色谱柱进行样本分析。
结果表明Phenomenex Kinetex-C18，2.6μm，100×2.1mm柱对***及其结构类似物分离效果最佳。其他四种LC柱对其分离效果欠佳。在C18柱中***有良好的保留，Phenomenex Kinetex-C18，2.6μm，100×2.1mm对目标化合物有较好的保留和较高的柱效，而且能够将***的同分异构体分离，有助于提高检测的特异性和灵敏度，故选其作为该方法的色谱柱。
(2)进样量选择：
对比10、20、25、40和50μL进样量，结果表明，高进样量会导致样品峰出现溶剂效应，使得峰形变差，甚至出现开叉峰。进样量太低会导致检测灵敏度降低。25μL进样时，峰形好，灵敏度也能满足检测需求。因此，选择进样量为25μL进行实验。
(3)缓冲盐的种类和浓度：
通过比较甲酸铵(0.2mmol/L)、乙酸铵(0.2mmol/L)和氟化铵(0.2mmol/L)。分析物峰宽都差不多，以峰高比较。
结果表明，适当浓度氟化铵可提高其离子化效率。故选择氟化铵作为分析的缓冲盐。
分别配制不同浓度的氟化铵缓冲液：0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mmol/L，以1.0ng/mL浓度标准品进样，比较在不同氟化铵浓度下，出峰的响应值和S/N。
结果表明，当氟化铵的浓度为0.2mmol/L时，其响应值和S/N均最大。因此，选择此浓度进行为缓冲盐浓度。
(4)流动相梯度：
流动相梯度的确定是在满足适当的样本保留，良好的色谱峰峰形和良好的色谱分离能力的情况下得到，在流速为0.3mL/min条件下，采用表2梯度洗脱的方式，洗脱8min，目标物峰型良好，分离效果良好，且出峰时间较快，因此选择该条件进行洗脱。
(5)质谱条件的优化：
质谱条件的确定是按照以下步骤得到：比较相同浓度分析物在大气压化学电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)两种电离模式下的离子响应，发现ESI模式下响应高，选择ESI模式。然后对比ESI模式下的正负离子强度，发现负离子模式响应高，选择负离子模式。
离子模式确定后，再优化多反应监测器(MRM)条件，具体包括以下步骤：根据分析物分子量，确定分析物母离子，通过在ESI负离子模式下，采用7μL/min的针泵注射标准溶液，进行母离子扫描，扫描范围：10-150Da，扫描速度：200Da/s。在图谱中寻找分析物母离子，然后选择特点的母离子进行子离子的选择。所述子离子的选择按照以下步骤得到：选择特定的母离子后进行子离子扫描，扫描范围：10-150Da，扫描速度：200Da/s。调节DP，来寻找响应最高的子离子。确定好母离子和子离子后，进行质谱参数和MRM条件的优化。
(6)质谱参数的优化需要优化以下参数：碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气、喷雾电压、温度。
MRM条件的优化需要优化以下参数：去簇电压(DP)，碰撞电压(CE)，碰撞池入口电压(EP)，碰撞池出口电压(CXP)，驻留时间(Dwell time)。
质谱条件为在电喷雾电离(ESI)负离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为4500V；气帘气为20；离子源气流GS1为55，GS2为30；离子源温度为650℃；目标物雌酮：m/z 269-145、***：m/z 271-145、雌三醇：m/z 287-145；同位素内标雌酮-d2离子对，m/z：271-145，17β-***-13C3：m/z 274-148、雌三醇-13C3：m/z 290-148；***及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表1。
表1***、内标及其同分异构体的质谱参数
实施例2
本发明的高效液相色谱-串联质谱检测血清***的一种实施例，采用同位素稀释液相色谱串联质谱检测血清样本中***，***包括雌酮(Estrone，E1)、17β-***(17β-Estradiol，E2)和雌三醇(Estriol，E3)包括如下步骤：
(1)样本预处理：将血清样本用乙酸乙酯/正己烷(50/50，v/v)处理，进行液液萃取，取上清，氮气吹干(氮气吹干温度为40～50℃)，乙腈水溶液复溶。
(2)LC色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本25μL上样至Phenomenex KnietexC18，2.6μm，100×2.1mm色谱柱，在流速为0.3ml/min，柱温40℃条件下，以梯度洗脱8min；
其中洗脱液A为乙腈，洗脱液B为含0.2mmol/L的氟化铵缓冲液；
梯度条件如下：0-0.5min，30％B；0.5-5.0min B相从30％增加至78％；5.0-5.1minB相从78％增加至99％；5.1-6.6min，99％B；6.6-6.7min B相从99％降低至30％；6.7-8.0，30％B。
(3)质谱检测：选择ESI负离子模式。
质谱参数如下：碰撞气(CAD)为4Psi、气帘气(CUR)为20Psi、温度为650℃。
(4)利用系列浓度的***标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆样本中***的含量。
其中，步骤(1)在进行血清样本前处理前还包括加入雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3等内标化合物的操作。
步骤(1)具体操作如下：取500μL血浆于15mL离心管中，加入10μL，25ng/mL雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3内标化合物，斡旋混匀后于室温平衡10min，加入乙酸乙酯/正己烷(50/50，v/v)，置于37℃温箱温育震荡10min，13000rpm离心5min，取上清，氮气吹干，以300μL30％乙腈水溶液复溶。
步骤(3)中多反应检测器(MRM)对***的参数如下：
雌酮离子对，m/z：269-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为50V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为14V。
17β-***离子对，m/z：271-145，去簇电压(DP)为110V、碰撞电压(CE)为51V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为17V。
雌三醇离子对，m/z：287-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为53V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为16V。
雌酮-d2离子对，m/z：271-145，去簇电压(DP)为100V、碰撞电压(CE)为51V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为17V。
17β-***-13C3离子对，m/z：274-148，去簇电压(DP)为110V、碰撞电压(CE)为53V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为15V。
雌三醇-13C3离子对，m/z：290-148，去簇电压(DP)为160V、碰撞电压(CE)为55V、碰撞池入口电压(EP)为10V、碰撞池出口电压为16V。
其中，质谱条件为：
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测(MRM)的质谱扫描模式；喷雾电压为4500V；气帘气为20；离子源气流GS1为55，GS2为30；离子源温度为650℃；目标物雌酮：m/z 269-145、17β-***：m/z 271-145、雌三醇：m/z 287-145；同位素内标雌酮-d2离子对，m/z：271-145，17β-***-13C3：m/z 274-148、雌三醇-13C3：m/z 290-148；***及内标的去簇电压、碰撞电压、碰撞能和碰撞池出口电压参数见表1。
色谱条件为：
流动相A：0.2mmol/L氟化铵水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱纯；
色谱柱型号：Phenomenex Knietex C18，2.6μm，100×2.1mm；
采用梯度洗脱的方式，洗脱8min，梯度条件见表2；
表2***检测的梯度条件
实施例3
本发明的高效液相色谱-串联质谱检测血清***的试剂盒的一种实施例，如表3所示，采用同位素稀释液相色谱串联质谱技术检测血清样本中***，包括如下试剂：
(1)洗脱液：
洗脱液A：0.2mmol/L氟化铵水溶液；
洗脱液B：乙腈，纯度为质谱纯；
(2)标准品：
标准品的配制主要包括标准品母液的配制：
标准品母液：***的50％乙腈水溶液；
配制：分别精确称取20mg雌酮、17β-***、雌三醇标准品并混合，用20mL 50％乙腈水溶解，用50mL容量瓶定容，得0.2mg/mL的储备液。用50％乙腈水将储备液稀释成1μg/mL的标准品母液。
将标准品母液用50％乙腈水稀释成8个不同浓度的校准品：20，40，200，500，1000，2000，5000和10000pg/mL。
不同浓度的校准品各1mL，保存于-20℃条件下。
(3)内标液：雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3混合溶液；
分别称取雌酮-d2，17β-***-13C3，雌三醇-13C3并混合，用50％乙腈水溶解后配制成0.2mg/mL的储备液。将储备液用50％乙腈水稀释至1μg/mL即得实验用内标母液，继续稀释至25ng/mL即得实验用内标溶液。
(4)液液萃取剂：乙酸乙酯/正己烷(50/50，v/v)。
(5)质控品：***血清基质溶液。用稀释液分别配制低中高浓度的QC1、QC2、QC3，***浓度分别为：36.5、432.0、864.4pg/mL的雌酮；148、276p、483pg/mL的17β-***；28.13、386.43、853.22pg/mL的雌三醇。
(6)稀释液：所述稀释液为空白血清基质溶液，该空白血清基质溶液为活性炭吸附人血清。
表3检测血清***的试剂盒组分
实施例4实施例3的试剂盒的效果验证
实施例2采用***的同位素稀释液相色谱串联质谱技术和实施例3的试剂盒，所得MRM监测色谱图如图1所示：***及内标标准品及血浆样品中的峰形对称，基本没有杂质干扰，异构体在该条件下能够与分析物分离，尤其是***的同分异构体：17α-***；雌三醇的同分异构体：睾酮、16-表雌三醇、17-表雌三醇等能够实现基线分离。表明该条件能够用于血清***的定量分析。
***含量的确定：校准曲线采用同位素内标定量法，利用Analyst软件以标准品与内标的浓度比为X轴，标准品与内标峰面积比为Y轴，建立曲线，计算血浆中各***的浓度；雌酮、17β-***、雌三醇在20～10000pg/mL范围内线性较好，相关系数在0.99以上，满足定量要求。
检测灵敏度：实施例3的试剂盒检测雌酮的检测限(LOD)分别为：小于5pg/mL，定量限(LOQ)则为5pg/mL，重复4次检测CVs为4.9％；17β-***的检测限(LOD)分别为：5pg/mL，定量限(LOQ)则为10pg/mL，重复4次检测CVs分别为18.0和11.5％；雌三醇的检测限(LOD)分别为：5pg/mL，定量限(LOQ)则为10pg/mL，重复4次检测CVs分别为17.1和11.7％。所述LOD满足信噪比(S/N)＞3，LOQ满足信噪比(S/N)＞10，且重复4次检测CVs＜20％。
精密度试验：取500μL低、中、高三个浓度的***质控品，***浓度分别为：36.5、432.0、864.4pg/mL的雌酮；148、276p、483pg/mL的17β-***；28.13、386.43、853.22pg/mL的雌三醇。批内精密度是每个样本重复测定10次。批间精密度每批测定5次，每批均作标准曲线，连续测定3天，共15次测量。结果批内精密度(n＝10)：CV：1.86％-3.83％；批间精密度(n＝15)，CV：2.41％-7.44％。
回收率试验：取500μL血浆基质，检测空白基质的浓度为雌酮：114.3pg/mL，17β-***：215.0pg/mL，雌三醇：0pg/mL；分别加入200、500、1000和5000pg/mL的标准品溶液，每个浓度平行做3个样本，重复操作3次。
结果显示，血清基质中雌酮的加标回收率在95.1％～98.7％之间，3次重复试验的CV在0.7％～1.9％范围内；***的加标回收率在94.7％～102.6％之间，3次重复试验的CV在0.6％～2.1％范围内；雌三醇的加标回收率在99.1％～103.5％之间，3次重复试验的CV在0.4％～2.2％范围内。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱-串联质谱检测血清***的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括洗脱液、稀释液、萃取剂、质控品和色谱柱，所述萃取剂为乙酸乙酯/正己烷。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述萃取剂中乙酸乙酯与正己烷的体积比为1∶1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，其中，所述洗脱液A为氟化铵水溶液，所述洗脱液B为质谱纯乙腈。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稀释液为空白血清基质，所述质控品为以所述稀释液作溶剂的溶液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品有9种，其中溶质分别是：浓度分别为36.5、432.0、864.4pg/mL的雌酮，148、276、483pg/mL的17β-***以及28.13、386.43、853.22pg/mL的雌三醇。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括复溶液、标准品和内标液，所述复溶液为乙腈∶水(50∶50，v∶v)溶液；
所述标准品为***与所述复溶液的混合溶液，所述***分别为20、40、200、500、1000、2000、5000和10000pg/mL的雌酮、17β-***和雌三醇的混合物；
所述内标液为***溶液与所述复溶液的混合溶液，所述***溶液为超纯水配制的λ-雌酮-d2、17β-***-13C3和雌三醇-13C3的混合溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述色谱柱为Phenomenex KnietexC18，2.6μm，100×2.1mm柱。
8.一种高效液相色谱-串联质谱检测血清中***的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样本预处理：将血清样本用乙酸乙酯/正己烷处理，取上清，氮气吹干，乙腈水溶液复溶；
(2)色谱分离：将步骤(1)预处理后的样本10～50μL上样至Phenomenex Knietex C18，2.6μm，100×2.1mm色谱柱，在流速为0.2～0.4mL/min，柱温40℃条件下，以梯度洗脱8min；
其中洗脱液A为0.1～1.0mmol/L的氟化铵缓冲液，洗脱液B为乙腈；
梯度条件如下：0～0.5min，30％B；0.5～5.0min B相从30％增加至78％；5.0～5.1minB相从78％增加至99％；5.1～6.6min，99％B；6.6～6.7min B相从99％降低至30％；6.7～8.0，30％B；
(3)质谱检测：取步骤(1)预处理后的样本，选择ESI负离子模式上样，采用多反应监测技术检测***，其中，质谱参数如下：碰撞气为4Psi、气帘气为20Psi、温度为650℃；
(4)利用系列浓度的***标准品制备标准曲线的步骤，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清样本中***的含量；***包括雌酮、17β-***和雌三醇。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括在进行血清样本前处理前加入内标化合物，所述内标化合物选自雌酮-d2，17β-***-13C3和雌三醇-13C3。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中多反应监测技术检测***的参数如下：
雌酮离子对，m/z：269-145，去簇电压为100V、碰撞电压为50V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为14V；
17β-***离子对，m/z：271-145，去簇电压为110V、碰撞电压为51V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为17V；
雌三醇离子对，m/z：287-145，去簇电压为100V、碰撞电压为53V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为16V；
雌酮-d2离子对，m/z：271-145，去簇电压为100V、碰撞电压为51V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为17V；
17β-***-13C3离子对，m/z：274-148，去簇电压为110V、碰撞电压为53V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为15V；
雌三醇-13C3离子对，m/z：290-148，去簇电压为160V、碰撞电压为55V、碰撞池入口电压为10V、碰撞池出口电压为16V。
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