CN109470757B - 用于***特异抗原检测的电化学检测方法 - Google Patents

用于***特异抗原检测的电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物，电信号标记物为蛋白酶，蛋白酶的催化底物是一种多肽，多肽的序列特征是：切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸H。用于***抗原检测的检测方法，采用上述的用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物，包括以下步骤，A：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备；B：工作电极的制备；C：将工作电极在含有铜离子和多肽基底的PBS溶液中浸泡2小时，然后采用线性扫描伏安法进行电化学测试。本电信号标记物电信号明显，可满足人体血清中***特异抗原浓度的检测，而且催化基底中不用联苯类物质，对工作人员和环境无害。

Description

用于***特异抗原检测的电化学检测方法
技术领域
本发明涉及***特异抗原检测方法，特别涉及用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器信号标记物及检测方法，属于生物化学技术领域。
背景技术
***特异抗原是***类疾病的一种生物标志物，它在血清中浓度的高低与***癌的发生密切相关。例如，正常人血清中***特异抗原的浓度低于4 ng/mL，但当其浓度大于10 ng/mL，该***病人极有可能患有***癌。因此，***特异抗原的检测在***类疾病的早期诊断方面具有重要的意义。目前用于***特异抗原临床检测的方法主要是酶联免疫吸附法，但这种方法需要使用特殊的仪器，价格昂贵，检测程序复杂，而且检测成本较高，且需采用联苯类化合物作为检测基底，而联苯类化合物具有一定的致癌作用，因此，开发新型的用于***特异抗原检测的方法具有十分重要的意义。
电化学免疫传感器具有使用方便、测量精度高、维护简单和成本低等优点，是检测蛋白质的有效方法之一，在生物分析中具有广大的应用前景。在这种检测体系中，目标蛋白质可以被电极表面的抗体1（一抗）捕获，然后再通过酶标记的抗体2（二抗）对被捕获的蛋白质进行识别和信号输出。酶是电化学免疫传感器信号输出的常用的电信号标记物，目前主要包括过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸单酯酶。然而，这些天然酶具有一些潜在的缺点，比如，稳定性差、成本高、制备较困难。此外，过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶的金属催化中心被埋藏在蛋白质中间，在电极表面不易直接发生电子传递，且需要采用特殊的酶催化基底（如过氧化氢、葡萄糖等）；碱性磷酸单酯酶的催化产物抗氧化能力较差、在空气中不稳定、电信号较弱、容易形成聚合物而钝化电极。这些因素严重限制了电化学免疫传感器在实际中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服目前的***特异抗原检测中存在的上述问题，提供一种用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物及检测方法。
用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物，所述的电信号标记物为蛋白酶，蛋白酶的催化底物是一种多肽，多肽能够被所述的蛋白酶切割；多肽的序列特征是：切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸H；进一步的；所述的蛋白酶与***特异抗原对应的二抗复合到碳纳米管上形成二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物。
用于***特异抗原检测的检测方法，采用上述的用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物，包括以下步骤：
A：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备，包括以下子步骤：
A1：碳纳米管的预处理；
将多壁碳纳米管用2 M的硝酸煮沸12小时，冷却后离心洗涤三次，再将离心下来的多壁碳纳米管在硝酸/硫酸混合液中加热12小时，加热温度为60 ~ 100℃，再离心洗涤多次，直至pH接近7，将最后的离心物真空干燥，即得到较短的碳纳米管；
A2：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备；
将步骤A1得到的碳纳米管表面的羧基用EDC/NHS活化，离心分离去除多余的EDC和NHS，然后加入二抗，震荡反应1小时候，再加入蛋白酶继续震荡12小时，将所得沉淀物用二次水离心洗涤三次，即得到二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物，低温保存备用；
B：工作电极的制备
B1：在玻碳电极表面修饰羧基化石墨烯：将羧基化石墨烯溶液滴加到玻碳电极表面，自然晾干；
B2：一抗修饰电极的制备，将步骤B1得到的电极用EDC/NHS活化，再用二次水冲洗电极表面，将一抗滴加到电极表面，2小时后用二次水冲洗电极；
B3：***特异抗原的捕获，将步骤B2得到的电极在含***特异抗原的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
B4：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的捕获，将步骤B3得到的电极在含二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
C：将步骤B4得到的电极在含有铜离子和多肽基底的PBS溶液中浸泡2小时，然后采用线性扫描伏安法进行电化学测试。
进一步的，步骤A3得到的二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物低温保存备用，所述的保存温度为4 ℃。
进一步的，步骤B1中的玻碳电极直径为3 mm。
进一步的，步骤C中电化学测试采用三电极体系，步骤B4制备得到的电极作为工作电极。
本发明的积极有益技术效果在于：与目前商业化的酶联免疫吸附法相比，本发明的方法省去了大型昂贵的检测仪器。由于电化学传感器的仪器设备体积较小，传感电极可以制作为小型的电极阵列，所以本发明检测方便，使得开展***特异抗原检测的实体门槛大大降低，可更广泛的开展这种检测项目，与目前报道的电信号酶标记物过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸单酯酶等相比，本电信号标记物的催化产物电信号明显，在稳定性、灵敏度和检测限等方面均显示出了一定的优越性，完全可满足人体血清中***特异抗原浓度的检测，而且催化基底中没有用到联苯类物质，对工作人员和环境无害。
附图说明
图1是以蛋白酶为信号标记物的电化学免疫传感器的检测原理图。
图2是二抗/碳纳米管/胰蛋白酶复合物催化基底多肽水解产生的产物在没有络合物铜离子时的质谱图。
图3是二抗/碳纳米管/胰蛋白酶复合物催化基底多肽水解产生的产物在络合物铜离子时的质谱图。
图4是一抗修饰电极在经过不同浓度的***特异抗原和二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物修饰步骤后，再在基底溶液中浸泡2小时的线性扫描伏安图。***特异抗原的浓度依次为0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 ng/mL。
图5为传感器的峰电流与***特异抗原浓度的线性关系图。
图6是传感器测定不同蛋白质的线性扫描伏安图。
图7是传感器测定血清中***特异抗原的线性扫描伏安图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。
本发明中所述的电信号标记物为蛋白酶，所述的蛋白酶与***特异抗原对应的二抗修饰到碳纳米管上形成二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物，蛋白酶的基底是一种多肽，该多肽的序列特征是：切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸H。本发明中各种缩写所代表的物质分别为： EDC：（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）；NHS： N-羟基琥珀酰亚胺；MES：(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)；PBS：磷酸缓冲溶液；PSA: ***特异抗原。
实施例1：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备
A1：碳纳米管的预处理；
将20 mg多壁碳纳米管用50 mL 2 M的硝酸煮沸12小时，冷却后离心洗涤三次，离心转速为14000 rpm，每次离心时间为5分钟。再将离心下来的多壁碳纳米管在50 mL硝酸/硫酸（体积比为1:3）混合液加热12小时，加热温度为60 ~ 120℃，再离心洗涤多次，直至pH接近7，最后将离心物真空干燥，即得到较短的碳纳米管；
A2：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备；
将A1得到的碳纳米管（1.5 mg）加入到1 mL MES缓冲溶液中，超声30分钟，然后加入1 mL含0.4 M EDC和0.1 M NHS的MES（pH 7.4, 10 mM）缓冲溶液中，离心分离弃除多余的EDC和NHS，向其中离心沉淀物中加入150 μL 0.1 μg/mL的二抗，震荡反应1小时候，再加入150 μL 1 mg/mL的胰蛋白酶，继续震荡12小时，将所得沉淀物用二次水离心洗涤三次，即得到二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物，用1 mL PBS缓冲溶液分散，低温保存备用；
实施例2：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的活性分析
将5 μL 步骤A2中得到的二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物与含有2 mM多肽GARGGH的100 μL PBS缓冲溶液（pH 7.4, 0.2 M）混合，室温反应1小时后，将反应液用含或不含0.5mM铜离子的PBS稀释至500 μL，再14000 rpm的转速下离心，上层清液进行质谱测试，质谱的测试模型为负离子模型。从图2可以看出，所合成的二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物可以催化多肽GARGGH水解，在268.1035 Da处的主峰为水解产物GGH的质谱峰（图2），这表明修饰到碳纳米管表明的胰蛋白酶可以催化多肽GARGGH水解；当加入铜离子后，在330.0253 Da处出现新的质谱峰（图3），对应于GGH-Cu(II)络合物，这表明水解产物GGH与Cu(II)形成了络合物。
实施例3：传感器对***特异抗原的响应
B：工作电极的制备
B1：在玻碳电极表面修饰羧基化石墨烯，即将5 μL 0.5 mg/mL的羧基化石墨烯溶液滴加到直径为3 mm的玻碳电极表面，自然晾干；
B2：一抗修饰电极的制备，即将B1得到的电极在含0.4 M EDC和0.1 M NHS的PBS缓冲溶液中浸泡15分钟，用二次水将电极表面冲洗干净，氮气吹干；然后将10 μL一抗滴到电极表面，反应2小时后用二次水冲洗电极，再将电极在含有0.1% BSA (w/v)的PBS溶液中浸泡30分钟，取出电极，用二次水冲洗电极表面，氮气吹干；
B3：检测目标物的捕获，即将10 μL包含一定浓度***特异抗原的PBS溶液滴到B2得到的电极表面，反应30分钟后用二次水冲洗电极，氮气吹干；
B4：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的捕获，即将10 μL二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物滴到B3得到的电极表面，反应30分钟后用蒸馏水冲洗干净电极表面，氮气吹干；
C：电化学测试；将B4得到的电极在30 μL 含有0.5 mM铜离子和0.5 mM多肽GARGGH的PBS溶液中浸泡2小时，然后采用线性扫描伏安法进行电化学测试;
电化学检测采用三电极体系，B4得到的电极为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极。测试结果如图4所示。曲线是工作电极经过B1-B3步骤的循环伏安测试结果，图中的氧化峰是由酶催化产生的GGH-Cu(II)络合物电催化水氧化而产生的。从图中可以看出，催化峰电流随着***特异抗原浓度的增加而增加，说明最终产生的GGH-Cu(II)络合物的数量取决于***特异抗原的浓度，图5为氧化电流与***特异抗原浓度的关系。从图5可以看出，电流强度随***特异抗原浓度（0.01 ~ 2 ng/mL）的增加而呈线性增加，表明该方法可以用于***特异抗原的定量检测。检测限为0.01 ng/mL。以上结果表明该二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物可以用作电化学传感器的电信号标记物。
对不同蛋白的响应实施例：
将步骤B3中***特异抗原换成其它待测试的蛋白质，其它步骤的条件不改变，实验结果如图6所示。从图6中可以看出，其它蛋白质没有产生催化峰。因此，该方法可以选择性检测***特异抗原。图6中的曲线1~5分别对应的是：IgG（免疫球蛋白G），AFP (甲胎蛋白)，Thrombin（凝血酶），HSA（人血清蛋白），PSA（***特异抗原）。***特异抗原的浓度为5 ng/mL，其它蛋白质的浓度为100 ng/mL。
实施例4：血清中***特异抗原的检测
将步骤B3中***特异抗原换成人血清样本，测试时用含不同数量的***特异抗原标准品将血清稀释10倍，其它步骤的条件不改变，实验结果如图7所示。从图7中可以看出，当加入的***特异抗原标准样品的浓度为0 ng/mL时，血清样品产生了一个小的催化峰，表面血清样品中含有***特异抗原，随着加入的***特异抗原标准样品浓度的增加，该催化峰信号明显增强。表面该方法可以用于血清中***特异抗原的检测。根据图5的标准曲线，计算得出稀释后的血清样本中***特异抗原的浓度0.11 ng/mL。
将胰蛋白酶采用木瓜蛋白酶，对应的多肽基底仍然采用GARGGH，或者将胰蛋白酶换成二肽基肽酶-IV，对应的多肽基底为GPGGH，都可以得到相似的结果。采用其它蛋白酶及对应的多肽，多肽能够被所述的蛋白酶切割，切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸H，均应该能够实现本发明的技术方案。考虑到胰蛋白酶的廉价易得，更容易在临床上形成大规模的应用，本申请优先选用胰蛋白酶。
在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
序列表
<110> 安阳师范学院
<120> 用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Gly Ala Arg Gly Gly His
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
Gly Pro Gly Gly His
1 5

Claims (4)

1.用于***特异抗原的检测方法，采用用于***特异抗原检测的电化学免疫传感器电信号标记物，所述的电信号标记物为蛋白酶，蛋白酶的催化底物是一种多肽，多肽能够被所述的蛋白酶切割，多肽的序列特征是：切割位点往碳端方向的第三个氨基酸是组氨酸H，其特征在于包括以下步骤：
A：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备，包括以下子步骤：
A1：碳纳米管的预处理；
将多壁碳纳米管用2 M的硝酸煮沸12小时，冷却后离心洗涤三次，再将离心下来的多壁碳纳米管在硝酸/硫酸混合液中加热12小时，加热温度为60 ~ 100℃，再离心洗涤多次，直至pH接近7，将最后的离心物真空干燥，即得到较短的碳纳米管；
A2：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的制备；
将步骤A1得到的碳纳米管表面的羧基用EDC/NHS活化，离心分离去除多余的EDC和NHS，然后加入二抗，震荡反应1小时候，再加入蛋白酶继续震荡12小时，将所得沉淀物用二次水离心洗涤三次，即得到二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物，低温保存备用；
B：工作电极的制备
B1：在玻碳电极表面修饰羧基化石墨烯：将羧基化石墨烯溶液滴加到玻碳电极表面，自然晾干；
B2：一抗修饰电极的制备，将步骤B1得到的电极用EDC/NHS活化，再用二次水冲洗电极表面，将一抗滴加到电极表面，2小时后用二次水冲洗电极；
B3：***特异抗原的捕获，将步骤B2得到的电极在含***特异抗原的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
B4：二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的捕获，将步骤B3得到的电极在含二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
C：将步骤B4得到的电极在含有铜离子和多肽基底的PBS溶液中浸泡2小时，然后采用线性扫描伏安法进行电化学测试。
2.根据权利要求1所述的用于***特异抗原的检测方法，其特征在于：步骤A3得到的二抗/碳纳米管/蛋白酶复合物低温保存备用，所述的保存温度为4 ℃。
3.根据权利要求1所述的用于***特异抗原的检测方法，其特征在于：步骤B1中的玻碳电极直径为3 mm。
4.根据权利要求1所述的用于***特异抗原的检测方法，其特征在于：步骤C中电化学测试采用三电极体系，步骤B4制备得到的电极作为工作电极。
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