CN109456998A - 一种脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，包括：以4‑羟基香豆素为底物，利用脂肪酶催化进行Knoevenagel‑Michael级联反应与式II化合物生成双香豆素类化合物。双香豆素类化合物可以用于治疗血栓，抗HIV，治疗哮喘、皮肤癌和蛇毒，还可以用于对某些金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的抗菌治疗和用于制作分析试剂。本发明提供的方法，反应条件温和，后处理简单，底物谱广，催化剂可循环使用，是一种经济环保的合成双香豆素类化合物的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种脂肪酶在纯水相中催化芳香醛与4-羟基香豆素进行Knoevenagel-Michael级联反应合成双香豆素类化合物的方法。
背景技术
双香豆素类化合物因其活跃的药理和生物活性而被广泛应用。它可用作维生素K拮抗剂，可以抗凝血，用于治疗血栓；它对某些金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌具有抗菌活性，可以用作消炎药和退热药；它可以用于治疗HIV、哮喘、皮肤癌和蛇毒，还可以用于制作分析试剂。双香豆素类化合物一般由4-羟基香豆素和芳香醛通过Knoevenagel缩合-Michael加成得到。目前，合成双香豆素类化合物的方法多种多样。比如采用磁性纳米粒子催化剂TrBr/[Fe3O4@SiO2@(CH2)3-ImSO3H]Cl(来自J IRAN CHEM SOC，2017，14:2187–2198)，固体酸催化剂RHA-SO3H(来自RSC Advances，2013，3(46)：24046)和KF-蒙脱土(来自JOURNAL OF CHEMICAL RESEARCH，2007，2007：585-586)，相转移催化剂TBAB(来自Tetrahedron Letters，2009，50：4125–4127)，胆碱类离子液体催化剂(来自中国专利CN104311521A)等。这些合成方法使用难以回收的DMF或易挥发的有机溶剂，需要较高的反应温度，催化剂制备困难或难以回收使用，底物谱较窄，有时只能得到中等收率的产物。
酶作为一种特殊的生物催化剂，具有专一性、高效性、反应条件温和、环境友好、催化活性可调控等特点，已在化工、医药、食品、和环境治理等众多领域得到广泛应用。近年来，酶在有机合成中发挥了越来越重要的作用，在Aldol缩合，Mannich反应，Henry反应，Knoevenagel缩合，Michael加成，Baylis-Hillman反应等重要的C-C键形成的反应中的应用被相继报道。2015年，脂肪酶LPL被用于在35℃无水DMSO中催化芳香醛和活性亚甲基化合物的Knoevenagel缩合反应，反应24-72h后，生成Z构型的目标产物；2016年，脂肪酶PPL被用于45℃的DMSO(含水20％)中催化芳香醛和杂环活性亚甲基化合物-吲哚-2-酮的Knoevenagel缩合反应，反应10-20h后，生成E构型和Z构型的目标产物；目前，酶法催化Knoevenagel缩合和Michael加成反应大都在含水有机溶剂或绝对无水的有机溶剂中进行。
发明内容
现有技术中Knoevenagel缩合和Michael加成反应基本都以化学催化的方法进行，本发明提供一种以脂肪酶为催化剂，以芳香醛与4-羟基香豆素为底物经过Knoevenagel-Michael级联反应制备双香豆素类化合物的方法，该方法可在水相中进行，反应条件温和，收率高，催化剂可回收。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，包括：以4-羟基香豆素(式I化合物)为底物，利用脂肪酶催化进行Knoevenagel-Michael级联反应与式II化合物生成双香豆素类化合物(式III)，反应方程式为：
其中，Ar为4-ClC6H4，2-NO2C6H4，3-NO2C6H4，4-NO2C6H4，4-OHC6H4，2-OHC6H4，4-CNC6H4，4-FC6H4，C6H5，4-CH3C6H4，4-OCH3C6H4，2-OH-3-OCH3C6H3，2,6-Cl2C6H3，4-C4H9C6H4，2-SC4H3，2-NC5H4，3-NC8H6，2-OH-4-OCH3C6H3，C5H11或C3H7。
所述的脂肪酶，为通常意义的脂肪酶，即脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)，其能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，来源于动植物或者微生物，通常用来进行催化水解、酯化、酯交换、氨解等反应。
优选的，所选脂肪酶选自南极假丝酵母脂肪酶B(Amano Lipase PS fromBurkholderiacepacia)，Novozym435脂肪酶(lipaseB from Candida antarctica,immobilized on a macroporous acrylic resin)，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶(Lipase fromThermomyceslanuginosus)，酶褶皱假丝酵母脂肪酶(Candidarugosalipase)，脂肪酶DF，脂肪酶RMIM(Lipase fromRhizomucormiehei)，猪胰脂肪酶(Porcine pancreas lipase)，牛血清蛋白中的一种，优选为脂肪酶RMIM(LipasefromRhizomucormiehei)。
所述反应的溶剂为水，异丙醇，甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺或正己烷中的一种，优选水。
所述的式II化合物和4-羟基香豆素的摩尔比为1:0.5～4，优选1:2。
所述的脂肪酶在所述反应中总体积浓度为c，其中0＜c≤30mg/mL，优选的脂肪酶的总体积浓度为10mg/mL。
所述反应的反应温度为25～65℃，优选的反应温度为45℃。
所述反应的反应时间为2～48h。
所述脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，包括如下步骤：将脂肪酶加入式II化合物和4-羟基香豆素的混合溶液中，催化反应生成双香豆素类化合物。
进一步的，所述脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，还包括反应完毕后过滤并回收溶剂或回收酶的步骤。
所述的回收酶包括：过滤反应体系，向滤渣中加入1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶。
进一步的，所述脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，还包括反应完毕的后处理步骤，包括：
(1)将反应完毕后的反应混合液过滤；
(2)滤渣中加入1,4-环氧六环，之后过滤；
(3)将步骤(2)得到的滤液蒸除溶剂，所余固体产物洗涤即得。
步骤(3)所述的洗涤为采用乙醇洗涤。
步骤(3)还包括将洗涤后的产物用乙醇重结晶的步骤。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了产物的新的合成方法。以脂肪酶为催化剂，可在纯水相中催化，提供了反应条件温和，操作简单，生产成本低，产率高，副产物少，底物适用范围广，对环境污染小的双香豆素类化合物合成方法。
(2)发掘了脂肪酶的新用途，特别是以4-羟基香豆素为底物的Knoevenagel-Michael级联反应。
(3)本发明所述的方法，产物收率为70～98％，相对于其他合成方法，具备较强的竞争优势。
(4)脂肪酶可重复使用，重复使用5次后仍具有较高的催化活性。
附图说明
图1是实施例8制得的4(双(4-羟基-2-氧代-2H-铬代-3-基)甲基)苯甲腈核磁共振氢谱图。
图2是实施例4制得的3,3'-((4(叔丁基)苯基)亚甲基)双(4-羟基-2H-铬烯-2-酮)核磁共振氢谱图。
图3是实施例6制得的3,3'-(噻吩-2-亚甲基)双(4-羟基-2H-铬烯-2-酮)核磁共振氢谱图。
图4是实施例7制得的3,3'-(丁烷-1,1-二基)双(4-羟基-2H-吡喃-2-酮)核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。所列的实施例仅作阐示之用，并表明本发明的精神和范围并非限于此中的细节及其修改案。
本发明所涉及的生物酶及其他试剂均为市场购买，其中试剂均未进一步纯化；核磁共振氢谱(1HNMR)用Bruker Advance 2B 400核磁共振波谱仪进行测定，频率为400MHz，溶剂为氘代DMSO，内标为四甲基硅(TMS)。
实施例1：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为93％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例2：
将1mmol苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入150mg脂肪酶RMIM，5mL水，65℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。2h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为89％，m.p.:231.9-232.3℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91–7.85(m,2H),7.62–7.54(m,2H),7.42–7.26(m,4H),7.26–7.18(m,2H),7.14(d,J＝7.4Hz,3H),6.35(s,1H)。
实施例3：
将1mmol对甲氧基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入5mg脂肪酶RMIM，5mL水，25℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。48h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为96％，m.p.:249-250℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),7.89(dd,J＝7.9,1.4Hz,2H),7.64–7.52(m,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,2H),7.34–7.27(m,2H),7.05(d,J＝8.1Hz,2H),6.79(d,J＝8.8Hz,2H),6.28(s,1H),3.70(s,3H)。
实施例4：
将1mmol对叔丁基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，55℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。24h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为88％，m.p.:250-251℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.81(s,2H),7.90(d,J＝7.9Hz,2H),7.64–7.53(m,2H),7.44–7.27(m,4H),7.24(d,J＝8.4Hz,2H),7.06(d,J＝8.1Hz,2H),6.31(s,1H),1.24(s,9H)。
实施例5：
将1mmol邻硝基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。8h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为黄色固体，收率为90％，m.p.:235-236℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.30(s,2H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(s,1H),7.88–7.82(m,2H),7.65–7.48(m,4H),7.29(dd,J＝17.1,8.2Hz,4H),6.38(s,1H)。
实施例6：
将1mmol2-噻吩甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入2.5mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为青色固体，收率为81％，m.p.:215-215.6℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.48(s,2H),7.88(dd,J＝7.8,1.2Hz,2H),7.60–7.51(m,2H),7.28(td,J＝8.4,2.2Hz,4H),7.19(d,J＝5.1Hz,1H),6.82(dd,J＝5.0,3.6Hz,1H),6.65(dd,J＝3.1,1.5Hz,1H),6.46(s,1H)。
实施例7：
将1mmol丁醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。48h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为87％，m.p.:123-124℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97–7.86(m,2H),7.55(t,J＝7.6Hz,2H),7.40–7.21(m,4H),4.90(td,J＝8.2,2.6Hz,1H),2.11–2.03(m,2H),1.20(t,J＝10.8Hz,2H),0.85(td,J＝7.2,2.0Hz,3H)。
实施例8：
将1mmol 4-氰基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为94％，m.p.：281-282℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.48(s,2H),7.86(d,J＝7.8Hz,2H),7.66(d,J＝8.3Hz,2H),7.56(t,J＝8.2Hz,2H),7.33(s,2H),7.31(s,2H),7.27(d,J＝7.4Hz,2H),6.35(s,1H)。
实施例9：
将1mmol 2-羟基-3-甲氧基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为86％，m.p.:273-274℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.18(s,2H),8.00(d,J＝7.5Hz,2H),7.70(t,J＝7.4Hz,1H),7.60(t,J＝7.6Hz,1H),7.51(t,J＝7.5Hz,2H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),7.36(s,1H),7.33(d,J＝7.9Hz,1H),7.08(t,J＝7.9Hz,1H),7.02(d,J＝7.9Hz,1H),6.76(d,J＝7.5Hz,1H),5.72(s,1H),3.94(s,3H)。
实施例10：
将1mmol吡啶-2-甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为93％，m.p.:278-281℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.64(d,J＝5.1Hz,1H),8.50–8.41(m,1H),7.92–7.86(m,2H),7.82(d,J＝1.5Hz,1H),7.80(d,J＝1.5Hz,1H),7.61–7.55(m,2H),7.34(d,J＝7.9Hz,2H),7.29–7.25(m,2H),6.52(s,1H)。
实施例11：
将1mmol 2，6-二氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。24h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为85％，m.p.:226-227℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.95(d,J＝7.9Hz,2H),7.66–7.52(m,2H),7.41–7.26(m,6H),7.18(dd,J＝8.6,7.3Hz,1H),6.23(s,1H)。
实施例12：
将1mmol对氯苯甲醛和4mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg牛血清蛋白BSA，5mL水，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。48h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为70％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例13：
将1mmol对氯苯甲醛和4mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶DF，5mL水，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。40h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为72％，m.p.:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例14：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶TLIM，5mL正己烷，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收正己烷，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为82％，m.p.:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例15：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶TLIM，5mL水，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为78％，m.p.:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例16：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL乙腈，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收乙腈，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为80％，m.p.:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例17：
将1mmol对氯苯甲醛和3mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL正己烷，35℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。24h后，过滤回收正己烷，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为85％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例18：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，30℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为78％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例19：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入100mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为89％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例20：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入20mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为75％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例21：
将1mmol对氯苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg重复使用4次后的脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为81％，mp:257-258℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),11.32(s,1H),8.07(d,J＝7.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),7.67–7.60(m,2H),7.47–7.34(m,4H),7.30(s,1H),7.26(s,1H),7.15(d,J＝7.8Hz,2H),6.04(s,1H)。
实施例22：
将2mmol间硝基苯甲醛和1mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入0.5mg南极假丝酵母脂肪酶B，5mL异丙醇，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。48h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为66％。m.p.:235-236℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.30(s,2H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(s,1H),7.88–7.82(m,2H),7.65–7.48(m,4H),7.29(dd,J＝17.1,8.2Hz,4H),6.38(s,1H)。
实施例23：
将1mmol对硝基苯甲醛和1mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入75mgNovozym435脂肪酶，5mL甲苯，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。18h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为82％。m.p.:236.6-237℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.08(d,J＝8.8Hz,2H),7.84(dd,J＝7.9,1.4Hz,2H),7.57–7.54(m,2H),7.39(d,J＝8.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),7.27(t,J＝7.5Hz,2H),6.37(s,1H)。
实施例24：
将1mmol对羟基苯甲醛和1.5mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg酶褶皱假丝酵母脂肪酶，5mL二氯甲烷，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。36h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为81％。m.p.:211-212℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.23(s,3H),7.89(d,J＝7.9Hz,2H),7.65–7.52(m,2H),7.33(dd,J＝14.4,7.7Hz,4H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H),6.62(d,J＝8.5Hz,2H),6.24(s,1H)。
实施例25：
将1mmol邻羟基苯甲醛和2.5mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg猪胰脂肪酶，5mL四氢呋喃，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为56％。m.p.:160-161℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ17.07(s,2H),7.78(dd,J＝7.4,2.0Hz,2H),7.29(td,J＝7.3,1.7Hz,2H),7.22(s,1H),7.15–7.07(m,2H),7.04(td,J＝7.6,2.1Hz,2H),6.99(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.86(td,J＝7.6,1.9Hz,1H),6.80(dd,J＝7.3,1.9Hz,1H),5.82(s,1H)。
实施例26：
将1mmol对氟苯甲醛和3mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL二甲基亚砜，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为94％。m.p.:215.5-215.7℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.66(s,2H),8.01–7.83(m,2H),7.69–7.51(m,2H),7.40–7.23(m,4H),7.16(dd,J＝8.0,5.7Hz,2H),7.02(t,J＝8.8Hz,2H),6.30(s,1H)。
实施例27：
将1mmol对甲基苯甲醛和3.5mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mLN,N-二甲基甲酰胺，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为88％。m.p.:273-274℃；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.33(s,2H),7.89(dd,J＝7.9,1.2Hz,2H),7.70–7.49(m,2H),7.49–7.14(m,4H),7.02(s,4H),6.30(s,1H),2.24(s,3H)。
实施例28：
将1mmol3-吲哚甲醛和4mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。14h后，过滤回收溶剂，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，收率为81％。
实施例29：
将1mmol 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为90％。
实施例30：
将1mmol正己醛和2mmol4-羟基香豆素，加入10mL反应瓶中，然后加入50mg脂肪酶RMIM，5mL水，45℃下搅拌反应，TLC(正己烷/乙酸乙酯，1/2，v/v)监测反应进程。20h后，过滤回收水，滤渣加1,4-环氧六环溶解并过滤回收酶，滤液减压旋蒸回收1,4-环氧六环，滤渣用冷乙醇洗涤获得粗产物，粗产物用热乙醇重结晶获得纯化的目标产物，目标产物为白色固体，收率为90％。
Claims (9)
1.一种脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，其特征在于，包括：以4-羟基香豆素为底物，利用脂肪酶催化进行Knoevenagel-Michael级联反应与式II化合物生成双香豆素类化合物，反应方程式为：
其中，Ar为4-ClC6H4，2-NO2C6H4，3-NO2C6H4，4-NO2C6H4，4-OHC6H4，2-OHC6H4，4-CNC6H4，4-FC6H4，C6H5，4-CH3C6H4，4-OCH3C6H4，2-OH-3-OCH3C6H3，2,6-Cl2C6H3，4-C4H9C6H4，2-SC4H3，2-NC5H4，3-NC8H6，2-OH-4-OCH3C6H3，C5H11或C3H7。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所选脂肪酶选自南极假丝酵母脂肪酶B，Novozym435脂肪酶，来自疏棉状嗜热丝孢菌的脂肪酶，酶褶皱假丝酵母脂肪酶，脂肪酶DF，脂肪酶RMIM，猪胰脂肪酶或牛血清蛋白中的一种；优选为脂肪酶RMIM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的溶剂为水，异丙醇，甲苯，二氯甲烷，四氢呋喃，乙腈，二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺或正己烷中的一种；优选为水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的式II化合物和4-羟基香豆素的摩尔比为1:0.5～4，优选1:2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶在所述反应中总体积浓度为c，其中0＜c≤30mg/mL；优选的所述的脂肪酶在所述反应中总体积浓度为10mg/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应温度为25～65℃，优选的反应温度为45℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应时间为2～48h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，还包括反应完毕后过滤并回收溶剂或回收酶的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶催化合成双香豆素类化合物的方法，还包括反应完毕的后处理步骤，包括：
(1)将反应完毕后的反应混合液过滤；
(2)滤渣中加入1,4-环氧六环，之后过滤；
(3)将步骤(2)得到的滤液蒸除溶剂，所余固体产物洗涤即得。
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