CN109444410A - 一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒 - Google Patents

一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括包被了狂犬病毒抗原的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。本发明检测方法效率高、灵敏性高、特异性强、自动化程度高，操作简单快速且检测范围广、无污染、保存时间长，能有效改善目前市面上产品的不足。

Description

一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒引起的一种传染性强、危害性大、病死率高的人畜共患病，目前尚无可以治愈狂犬病的药物。我国是狂犬病的高发国家，针对狂犬病的措施以预防为主。犬、猫等动物是狂犬病毒的主要储存宿主和传播宿主，因此，对狂犬病流行地区的犬、猫等动物实行强制免疫接种与免疫后抗体效价监测相结合，是防控措施的重要环节。动物体内狂犬病毒中和抗体的高低是衡量疫苗免疫效果的重要指标。
目前，WHO和OIE推荐的用于狂犬病毒抗体检测的方法有快速荧光灶抑制试验（Rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）、荧光抗体病毒中和试验（Fluorescence antibody virus neutralization test，FAVNT）。近年来，国内外先后报道了多种狂犬病毒抗体检测技术，如流式细胞计数法、间接ELISA技术、竞争ELISA技术、夹心ELISA技术、胶体金层析诊断试纸条技术等。
中国专利公开号为CN101936998B的专利申请公开了一种犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，中国专利公开号为CN1547027A的专利公开了一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法。以上专利均为ELISA检测方法，用时长，操作自动化程度低。
中国专利公开号为CN1326101A的专利申请公开了一种胶体金免疫层析狂犬病病毒抗体检测试剂条及制备方法，中国专利公开号为CN104360061A的专利申请公开了一种狂犬病病毒IgG抗体免疫金标检测试纸及制备方法。以上专利均为胶体金检测方法，均为定性检测，灵敏度和特异性较低。
RFFIT和FAVNT两种方法虽能准确测定狂犬病毒中和抗体水平，但均需采用活细胞和活病毒进行测定，均需昂贵的实验器材，且检测时间长，因此不适用于大规模的血清检测。ELISA技术、胶体金等方法不能兼顾效率高、灵敏性高、特异性强和自动化程度高等优点，且上样量较大，需要血清样本量大。
发明内容
为解决上述现有技术的不足，提供一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测方法。此检测方法效率高、灵敏性高、特异性强、自动化程度高，操作简单快速且检测范围广、无污染、保存时间长，能有效改善目前市面上产品的不足。本发明应用于检测动物血清或血浆中狂犬病毒中和抗体的浓度。
为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：
一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括包被了狂犬病毒抗原的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。
所述狂犬病毒抗原为自身带有活性基团或经过修饰获得活性基团的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒。
所述活性基团为氨基、羧基、巯基或羟基。
所述毛细管为高精度毛细管，其外径为1.18±0.02mm，内径为0.7±0.005m、长度为30±1mm；材质为高硼硅3.3玻璃。
所述毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种。
所述包被了狂犬病毒抗原的毛细管通过如下方法制成：该方法包括修饰毛细管步骤，修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒步骤，包被步骤和封闭步骤；
所述修饰毛细管步骤具体为：
利用修饰剂修饰毛细管，使得毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种；
所述修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒步骤具体为：
利用修饰剂修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，使得狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述包被步骤具体为：
活化：活化的方式有三种：第一种：用偶联剂活化修饰后的毛细管，第二种：用偶联剂活化修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，第三种，在包被液中加入偶联剂；
配制包被液：当活化采用第一种方式，配制包被液具体为：将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅰ；当活化采用第二种方式，配制包被液具体为：将活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅱ；当活化采用第三种方式，配制包被液具体为：将偶联剂和缓冲液混合制成活化缓冲液，然后用活化缓冲液将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅲ；
偶联：当活化采用第一种方式，具体的偶联为：将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；当活化采用第二种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；当活化采用第三种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅲ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；
所述封闭步骤具体为：
用1～5%（质量体积百分比）的 BSA或1～5%（质量体积百分比）的脱脂奶粉溶于0.01～0.1M的Tris-HCl中（0.01～0.1M Tris-HCl配制方法为：称取1.57～15.76 g Tris-HCl溶于1 L注射水；），制成封闭液；将包被后的毛细管浸泡在封闭液中，封闭温度为37 ℃，封闭时间为2～4 h，封闭完成后，清洗并干燥毛细管，所述封闭液的pH为7.2～7.8；
偶联步骤和封闭步骤中清洗毛细管时用清洗剂清洗，清洗剂为0.02 M～0.2 M PBS，pH为7.2～7.8，其中含0.01～0.1%（体积百分比）Tween 20；
封闭后的包被了狂犬病毒抗原的毛细管真空包装在温度为2～8℃的条件下保存。
所述酶结合物为狂犬病毒G蛋白重组抗原与碱性磷酸酶偶联后的产物。
所述酶结合物通过如下方法制成：该方法包括修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原步骤、活化步骤、偶联步骤、纯化步骤和稀释步骤；
所述修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原步骤具体为：利用修饰剂狂犬病毒G蛋白重组抗原，使得狂犬病毒G蛋白重组抗原连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述活化步骤具体为：利用偶联剂活化碱性磷酸酶或者狂犬病毒G蛋白重组抗原；
所述偶联剂活化碱性磷酸酶或者狂犬病毒G蛋白重组抗原是指用偶联剂活化碱性磷酸酶或者狂犬病毒G蛋白重组抗原的氨基、羧基、巯基或羟基。
所述偶联步骤具体为：将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原与活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；或者将活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原与碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；
所述纯化步骤具体为：将偶联后的酶结合物过凝胶柱，然后进行纯化；
所述稀释步骤具体为：用0.02 M～0.2 M，pH为7.2～7.8 的Tris-HCl将纯化后的酶结合物稀释至浓度为0.5～5µg/mL的酶结合物。
还包括防腐步骤，防腐步骤具体为：在稀释后的酶结合物中加入BSA或酪蛋白，Tween 20和防腐剂制成最终的酶结合物，分装，密封，在温度为2～8℃的条件下保存；在最终的酶结合物中，BSA或酪蛋白的质量体积百分比为0.1～5%，Tween 20的体积百分比为0.01～0.1%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%。
所述偶联剂优选为碳二亚胺、戊二醛、SMCC或者SMCC的衍生物。
所述发光底物为：APS-5。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，因此APS-5可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。所述发光底物分装，密封，在2～8℃避光保存。
所述清洗液通过如下方法配制而成：将Tween 20、曲拉通、 NaCl和防腐剂，溶于0.02 M～0.2 M 的Tris-HCl中，制成清洗液，所述清洗液中Tween 20 的体积百分比为0.01～0.1%，曲拉通的体积百分为0.01～0.1%，：NaCl的质量体积百分比为0.85～0.9%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%，所述清洗液的pH为7.2～7.8。
所用到的修饰剂优选为SATA、DTT、TCEP、2-MEA或2-IT。
使用本发明测定兽用狂犬病毒中和抗体的具体步骤为：将2～8℃保存的试剂盒恢复至室温后，取出已包被的毛细管，接触血清或血浆，通过自身的虹吸作用使毛细管充满血清或血浆，放入全自动化学发光免疫分析仪检测发光值，再利用内置校准曲线计算出动物血清或血浆中狂犬病毒中和抗体的浓度。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本试剂盒以毛细管为反应载体，利用全自动化学发光免疫分析平台，实现全自动化学发光检测，检测过程不需要人工操作。本试剂盒的毛细管以化学键的形式与狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒偶联，并不依靠物理吸附作用包被，其提高了抗原包被的稳定性，且这种化学键的偶联方式并不破坏抗原的生物活性。由于毛细管具有虹吸作用，因此加样操作更简单、快捷，不需要用移液器等辅助工具。本试剂盒的酶结合物稳定，2～8℃可长期保存。本试剂盒的发光底物平台期长且稳定，能有效降低加入发光底物后等待检测产生的时间差异带来的误差。本试剂盒检测过程涉及的孵育、清洗、加酶、清洗、加发光底物等步骤，均由仪器自动完成，因此重复性能够得到保证。
本试剂盒的有效期长达18个月，超过了市面上大部分胶体金检测卡、ELISA试剂盒能达到的有效保存期，稳定性更好。已包被毛细管和酶结合物性能稳定，有效期内包被抗原、酶结合物的降解率均小于10%。本试剂盒灵敏度高，特异性强。线性范围为0.03125～8IU，与进口试剂盒比对，相关性在0.95以上。试剂盒批内批间CV均小于10%。本试剂盒与犬瘟、细小等动物疫病抗体无交叉反应。
附图说明
图1为2-IT（Traut’s Reagent）修饰示意图；
图2为SMCC活化偶联示意图；
图3为碳二亚胺偶联示意图；
图4为戊二醛偶联示意图。
具体实施方式
本试剂盒包括包被了狂犬病毒抗原的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。本试剂盒各组分的制备方法如下。
毛细管包被狂犬病毒抗原
本发明以高精度毛细管为载体，利用修饰剂使毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基，及其衍生基团中的一种，再利用偶联剂与待包被的蛋白偶联。
狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒通过自身活性基团或经过修饰获得的活性基团，包括氨基、羧基、巯基、羟基等，利用偶联剂与毛细管上的活性基团偶联，获得已包被抗原的毛细管。应用的偶联剂包括但不限于碳二亚胺，戊二醛， SMCC。修饰剂包括但不限于SATA, DTT,TCEP,2-MEA，2-IT等。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
包被了狂犬病毒抗原的毛细管的制备：
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，连上巯基：
待包被狂犬病毒抗原浓度为2mg/mL，2-IT使用量为待包被狂犬病毒抗原摩尔量的2倍，二者混合于0.01M PBS (pH为8)，室温反应0.5h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为6.5)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.01M PBS(pH为7)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为0.1mg/mL。室温反应15min。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒偶联。修饰后连上巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.02M PBS (pH为7.2)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应0.5h。用清洗剂清洗、干燥。包被抗原的毛细管用1% （质量体积百分比）BSA溶于0.01M Tris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2℃保存。所用到的清洗剂为0.02 M PBS(pH为7.2)，含0.01%（体积百分比） Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为稀释至一定浓度的狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物。
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原，在蛋白氨基处连上巯基。狂犬病毒G蛋白重组抗原的浓度为2mg/mL，2-IT(Traut’s Reagent)使用量为狂犬病毒G蛋白重组抗原摩尔量的2倍，二者混合于0.01M PBS(pH为8)，室温反应0.5h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为6.5)。
利用SMCC或其衍生物活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为3mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的5倍，二者混合于0.01M PBS(pH为7)，室温反应0.5 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为2℃，偶联时间为12 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.02 MTris-HCl(pH为7.2)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为0.5µg/mL的酶结合物，加入0.1% （质量体积百分比）BSA或酪蛋白，0.01% （体积百分比）Tween20,并添加0.01%（体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为4-氯苯巯基10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制：0.01% （体积百分比）Tween 20，0.01%（体积百分比）曲拉通，0.85%（质量体积百分比）NaCl，0.01%（体积百分比） 防腐剂，溶于0.02 M Tris-HCl(pH为7.2)。分装，密封，2～8℃保存。
上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品通过抽检合格后方可出厂。
操作步骤：
将2℃保存的试剂盒恢复至室温后，取出已包被的毛细管，接触血清或血浆，通过自身的虹吸作用使毛细管充满血清或血浆，放入全自动化学发光免疫分析仪检测发光值，再利用内置校准曲线计算出动物血清或血浆中狂犬病毒中和抗体的浓度。
实施例2
与实施例1的差别仅在于利用狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒上用SMCC活化后的氨基，与毛细管修饰的巯基偶联，获得已包被抗原的毛细管。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：通过碳二亚胺将狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒的羧基与氨化毛细管上的氨基偶联，获得已包被抗原的毛细管。辅助试剂为N-羟基琥珀酰亚胺，提高中间反应产物的稳定性。
利用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒上的羧基：
待活化狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒浓度为1mg/mL，碳二亚胺浓度为1 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.01～0.1M MES(pH为5)。室温反应15 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为7.0)。活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.01M PBS(pH为7.0)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应15 min。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。包被抗原的毛细管用1% （质量体积百分比）BSA溶于0.01M Tris-HCl (pH为7.2)的封闭液37℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 MPBS (pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
实施例4
本实施例与实施例3基本相同，与实施例3的差别仅在于利用狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒的氨基与毛细管修饰的羧基偶联，获得已包被抗原的毛细管。
实施例5
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为0.2mM，缓冲液为0.01M MES(pH为5)，配制成活化缓冲液：
狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用活化缓冲液配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应0.5 h。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止，干燥。包被抗原的毛细管用1% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.01MTris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 M PBS (pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
实施例6
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：戊二醛偶联狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒的氨基与毛细管修饰的氨基：
戊二醛用0.01M PBS(pH为7配制成浓度为1% 的活化缓冲液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应2h。用0.01MPBS(pH为7)清洗干燥。将狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.01M PBS(pH为7)配制成浓度为5µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应2h。用0.02 M Tris-HCl (pH为7.2)终止用清洗剂清洗，干燥。包被狂犬病毒抗原的毛细管用1% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.01M Tris-HCl (pH为7.2)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.02 M PBS (pH为7.2)，含0.01% （体积百分比）Tween 20。
实施例7
本实施例与实施例1基本相同，与实施例1的差别仅在于酶结合物是利用狂犬病毒G蛋白重组抗原SMCC活化后的氨基，与碱性磷酸酶修饰后得到的巯基偶联，获得偶联产物。
实施例8
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：酶结合物是通过碳二亚胺将狂犬病毒G蛋白重组抗原的羧基与碱性磷酸酶的氨基偶联获得的偶联产物，辅助试剂为N-羟基琥珀酰亚胺，提高中间反应产物的稳定性：
利用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化狂犬病毒G蛋白重组抗原上的羧基。狂犬病毒G蛋白重组抗原浓度为1mg/mL，碳二亚胺浓度为1 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.01M MES(pH为5)。室温反应15min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.01M PBS(pH为7.0)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应2h。加入终浓度为10 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.02 MMTris-HCl(pH为7.2)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为0.5µg/mL的酶结合物，加入0.1%（质量体积百分比） BSA或酪蛋白，0.01% （体积百分比）Tween 20,并添加0.05% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
实施例9
本实施例与实施例8基本相同，与实施例3的差别仅在于酶结合物是利用狂犬病毒G蛋白重组抗原氨基，与碱性磷酸酶的羧基偶联，获得的偶联产物。
实施例10
包被了狂犬病毒抗原的毛细管的制备：
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，连上巯基：
待包被狂犬病毒抗原浓度为4mg/mL，2-IT使用量为待包被狂犬病毒抗原摩尔量的20倍，二者混合于0.1M PBS(pH为9)，室温反应1.5 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC或其衍生物活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.1M PBS(pH为9)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为2mg/mL。室温反应60 min。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒偶联。修饰后连上巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应2 h。用清洗剂清洗、干燥。包被抗原的毛细管用5%（质量体积百分比） BSA溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2～8℃保存。所用到的清洗剂为0.2M PBS (pH为7.8)，含0.1%（体积百分比） Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为稀释至一定浓度的狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物。
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原，在蛋白氨基处连上巯基。狂犬病毒G蛋白重组抗原的浓度为4mg/mL，2-IT使用量为狂犬病毒G蛋白重组抗原摩尔量的20倍，二者混合于0.1MPBS(pH为9)，室温反应1.5 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。
利用SMCC或其衍生物活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为5mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的20倍，二者混合于0.1M PBS(pH为8)，室温反应1 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为8℃，偶联时间为18 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.2 MTris-HCl(pH为7.8)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为5µg/mL的酶结合物，加入5% （质量体积百分比）BSA或酪蛋白， 0.1%（体积百分比） Tween 20,并添加0.05% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为4-氯苯巯基10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封， 2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制： 0.1% （体积百分比）Tween 20， 0.1%（体积百分比）曲拉通， 0.9%（质量体积百分比）NaCl， 0.05%（体积百分比） 防腐剂，溶于0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)。分装，密封，2～8℃保存。
实施例11
包被了狂犬病毒抗原的毛细管的制备：
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，在蛋白氨基处连上巯基：
待包被狂犬病毒抗原浓度为3mg/mL，2-IT使用量为待包被狂犬病毒抗原摩尔量的10倍，二者混合于0.08M PBS(pH为8.5)，室温反应1 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.06M PBS(pH为7)。
通过修饰剂将毛细管连上氨基，利用SMCC或其衍生物活化修饰后毛细管上的氨基：
SMCC首先溶于二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺或其他有机溶剂，再溶于0.05M PBS(pH为8)，加入已修饰的毛细管并浸没，SMCC浓度为1mg/mL。室温反应40 min。用0.1 M Tris-HCl (pH为7.5)终止，干燥。
SMCC活化后的毛细管与已修饰有巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒偶联。修饰后连上巯基的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.08 M Tris-HCl (pH为7.6)配制成浓度为25µg/mL的待包被蛋白溶液，加入SMCC活化毛细管并浸没。室温反应1.5 h。用清洗剂清洗、干燥。包被抗原的毛细管用3%（质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.04M Tris-HCl (pH为7.4)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗、干燥，真空包装2～8℃保存。所用到的清洗剂为0.1 M PBS (pH为7.6)，含0.07%（体积百分比） Tween 20。
酶结合物的制备：
酶结合物为稀释至一定浓度的狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物。
修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原，在蛋白氨基处连上巯基。狂犬病毒G蛋白重组抗原的浓度为2.5mg/mL，2-IT使用量为狂犬病毒G蛋白重组抗原摩尔量的16倍，二者混合于0.06M PBS(pH为8.8)，室温反应1.2 h。过脱盐柱除去未反应的2-IT，并更换缓冲液为0.06MPBS(pH为7)。
利用SMCC活化碱性磷酸酶上的氨基。碱性磷酸酶的浓度为3.5mg/mL，SMCC使用量为碱性磷酸酶摩尔量的15倍，二者混合于0.08M PBS(pH为7.5)，室温反应0.8 h。脱盐柱除去未反应的SMCC。
巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物。巯基化的狂犬病毒G蛋白重组抗原与SMCC活化后的碱性磷酸酶偶联时，摩尔量为1:1，偶联温度为7℃，偶联时间为15 h。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.08 MTris-HCl(pH为7.6)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为4µg/mL的酶结合物，加入4%（质量体积百分比） BSA或酪蛋白， 0.05%（体积百分比） Tween20,并添加0.03% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
发光底物的制备：
本试剂盒的发光底物为4-氯苯巯基10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基磷酸二钠盐（APS-5）。该底物与碱性磷酸酶（ALP）混合后，碱性磷酸酶磷酸根水解，底物立即发生分解反应释放出光子，在特定的碱性磷酸酶浓度范围内，释放的光子数量与溶液中碱性磷酸酶的浓度成正比，所以可以用于碱性磷酸酶的定量检测。此底物灵敏度高，可持续稳定高效地发光。分装，密封，2～8℃避光保存。
清洗液的制备：
清洗液配制：0.08% （体积百分比）Tween 20，0.06%（体积百分比）曲拉通，0.88%（质量体积百分比）NaCl，0.04%（体积百分比）防腐剂，溶于0.18 M Tris-HCl(pH为7.5)。分装，密封，2～8℃保存。
实施例12
本实施例与实施例3基本相同，不同的是：
待活化狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒浓度为10mg/mL，碳二亚胺浓度为5 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)。室温反应60 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.1M PBS(pH为7.5)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应60 min。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止，干燥。包被抗原的毛细管用5% （质量体积百分比）BSA溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS (pH为7.8)，含0.1% （体积百分比）Tween 20。
实施例13
本实施例与实施例3基本相同，不同的是：待活化狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒浓度为8 mg/mL，碳二亚胺浓度为4 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为6 mM，缓冲液为0.05M MES(pH为6)。室温反应30 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.06M PBS(pH为7.2)。活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.06M PBS(pH为7.2)配制成浓度为15µg/mL的待包被蛋白溶液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没。室温反应45 min。用0.08M Tris-HCl (pH为7.6)终止，干燥。包被抗原的毛细管用（质量体积百分比）3% 脱脂奶粉溶于0.06M Tris-HCl (pH为7.5)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.1 M PBS (pH为7.6)，含0.06% （体积百分比）Tween20。
实施例14
本实施例与实施例5基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为2 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)，配制成活化缓冲液：
狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用活化缓冲液配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应1 h。用0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)终止，干燥。包被抗原的毛细管用5%（质量体积百分比） BSA溶于0.01～0.1MTris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS (pH为7.8)，含0.1% （体积百分比）Tween 20。
实施例15
本实施例与实施例5基本相同，不同的是：碳二亚胺浓度为1mM，缓冲液为0.8M MES(pH为6)，配制成活化缓冲液：
狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用活化缓冲液配制成浓度为25µg/mL的待包被蛋白溶液，加入氨化毛细管，室温反应0.8h。用0.1 M Tris-HCl (pH为7.6)终止，干燥。包被抗原的毛细管用4% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.06MTris-HCl (pH为7.6)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为3 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.1 M PBS (pH为7.6)，含0.08% （体积百分比）Tween 20。
实施例16
本实施例与实施例6基本相同，不同的是：戊二醛用0.1M PBS(pH为8)配制成浓度为5%（体积百分比）的活化缓冲液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应4 h。用0.1MPBS(pH为8)清洗干燥。将狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.1M PBS(pH为8)配制成浓度为30µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应4 h。用0.2 M Tris-HCl (pH为7.8)终止用清洗剂清洗，干燥。包被狂犬病毒抗原的毛细管用5% （质量体积百分比）脱脂奶粉溶于0.1M Tris-HCl (pH为7.8)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为4 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.2 M PBS (pH为7.8)，含0.1% （体积百分比）Tween 20。
实施例17
本实施例与实施例6基本相同，不同的是：戊二醛用0.06M PBS(pH为7.5)配制成浓度为3% 的活化缓冲液，加入已修饰有氨基的毛细管并浸没，室温反应3 h。用0.06M PBS(pH为7.5)清洗干燥。将狂犬病毒G蛋白重组抗原或灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒用0.08M PBS(pH为7.6)配制成浓度为15µg/mL的待包被蛋白溶液，加入戊二醛处理后的氨化毛细管并浸没，室温反应3.5 h。用0.12M Tris-HCl (pH为7.5)终止用清洗剂清洗，干燥。包被狂犬病毒抗原的毛细管用3%（质量体积百分比）BSA溶于0.07M Tris-HCl (pH为7.4)的封闭液37 ℃封闭，封闭时间为2.5 h。封闭后用清洗剂清洗干燥，真空包装2～8℃保存。清洗剂为0.12 MPBS (pH为7.6)，含0.05%（体积百分比）Tween 20。
实施例18
本实施例与实施例8基本相同，不同的是：狂犬病毒G蛋白重组抗原浓度为10 mg/mL，碳二亚胺浓度为5 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为10 mM，缓冲液为0.1M MES(pH为7)。室温反应60 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.1M PBS(pH为7.5)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应4 h。加入终浓度为20 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.2 M Tris-HCl(pH为7.8)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为5µg/mL的酶结合物，加入5%（质量体积百分比）酪蛋白， 0.1% （体积百分比）Tween 20,并添加0.05%（体积百分比） 防腐剂，分装，密封， 2～8℃保存。
实施例19
本实施例与实施例8基本相同，不同的是：狂犬病毒G蛋白重组抗原浓度为8 mg/mL，碳二亚胺浓度为4 mM，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为6 mM，缓冲液为0.05M MES(pH为6)。室温反应55 min。过脱盐柱除去未反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，并更换缓冲液为0.07M PBS(pH为7.3)。加入摩尔量1:1的碱性磷酸酶，混匀，室温反应3.8h。加入终浓度为15 mM的羟胺终止。过凝胶柱，纯化偶联产物，并更换缓冲液为0.18 M Tris-HCl(pH为7.6)，收集狂犬病毒G蛋白重组抗原偶联碱性磷酸酶产物，稀释至浓度为3µg/mL的酶结合物，加入3% （质量体积百分比）BSA，0.08% （体积百分比）Tween 20,并添加0.03% （体积百分比）防腐剂，分装，密封，2～8℃保存。
英语缩写解释：
SMCC：4-(N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
SATA：N-琥珀酰亚胺-S-乙酰硫代乙酸酯
DTT：二硫苏糖醇
TCEP：三(2-羧乙基)膦
2-MEA：2-巯基乙胺盐酸
2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐
PBS：磷酸盐缓冲液
MES：2-吗啉乙磺酸缓冲液
Tween：吐温
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸，Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris，用氢氧化钠调节pH
BSA：牛血清白蛋白
APS-5：（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐。

Claims (9)

1.一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括包被了狂犬病毒抗原的毛细管、酶结合物、发光底物和清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述狂犬病毒抗原为自身带有活性基团或经过修饰获得活性基团的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒。
3.根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述包被了狂犬病毒抗原的毛细管通过如下方法制成：该方法包括修饰毛细管步骤，修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒步骤，包被步骤和封闭步骤；
所述修饰毛细管步骤具体为：利用修饰剂修饰毛细管，使得毛细管上带有氨基、羧基、羟基、巯基、醛基、环氧基、氰酸酯基、异氰酸酯基、氰基、异氰基、马来酰胺氨基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基、酚羟基或者酚羟基衍生基团中的一种；
所述修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒步骤具体为：利用修饰剂修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，使得狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述包被步骤具体为：
活化：活化的方式有三种：第一种：用偶联剂活化修饰后的毛细管，第二种：用偶联剂活化修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒，第三种，在包被液中加入偶联剂；
配制包被液：当活化采用第一种方式，配制包被液具体为：将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅰ；当活化采用第二种方式，配制包被液具体为：将活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅱ；当活化采用第三种方式，配制包被液具体为：将偶联剂和缓冲液混合制成活化缓冲液，然后用活化缓冲液将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原、灭活狂犬病全病毒或狂犬病毒病毒样颗粒稀释至为5～30µg/mL，制成包被液Ⅲ；
偶联：当活化采用第一种方式，具体的偶联为：将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；当活化采用第二种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；当活化采用第三种方式，具体的偶联为：将修饰后的毛细管浸泡在包被液Ⅲ中，偶联完成后，清洗并干燥毛细管，获得包被了狂犬病毒抗原的毛细管；
所述封闭步骤具体为：用BSA或脱脂奶粉溶于Tris-HCl中，制成封闭液；将包被后的毛细管浸泡在封闭液中，封闭2～4 h后，清洗并干燥毛细管。
5.根据权利要求4所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述封闭步骤中，所述封闭液中，BSA或脱脂奶粉的质量体积百分比为1～5%，Tris-HCl的浓度为0.01～0.1M，封闭液的pH为7.2～7.8，封闭温度为37 ℃。
6.根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述酶结合物通过如下方法制成：该方法包括修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原步骤、活化步骤、偶联步骤、纯化步骤和稀释步骤；
所述修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原步骤具体为：利用修饰剂使得修饰狂犬病毒G蛋白重组抗原，使得狂犬病毒G蛋白重组抗原连上氨基、羧基、巯基或羟基；
所述活化步骤具体为：利用偶联剂活化碱性磷酸酶或者狂犬病毒G蛋白重组抗原；
所述利用偶联剂活化碱性磷酸酶是指用偶联剂活化碱性磷酸酶的氨基、羧基、巯基或羟基；
所述偶联步骤具体为：将修饰后的狂犬病毒G蛋白重组抗原与活化后的碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；或者将活化后的狂犬病毒G蛋白重组抗原与碱性磷酸酶混合，偶联形成酶结合物；
所述纯化步骤具体为：将偶联后的酶结合物过凝胶柱，然后进行纯化；
所述稀释步骤具体为：用0.02 M～0.2 M，pH为7.2～7.8 的Tris-HCl将纯化后的酶结合物稀释至浓度为0.5～5µg/mL的酶结合物。
7.根据权利要求6所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：还包括防腐步骤，防腐步骤具体为：在稀释后的酶结合物中加入BSA或酪蛋白，Tween 20和防腐剂制成最终的酶结合物，分装，密封，在温度为2～8℃的条件下保存。
8.根据权利要求7所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：在最终的酶结合物中，BSA或酪蛋白的质量体积百分比为0.1～5%，Tween 20的体积百分比为0.01～0.1%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%。
9.根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病毒中和抗体化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述清洗液通过如下方法配制而成：将Tween 20、曲拉通、 NaCl和防腐剂，溶于0.02 M～0.2 M 的Tris-HCl中，制成清洗液，所述清洗液中Tween 20 的体积百分比为0.01～0.1%，曲拉通的体积百分比为0.01～0.1%，：NaCl的质量体积百分比为0.85～0.9%，防腐剂的体积百分比为0.01～0.05%，所述清洗液的pH为7.2～7.8。
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