CN109444105A - 一种检测dna糖基化酶udg的荧光生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于聚合酶协助反馈滚环扩增和内切酶放大荧光法检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器。为了解决以上现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低的问题。一种基于反馈滚环扩增技术检测UDG的生物传感器，将phi29聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现滚环放大作用，以及荧光基团与猝灭基团的荧光共振能量转移，均相反应混合液。制备方法：环形模板及复合探针的构建；反馈滚环放大信号、荧光检测；利用了UDG酶对碱基U的特异性水解，利用这种特殊反应可以精准地测定UDG，同时还可以避免干扰的发生；利用核酸内切酶Ⅳ循环放大，实现信号放大的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于反馈滚环扩增和核酸内切酶信号放大的荧光生物传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
DNA糖基化酶UDG是一种重要的碱基切除修复酶，负责修复由尿嘧啶引起的DNA损伤和维护基因组的完整性，同时UDG的异常表达也与多种癌症相关联。水解胞嘧啶生成尿嘧啶是DNA水解损伤中最常见的一种形式，从而导致在DNA复制过程中G：C碱基对转变成A：U碱基对。UDG作为碱基切除修复路径的启动者和“巡逻兵”，具有对尿嘧啶的高特异性，因此可作用于识别和催化单链或双链DNA上的N-糖苷键的水解和***。随后，释放了受损的碱基并产生了一种无嘌呤无嘧啶的位点（即AP 位点）并触发DNA修复过程，并通过附加的AP内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶的协调作用来移除AP位点，以取代正常的胞嘧啶碱基。其结果是在DNA损伤修复和连接中，酶对于碱基切除修复酶的活性是与人体疾病具有一定的相关性。异常的UDG作用可以诱发基因突变与多种疾病直接相关包括癌症，基因型疾病，人类免疫缺陷。碱基切除修复酶活性的研究对了解DNA损伤修复的生理反应呈现出关键性生物学意义。因此，UDG作为一种潜在的生物标志物，进行高灵敏、高选择性检测对其基础功能研究和临床诊断都具有重要意义。
经典的UDG活性检测方法主要有放射性标记法、凝胶电泳法、质谱分析法。以上方法短板在于耗费时间、灵敏度较低、并且需要对样品进行预处理。
发明内容
为了解决现有技术中检测UDG的方法特异性和灵敏度都比较低、检测周期长的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、检测速度快的，基于聚合酶协助反馈滚环扩增和内切酶放大荧光法检测DNA糖基化酶UDG的生物传感器，同时还提供了其制备方法。
一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器，包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液；
所述的复合探针I由U-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；
所述的复合探针II由S-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；
所述的环状模板由线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板；
所述的碱基序列如下：
U-DNA序列如SEQ No.1所示；
线性挂锁探针C-DNA序列如SEQ No.2所示；
连接探针L-DNA序列如SEQ No.3所示；
S-DNA序列如SEQ No.4所示；
所述的U-DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U，代表尿嘧啶碱基；U-DNA的3’端修饰Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用；
所述的C-DNA中的5’端修饰磷酸基团；
所述的S-DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团，然后还有个四氢呋喃修饰位点，即无嘌呤无嘧啶位点；第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团；3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。
上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）环形模板构建；
（2）复合探针I、复合探针II的制备；
（3）均相反应；
（4）荧光检测：荧光仪设置激发波长为486 nm，检测518 nm处荧光强度，检测范围为450nm-530 nm。
所述步骤（1）具体工艺为：
S1 将 C-DNA和L-DNA 6 加入到EP管中，在95 ℃下孵育5 min，缓慢冷却至室温；随后放入到16 ℃水浴中，过夜反应；
S2 然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶，将其在16 ℃下反应20 h；
S3灭活体系中的T4 DNA连接酶；
S4 向上述反应体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。
所述的步骤（2）中复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、U-DNA、PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min，使环形模板与U-DNA充分杂交，制备成复合探针I。
所述的步骤（2）中复合探针II的制备工艺为：将环形模板、灭菌水、PBS缓冲液、S-DNA在37℃孵育40 min制备成复合探针II。
所述步骤（3）具体工艺为：将灭菌水，10×buffer缓冲液、复合探针I、复合探针II、UDG、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入EP管中，在37 ℃下，孵育2 h。
所述的10×buffer缓冲液为：50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、10 mM (NH4)2SO4、4mM DTT；pH 7.5。
本发明中一共用到了5条DNA链，其序列分别是：
U-DNA: CACACGAATTCATCTG TTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGCTUGACTTGCC
GGACTTTAGTCAAGCTATTTTT-Inverted dT
线性挂锁探针C-DNA(circular DNA):
p-ATTCGTGTGATAGCTTACATGGCAGAGACTGGATAGC
TTACATGGCCAGATGA
连接探针L-DNA(ligation DNA): CACACGAATTCATCTGT
S-DNA(signal DNA): CACACGAATTCATCTG TTTTTTTTTTTTACTCTTCCTAGC
T(Dabcyl)XACAT(FAM)GGC-Inverted dT
其中在U-DNA中以红色突出显示的表示尿嘧啶脱氧核糖核苷的修饰位点，斜体的部分则是与环形模板的互补序列，3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。在C-DNA中的p表示一个5’磷酸基团的修饰，用于在T4 DNA连接酶的作用下，与3’端的羟基形成磷酸二酯键，构成环形模板，而下划线区域表示与L-DNA的结合区域。S-DNA中斜体部分表示能与环状模板的结合序列，分别在两个碱基T上修饰了FAM荧光基团和Dabcyl淬灭基团，X表示四氢呋喃位点（dSpacer）修饰，即无嘌呤无嘧啶位点（AP位点）。3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。
本发明中UDG的检测是在均相溶液中实现的，通过phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV的配合实现双重信号放大，从而实现UDG的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
（二）均相中发生的反应主要有：环形模板及复合物探针的制备；含有碱基U的复合探针对目标物的识别过程；基于phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性的反馈滚环扩增反应。
（1）环形模板及复合探针的制备。线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板备用。在含有碱基U修饰的U-DNA能够与制备好的环状模板通过碱基互补配对结合形成复合探针I；而S-DNA能够与制备好的环状模板结合形成复合探针II。
（2）目标物UDG识别复合探针上的尿嘧啶产生水解作用。当有目标物存在时，UDG能够识别预先修饰有尿嘧啶的复合探针I并对糖苷键进行水解作用，随后产生一个无嘌呤无嘧啶的AP位点。随后，核酸内切酶IV识别AP位点并进行切割使复合探针断裂，在有phi29DNA聚合酶存在时，其3’-5’外切酶活性能够水解不与环状模板碱基互补配对的游离碱基，形成引物-环状模板的滚环扩增反应前体。
（3）基于phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性的反馈滚环扩增反应。上述反应产生的RCA前体能够进行滚环扩增反应，同时复合探针II的3’端能够与大量RCA产物结合，形成双链。当有核酸内切酶IV存在时，能够切断AP位点释放荧光基团和带有猝灭基团的引物-环状模板结构，在phi29 DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性作用下，反馈形成反应第（2）步中相同的引物-环状模板的RCA前体。从而实现多倍数放大循环的反馈滚还扩增。
该发明的检测方式是荧光法检测，利用荧光仪。在检测之前，先将C-DNA和L-DNA形成环形模板探针。然后将目标物加入到含有标记尿嘧啶的复合探针I和复合探针II的均相溶液，在37 ℃孵育2 h，目标物水解尿嘧啶周围的糖苷键，形成无碱基位点。在phi29 DNA聚合酶和核酸内切酶IV 作用下完成多倍数反馈放大过程，从而实现信号的放大。然后用荧光仪设置激发波长为486 nm，检测518 nm处荧光强度，检测范围为450 nm-530 nm。
本发明基于标记尿嘧啶的核酸探针与目标物的特异性识别，具有链延伸功能的phi29 DNA 聚合酶实现链的延伸，产生大量与复合探针II互补延伸链，phi29 DNA 聚合酶的聚合作用及其3’-5’外切酶活性和核酸内切酶IV的配合的滚环扩增放大作用以及荧光基团与猝灭基团的荧光共振能量转移构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补UDG现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1. 特异性识别
标记尿嘧啶的核酸探针与目标物的特异性识别，利用UDG与尿嘧啶的水解作用、phi29DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性实现反馈放大以及核酸内切酶IV的辅助作用实现了对目标物的高特异性检测；
2. 超灵敏性检测
利用了核酸内切酶IV的切割位点（AP位点），实现定位切割，释放荧光基团产生一定强度的荧光信号；利用phi29 DNA聚合酶的聚合作用和3’-5’外切酶活性，在实现滚环扩增放大作用的同时实现反馈再放大以及核酸内切酶放大，实现了荧光信号放大，提高了检测的灵敏度，最低检测限为4.7×10-5 U/mL，实现对目标物UDG的超灵敏性检测；
3. 检测迅速
该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用荧光法，其检测方法操作简便、检测周期短；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
4. 重复性好
制备方法简单，性能稳定，荧光检测的重复性好，适用于与疾病相关的UDG检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该试验的原理图；
图2为实施例2的检测结果图；
图3为实施例3的检测结果图；
图4为实施例4的检测结果图；
图5为实施例5的检测结果图。
图6为实施例6中检测UDG酶的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1 环形模板及复合探针的制备
配制含50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，10 mM DTT和1 mM ATP的T4 DNA连接酶反应缓冲液。配制含10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1mM CaCl2, pH=7.4的PBS缓冲液。
（1）将42 μL灭菌水，6 μL线性模板（10 μM），6 μL连接探针（10 μM）和6 μL 10×的T4 DNA连接酶缓冲液混匀，95℃变性5 min，然后慢慢冷却至室温完成杂交，然后在反应体系里添加3 μL T4 DNA连接酶（60 U/μL），将其在16℃下反应20小时；之后，反应体系在65℃温度条件下水浴15分钟，灭活体系中的T4 DNA连接酶。
（2）向上述反应体系中加入3 μL核酸外切酶Ⅰ（20 U/μL）和3 μL的核酸外切酶Ⅲ（100 U/μL）37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。
（3）将24 μL灭菌水，4 μL环形模板（1 μM），4 μL U-DNA（1 μM），8 μL PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min，使环形模板与U-DNA充分杂交，制备成复合探针I；以相同方法，将4 μL环形模板（1 μM），4 μL S-DNA（1 μM）在37℃孵育40 min制备成复合探针II。
实施例2 荧光强度随复合探针I浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（浓度分别为50 nM、100 nM、500 nM、1 μM 、5 μM）、2 μL dNTP（1mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（1 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mMTris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μLUDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（1 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图2，从图中可以看出，随着复合探针I量的增加，荧光强度不断增强，在复合探针I量达到1 μM之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例3 荧光强度随复合探针II浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（1 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（浓度分别为50 nM、100 nM、500 nM、1 μM、5 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图3，从图中可以看出，随着复合探针II量的增加，荧光强度不断增强，在复合探针II量达到1 μM之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例4 荧光强度随核酸内切酶IV浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（浓度分别为0.05 U/μL、0.1 U/μL、0.5 U/μL、1 U/μL、5 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（1 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图4，从图中可以看出，随着核酸内切酶IV量的增加，荧光强度不断增强，在核酸内切酶IV量达到1 U/μL之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例5 荧光强度随DNA聚合酶浓度的变化
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（浓度分别为0.05 U/μL、0.1 U/μL、0.5 U/μL、1 U/μL、5 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（1 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μL UDG酶液（1 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（1 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果见图5，从图中可以看出，随着phi29 DNA聚合酶量的增加，荧光强度不断增强，在phi29 DNA聚合酶量达到1 U/μL之后，荧光强度基本不变。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例6 对UDG酶的检测
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（1 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μL UDG酶液（浓度从5×10-5 U/mL至 1 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（1 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
根据系列UDG酶液的荧光强度，作标准曲线，如图6所示，计算回归方程为F=986.8+195.6×LgCUDG (U/mL)，相关系数为0.9925，通过计算可得最低检测限为4.7×10-5 U/mL。根据待测液的荧光强度836，计算得其中UDG酶的浓度为0.169 U/mL。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
实施例7 实验重复性研究
一种本发明所述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将2 μL复合探针I（1 μM）、2 μL dNTP（1 mM）、2 μL phi29 DNA聚合酶（1 U/μL）、2 μL核酸内切酶IV（1 U/μL）在2 μL缓冲液（50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 4 mM DTT, pH 7.5）中混合后分别加入2 μL UDG酶液（浓度分别为1 U/mL, 0.1 U/mL, 0.01 U/mL, 0.001 U/mL, 0.0001 U/mL），混匀后37℃恒温反应60 min；
（2）向步骤（1）的溶液中加入2 μL复合探针II（1 μM），混匀后37℃恒温反应60 min；
（3）将上述反应体系分别重复5次。
（4）将步骤（2）所得溶液加水稀释至100 μL，将然后进行荧光检测；激发波长设置为486 nm，发射波长为518 nm，检测范围450 nm-530 nm，读取荧光信号变化。
检测结果如表1所示，从表中可以看出，针对同一浓度进行3次相同实验所取得的荧光信号强度值基本一致，具有良好的重复性。
表1 对该荧光生物传感器重复性研究
上述过程中用到的溶液的制备方法：
超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将超纯水分别放置在锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。10×缓冲液（buffer）是随聚合酶一起购置，可直接使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
cacacgaatt catctgtttt ttttttttac tcttcctagc tgacttgccg gactttagtc 60
aagctatttt t 71
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
attcgtgtga tagcttacat ggcagagact ggatagctta catggccaga tga 53
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
cacacgaatt catctgt 17
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
cacacgaatt catctgtttt ttttttttac tcttcctagc tacatggc 48
Claims (7)
1.一种检测DNA糖基化酶UDG的荧光生物传感器，其特征在于，包括目标物UDG、复合探针I、复合探针II、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP、10×buffer缓冲液；
所述的复合探针I由U-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；
所述的复合探针II由S-DNA与环状模板通过碱基互补配对结合形成；
所述的环状模板由线性挂锁探针C-DNA与连接探针L-DNA结合，在T4 DNA连接酶的作用下，形成环形模板-连接引物的复合体，当有核酸外切酶I和外切酶III存在时，对引物进行消化，从而形成环形模板；
所述的碱基序列如下：
U-DNA序列如SEQ No.1所示；
线性挂锁探针C-DNA序列如SEQ No.2所示；
连接探针L-DNA序列如SEQ No.3所示；
S-DNA序列如SEQ No.4所示；
所述的U-DNA的5’端第41和42位碱基之间有个修饰位点U，代表尿嘧啶碱基；U-DNA的3’端修饰Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用；
所述的C-DNA中的5’端修饰磷酸基团；
所述的S-DNA的5’端第41和42位碱基之间修饰了Dabcyl淬灭基团，然后还有个四氢呋喃修饰位点，即无嘌呤无嘧啶位点；第45和46位碱基之间有修饰了FAM荧光基团；3’端修饰的Inverted dT即反向dT用于抑制核酸外切酶的降解作用。
2.权利要求1所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）环形模板构建；
（2）复合探针I、复合探针II的制备；
（3）均相反应；
（4）荧光检测：荧光仪设置激发波长为486 nm，检测518 nm处荧光强度，检测范围为450nm-530 nm。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）具体工艺为：
S1 将 C-DNA和L-DNA 6 加入到EP管中，在95 ℃下孵育5 min，缓慢冷却至室温；随后放入到16 ℃水浴中，过夜反应；
S2 然后在反应体系里添加T4 DNA连接酶，将其在16℃下反应20 h；
S3灭活体系中的T4 DNA连接酶；
S4 向上述反应体系中加入核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ，37℃下反应2 h；再将反应体系85℃水浴加热10 min，得环形模板，4℃条件下保藏备用。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中复合探针I的制备工艺为：将灭菌水、环形模板、U-DNA、PBS缓冲液加入到EP管中，在37℃孵育40 min，使环形模板与U-DNA充分杂交，制备成复合探针I。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中复合探针II的制备工艺为：将环形模板、PBS缓冲液、灭菌水、S-DNA在37℃孵育40 min制备成复合探针II。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体工艺为：将灭菌水，10×buffer缓冲液、复合探针I、复合探针II、UDG、phi29 DNA 聚合酶、核酸内切酶IV、dNTP加入EP管中，在37 ℃下，孵育2 h。
7.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，所述的10×buffer缓冲液为：50mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、10 mM (NH4)2SO4、4 mM DTT；pH 7.5。
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093344A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-08-06 | 山东大学 | 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用 |
| CN110305939A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-10-08 | 济南大学 | 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN111154839A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-15 | 山东师范大学 | 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用 |
| CN111440851A (zh) * | 2020-04-09 | 2020-07-24 | 济南大学 | 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN112342274A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-09 | 济南大学 | 一种基于dna纳米机器检测udg的生物传感器 |
| CN113462755A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-10-01 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种用于短链非编码rna检测的模块化酶电路检测*** |
| CN113584131A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-02 | 济南大学 | 一种基于Au@Ag检测UDG的比色生物传感器 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101743326A (zh) * | 2007-05-14 | 2010-06-16 | 因赛特遗传学公司 | 筛选核酸中的单核苷酸变异的方法 |
| US20110201056A1 (en) * | 2004-10-21 | 2011-08-18 | New England Biolabs, Inc. | Repair of Nucleic Acids for Improved Amplification |
| CN103255227A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-21 | 上海快灵生物科技有限公司 | 引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒 |
| CN107164541A (zh) * | 2017-07-12 | 2017-09-15 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | Audg介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术 |
| CN107922969A (zh) * | 2015-06-22 | 2018-04-17 | 麦克马斯特大学 | 包含核酸组装体的结构切换、核酸消化和扩增的串联反应的生物传感器 |
| CN108088826A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-29 | 济南大学 | 一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶（udg）的荧光生物传感器 |
| CN108398406A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-08-14 | 济南大学 | 一种检测尿嘧啶糖基化酶（udg）的生物传感器及其应用 |
-
2018
- 2018-12-28 CN CN201811621278.5A patent/CN109444105B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110201056A1 (en) * | 2004-10-21 | 2011-08-18 | New England Biolabs, Inc. | Repair of Nucleic Acids for Improved Amplification |
| CN101743326A (zh) * | 2007-05-14 | 2010-06-16 | 因赛特遗传学公司 | 筛选核酸中的单核苷酸变异的方法 |
| CN103255227A (zh) * | 2013-05-30 | 2013-08-21 | 上海快灵生物科技有限公司 | 引物介导环化的恒温核酸滚环扩增方法及试剂盒 |
| CN107922969A (zh) * | 2015-06-22 | 2018-04-17 | 麦克马斯特大学 | 包含核酸组装体的结构切换、核酸消化和扩增的串联反应的生物传感器 |
| CN107164541A (zh) * | 2017-07-12 | 2017-09-15 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | Audg介导的多交叉置换扩增结合生物传感的核酸检测技术 |
| CN108088826A (zh) * | 2017-12-14 | 2018-05-29 | 济南大学 | 一种检测尿嘧啶-dna糖基化酶（udg）的荧光生物传感器 |
| CN108398406A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-08-14 | 济南大学 | 一种检测尿嘧啶糖基化酶（udg）的生物传感器及其应用 |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110093344A (zh) * | 2019-05-13 | 2019-08-06 | 山东大学 | 一种内源性酶触发的dna步行器及其检测udg的应用 |
| CN110305939B (zh) * | 2019-07-08 | 2022-09-30 | 济南大学 | 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN110305939A (zh) * | 2019-07-08 | 2019-10-08 | 济南大学 | 一种检测miRNA的荧光生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN111154839A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-15 | 山东师范大学 | 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用 |
| CN111154839B (zh) * | 2020-01-20 | 2023-05-02 | 山东师范大学 | 一种同时检测多种dna糖基化酶的荧光化学传感器、其检测方法及应用 |
| CN111440851B (zh) * | 2020-04-09 | 2023-02-28 | 济南大学 | 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN111440851A (zh) * | 2020-04-09 | 2020-07-24 | 济南大学 | 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 |
| CN112342274B (zh) * | 2020-11-06 | 2022-09-23 | 济南大学 | 一种基于dna纳米机器检测udg的生物传感器 |
| CN112342274A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-02-09 | 济南大学 | 一种基于dna纳米机器检测udg的生物传感器 |
| CN113462755A (zh) * | 2021-05-06 | 2021-10-01 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种用于短链非编码rna检测的模块化酶电路检测*** |
| CN113462755B (zh) * | 2021-05-06 | 2023-03-21 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 一种用于短链非编码rna检测的模块化酶电路检测*** |
| CN113584131A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-11-02 | 济南大学 | 一种基于Au@Ag检测UDG的比色生物传感器 |
| CN113584131B (zh) * | 2021-07-20 | 2023-07-28 | 济南大学 | 一种基于Au@Ag检测UDG的比色生物传感器 |
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