CN109444103A - 一种pei功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法 - Google Patents

一种pei功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法，采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)为前驱体利用水热法一步制备出PEI功能化的绿色荧光碳点，方法简单易行、原料廉价易得、成本低、产出高，适合批量生产，制备的碳点发射波长长；本发明为高阳离子密度的PEI功能化碳点，不仅可以提高了碳点的发光效率和分散性，同时还能使碳点表面带有丰富的正电荷、量子产率高；基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，碳点和适配体均未修饰，采用了免标记的方法，很大程度的简化了合成步骤，同时降低了；具有操作成本低、制备工艺简单，反应条件温和易于推广的特点。

Description

一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血 酶检测方法
技术领域
本发明属于荧光碳纳米材料、生物传感技术领域，涉及一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法。
背景技术
碳点是一种新型的零维碳纳米材料。除了具有优良的荧光性能，碳点还具有毒性低、生物相容性好、制备步骤简单温和、易于表面修饰以及原料丰富廉价等优点。因此，碳点可作为半导体量子点和有机染料的替代物而被应用于生物医学领域。
目前碳点的合成方法主要有激光烧蚀法、电化学法、热解法、酸氧化法、微波法、超声法和水热法。采用不同的制备方法得到的碳点性能亦有所不同。然而，这些方法所制备的碳点绝大部分限于短波长发光，大多发出蓝色荧光，而生物体的细胞或组织具有较强的自体蓝色荧光，将这些碳点用于细胞成像或生物组份测定时不利于靶信号与背景信号的区分，背景干扰大。
虽然近两年来已有关于长波长荧光碳点的报道，但是这些前瞻性的工作仍然存在着许多亟待解决的问题，主要表现在碳点的荧光在长波长区域(大于500nm)发射效率低以及水溶性差的缺陷，从而限制了碳点在生物医学等领域的进一步发展应用。因此，制备长波长高荧光量子产率的碳点是目前人们一直追求的目标。
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血液凝固、血管生成、肿瘤生长和转移的诊断等分子生物学中发挥着重要作用。此外，凝血过度还会导致体内血栓栓塞等疾病的发生，甚至会造成机体死亡。因此，建立简单、快速检测凝血酶含量的方法对临床疾病的早期诊断、病程发展、预后以及疗效的监测和评估等都具有非常重要的意义。
核酸适配体是一类寡核苷酸序列，通过其特定的三维结构可以与靶标高特异性、高亲和力地结合，且目标分子范围广，不仅能特异性识别小分子、蛋白质，甚至还可以与整个细胞结合。这表明核酸适配体作为识别元件可明显地拓宽相关传感器的应用范围。近年来，基于适配体的荧光生物传感器已成为代替传统检测方法的潜在选择。一系列用于凝血酶检测的荧光适配体传感器已有报道。但这些方法往往需要对适配体进行化学修饰或利用一些先进的纳米材料、荧光素等作为荧光基团来标记核酸适配体，这样的修饰和标记工作不仅耗时、复杂、增加了成本而且降低了核酸适配体对目标物的亲和力。因此，发展非标记型荧光适配体传感器用于凝血酶检测尤为重要。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种制备强烈绿色荧光的PEI功能化绿色荧光碳点制备方法及基于该碳点的凝血酶检测方法，制备的碳点长波长、量子产率高，并提供了一种以正电荷碳点作为荧光探针，适配体作为识别探针高选择性的凝血酶检测新方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，包括以下步骤：
(1)、按质量比1:5～4:1将苹果酸和PEI溶于超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在120～220℃条件下水热反应3～12h，得到棕黄色溶液；
(2)、将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经真空干燥，得到固体粉末；
(3)、向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后并离心，除去上清液、沉淀冷冻干燥得到纯化的碳点。
进一步，所述步骤(3)中离心转速为13000rpm-16000rpm，离心时间为10-30min。
进一步，所述步骤(2)中抽滤滤膜孔径为0.22μm。
进一步，所述步骤(2)中真空干燥温度为50℃。
一种基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，包括以下步骤：
(1)、荧光淬灭：将凝血酶适配体加入到碳点分散液中，即制备成检测凝血酶的P-CDs-适配体传感器；适配体能淬灭正电荷碳点(P-CDs)荧光；
(2)、凝血酶的检测：加入凝血酶，适配体结合凝血酶后，正电荷碳点(P-CDs)的荧光得以恢复，根据荧光恢复强度的变化，实现对凝血酶的检测。
进一步，所述步骤(2)中，通过在EP管中依次加入正电荷碳点(P-CDs)、凝血酶适配体、NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲溶液，反应30min后，再加入凝血酶溶液，孵育一段时间，孵育后的溶液进行荧光强度测定。
进一步，正电荷碳点(P-CDs)与凝血酶适配体在磷酸盐缓冲液混合，磷酸盐缓冲液中磷酸盐溶液浓度为10mM、NaCl浓度为100mM；Mg2+浓度为4mM、凝血酶浓度为1～200nM。
进一步，所述孵育时间为40min。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)为前驱体利用水热法一步制备出PEI功能化的绿色荧光碳点。
1、合成方法简单：本发明的绿色荧光碳点制备方法通过两个分子简单的一步水热合成即可得到绿色荧光碳点，方法简单易行、原料廉价易得、成本低、产出高，适合批量生产，制备的碳点发射波长长，最大发射波长位于502nm，见图3。而目前文献报道的大多数方法制备的碳点在紫外光激发下发射出蓝色荧光，主要发射峰在410-440nm。
2.水溶性好、荧光量子产率高：采用苹果酸和聚乙烯亚胺(PEI)制备得到高阳离子密度的PEI功能化碳点，不仅可以提高了碳点的发光效率和分散性，同时还能使碳点表面带有丰富的正电荷、量子产率高。
同时提供了一种基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，基于绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，正电荷碳点(P-CDs)溶液有良好的荧光发射性质，将凝血酶适配体加入到P-CDs溶液中时，带负电荷的适配体因与正电荷碳点之间的静电作用而吸附到P-CDs表面而使碳点荧光淬灭，在适配体/P-CDs复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配结合从而使其远离P-CDs表面，导致P-CDs的荧光恢复，随着凝血酶浓度的增加，P-CDs的荧光恢复的程度逐渐增强，P-CDs的荧光强度与凝血酶浓度呈线性关系，可用于对凝血酶的灵敏和选择性检测。
1.本方法无需标记，降低了检测成本：在本发明中碳点和适配体均未修饰，采用了免标记的方法，很大程度的简化了合成步骤，同时降低了；具有操作成本低、制备工艺简单，反应条件温和易于推广的特点。
2.灵敏度、选择性高：本发明采用了“off-on的”荧光检测模式，利用了凝血酶与适配体之间强的特异性结合，这种体系可以显著提高检测的灵敏度和选择性。
3.准确性高：检测时碳点和适配体均无需任何修饰，运用在定量检测凝血酶中很大程度的减小了外界干扰。
4.实用性强：本发明检测方法是一种共性检测，只需改变核酸适配体的序列，就可以实现对其它底物分子的检测。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的绿色P-CDs的透射电子显微镜照片
图2为本发明实施例1制备的绿色P-CDs的粒径统计分布图
图3为本发明实施例1制备的绿色P-CDs的紫外-可见吸收光谱图和荧光发射光谱图
图4为本发明实施例1制备的绿色P-CDs在不同激发波长下(310-450nm)的荧光发射光谱图
图5为本发明实施例1制备的绿色P-CDs的红外光谱图
图6为适配体/P-CDs复合物与不同浓度凝血酶的荧光光谱图
图7为对凝血酶检测的选择性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1PEI功能化绿色荧光碳点制备方法：
(1)将0.5g PEI与0.5g苹果酸溶于13mL超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在180℃条件下水热反应10h得到棕黄色溶液；
(2)将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过孔径为0.22μm的滤膜抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经50℃真空干燥，得到固体粉末；
(3)向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后用离心机以16000r/min转速离心15min，除去上清液，沉淀冷冻干燥后再重新分散在超纯水中，所得的即为P-CDs分散液。
图1为实施例1所得P-CDs的透射电子显微镜图，由图可以看出P-CDs为球形或类球形，并具有良好的分散性，没有团聚。
图2为实施例1所得P-CDs的粒径分布统计图，可以看出所得P-CDs的粒径分布在1.2-5.1nm之间，平均粒径为2.6nm。
图3为本发明实施例1制备的绿色P-CDs的紫外-可见吸收光谱图和荧光发射光谱图，可见实例1所得P-CDs的紫外-可见吸收光谱，P-CDs在331nm有一个明显的吸收峰。在430nm激发波长下P-CDs发射出502nm的绿色荧光，采用硫酸奎宁为参比溶液，测得P-CDs的荧光量子产率为40.9％。内嵌图为P-CDs分散液分别在可见光和365nm紫外光下的照片，在可见光下P-CDs分散液为澄清透明的黄色，在紫外灯照射下发出明亮的绿色荧光。
图4为绿色P-CDs在不同激发波长下的荧光发射光谱图。可以看出，激发波长间距为20nm，在激发光为310-450nm范围内，发射波长随激发光的红移而红移，并伴随着荧光强度先增加后降低，这种现象可能和P-CDs的能量陷阱发射和电子共轭结构相关。
图5为实例1所得P-CDs、苹果酸以及PEI的红外光谱图，可以看出，在P-CDs光谱中，与PEI有关且位于1453cm-1处的CH2面内弯曲振动及位于770cm-1处的N-H面外振动消失；相应于苹果酸羧基特征1692cm-1峰也消失；而在3200-3640cm-1处出现了由于氢键作用导致比一般酰胺(C＝O)特征波数增加的峰，同时在1587cm-1处出现肿胺NH弯曲振动、1634cm-1处出现伯胺N-H弯曲振动、1358cm-1出现仲胺C-N伸缩振动峰、1171cm-1处出现伯胺C-N伸缩振动峰。上述p-CDs红外光谱结果表明，在P-CDs产物中存在由苹果酸与PEI缩合产物。
实施例2P-CDs的制备：
制备步骤同实施例1，仅改变苹果酸与PEI的比例制备6种不同荧光量子产率的P-CDs，见表1：
实施例3P-CDs的制备：
制备步骤同实施例1，仅改变水热反应时间和温度在120℃条件下反应12h，制备不同荧光量强度的P-CDs。
实施例4P-CDs的制备：
制备步骤同实施例1，仅改变水热反应时间和温度在220℃条件下反应3h，制备不同荧光量强度的P-CDs。
实施例5用绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，具体如下：
向离心管中依次加入实施例1制备的P-CDs分散液100μL，300μL磷酸盐缓冲溶液(浓度10mM，pH7.4，含100mM NaCl，4mM MgCl2)混合均匀后，再向其中加入88μL 10μM适配体溶液作为荧光淬灭剂，加入超纯水定容至600μL，震荡摇匀，静置30min。待P-CDs荧光淬灭达到平衡后，加入一系列不同浓度的凝血酶(最终浓度为0，5nM，10nM，20nM，50nM，100nM，150nM，200nM，260nM)作为荧光恢复剂，震荡摇匀，在37℃下孵育40min后，设置激发波长为430nm进行荧光测定。
由图6可见，图中凝血酶浓度为0,5,10,20,50,100,150,200,260nM时P-CDs的荧光强度，随着凝血酶浓度的增大，P-CDs的荧光强度逐渐增强，(内插图为凝血酶浓度与荧光强度之间的线性关系图)。且凝血酶浓度在5-200nM范围内与体系荧光增强程度(ΔF)呈良好的线性关系。线性回归方程为ΔF＝119.2+8.6C(nM)，线性相关系数为R2＝0.9963，对凝血酶的检测线为1.2nM，可实现凝血酶的灵敏检测。
实施例6稳定性和重复性
取3批平行制备的P-CDs，分别测定，其相对标准偏差为3.78％。取同一批P-CDs重复测定20次，其荧光强度基本不变，此外将所制备的P-CDs在室温条件下保存3个月，其荧光也强度基本不发生改变。上述结果表明基于P-CDs的荧光检测体系较为稳定，测定重复性好，能够保证检测结果的准确性和检测方法的实用性。
实施例7P-CDs/适配体复合物纳米探针对凝血酶检测的选择性。
由图7可见，只有凝血酶才能使P-CDs荧光显著恢复，而其他蛋白质如牛血清蛋白(BSA)、血红蛋白(Hb)和溶菌酶(Lys)均不能使P-CDs荧光恢复。以上结果表明，本发明方法对凝血酶检测有良好的选择性。
上述实验所用的适配体序列为：
Thrombin aptamer：5′-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3′。
最后应该说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种PEI功能化绿色荧光碳点制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、按质量比1:5～4:1将苹果酸和PEI溶于超纯水中，搅拌均匀后置于反应釜中，在120～220℃条件下水热反应3～12h，得到棕黄色溶液；
(2)、将步骤(1)得到的棕黄色溶液经过抽滤，除去大颗粒杂质，滤液经真空干燥，得到固体粉末；
(3)、向步骤(2)得到的固体粉末中加入无水乙醇，超声后并离心，除去上清液、沉淀冷冻干燥得到纯化的碳点。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中离心转速为13000rpm-16000rpm，离心时间为10-30min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中抽滤滤膜孔径为0.22μm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中真空干燥温度为50℃。
5.一种基于权利要求1制备的绿色荧光碳点的凝血酶检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、荧光淬灭：将凝血酶适配体加入到碳点分散液中，即制备成检测凝血酶的P-CDs-适配体传感器；适配体能淬灭正电荷碳点(P-CDs)荧光；
(2)、凝血酶的检测：加入凝血酶，适配体结合凝血酶后，正电荷碳点(P-CDs)的荧光得以恢复，根据荧光恢复强度的变化，实现对凝血酶的检测。
6.根据权利要求5所述的凝血酶检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，通过在EP管中依次加入正电荷碳点(P-CDs)、凝血酶适配体、NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲溶液，反应30min后，再加入凝血酶溶液，孵育一段时间，孵育后的溶液进行荧光强度测定。
7.根据权利要求6所述的凝血酶检测方法，其特征在于：正电荷碳点(P-CDs)与凝血酶适配体在磷酸盐缓冲液混合，磷酸盐缓冲液中磷酸盐溶液浓度为10mM、NaCl浓度为100mM；Mg2+浓度为4mM、凝血酶浓度为1～200nM。
8.根据权利要求6所述的凝血酶检测方法，其特征在于：所述孵育时间为40min。
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LU ZHANG: "Aptamer-Based Turn-On Detection of Thrombin in Biological Fluids Based on Efficient Phosphorescence Energy Transfer from Mn-Doped ZnS Quantum Dots to Carbon Nanodots", 《CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL》 *

Cited By (2)

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CN110564412A (zh) * 2019-08-12 2019-12-13 南京医科大学 橙色荧光发射PEI-CDs的制备方法
CN110564412B (zh) * 2019-08-12 2022-09-06 南京医科大学 橙色荧光发射PEI-CDs的制备方法

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