CN109438556A - 活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用。该活性肽含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的短肽。该活性肽具有抗炎功效且安全性较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物 及其制备方法和应用。
背景技术
炎症，就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，，表现为红、肿、 热、痛和功能障碍。体表的外伤感染和各器官的大部分常见病和多发病(如疖、痈、肺炎、肝 炎、肾炎等)都属于炎症性疾病。炎症是由物理或有害化学刺激或微生物毒素引起的，并已 被公认为在动脉粥样硬化的发展中起着致命的作用。慢性感染可能导致慢性全身炎症反应。 通常情况下，炎症是人体的自动的防御反应。但有时候，炎症是有害的，例如对人体自身组 织的攻击或者发生在透明组织的炎症等。因此，有效的抗炎物质进行抗炎对于维护机体健康 具有极其重要的作用。目前，在医学上有多种抗炎药物，但这些药物大多具有不同程度的副 作用，不宜长期服用。
发明内容
基于此，有必要提供一种具有抗炎功效且安全性较高的活性肽。
此外，还提供一种重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用。
一种活性肽，所述活性肽含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的短肽。
上述活性肽含有His-Tyr-Gly-His，使得该活性肽能够抑制血清脂肪酶引起的炎症细胞因 子过量表达和分泌，以发挥抗炎功效，且该活性肽无毒副作用，安全性较高。经试验验证， 该活性肽能够抑制血清脂肪酶引起的巨噬细胞凋亡，改善血清脂肪酶引起的细胞周期的阻滞， 抑制血清脂肪酶引起的炎症细胞因子的大量分泌或表达，以抑制炎症产生，影响细胞炎症通 路相关的蛋白表达。
一种重组载体，所述重组载体含有上述所述短肽的编码序列。
在其中一个实施例中，所述编码序列如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
所述编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有80％同源性的核苷酸序列；或
所述编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加 得到的核苷酸序列。
一种重组细胞，所述重组细胞含有编码上述所述的活性肽的核苷酸；或者，
所述重组细胞含有上述所述的重组载体。
一种抗炎组合物，包括活性组分，所述活性组分包括上述所述的活性肽。
在其中一个实施例中，还包括辅助组分，所述辅助组分包括维生素C、维生素E、辅酶Q、 谷胱甘肽、胡萝卜素及甜菜碱中的至少一种。
上述所述的活性肽、上述所述的重组载体、上述所述的重组细胞或上述所述的抗炎组合 物在制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物中的应用。
上述所述的活性肽在制备食品或保健品中的应用。
上述所述的活性肽的制备方法，包括如下步骤：从石金钱龟中分离得到所述活性肽；或
通过化学合成方法合成所述活性肽。
在其中一个实施例中，所述从石金钱龟中分离得到所述活性肽包括如下步骤：
将石金钱龟肉酶解，得到酶解物；及
采用有机溶剂对所述酶解物进行萃取，得到所述活性肽。
附图说明
图1为实施例1的活性肽的质谱图；
图2为实施例1的活性肽的高效液相色谱图；
图3为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞存活率的对比图；
图4为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的凋亡的FACS 分析的散点图；
图5为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的凋亡的柱状 统计图；
图6为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的细胞周期影 响的FACS分析对比图；
图7为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的细胞周期影 响的影响的柱状统计图；
图8为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内NO的相对 表达量的对比图；
图9为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内TNF-α含 量的对比图；
图10为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内IL-6含量 的对比图；
图11为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内IL-1β含 量的对比图；
图12为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞中iNOS蛋 白相对表达量的电泳对比图；
图13为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞中iNOS蛋 白相对表达量的柱状对比图；
图14为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞中IkB-α、p65、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38蛋白相对表达量的电泳对比图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了 本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述 的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人 员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施 例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的活性肽含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的短肽。
具体地，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列为His-Tyr-Gly-His。其中，His表示组氨酸，缩 写为H。Try表示络氨酸，缩写T。Gly表示甘氨酸，缩写为G。
由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱 基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、***、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基 酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基 本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功 能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。
功能等同的变异体同样适用于通过缺失、***和突变等人工手段改变一个或多个密码子， 从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的短肽。尽管这样能获得更多不同形 式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变 异蛋白质的活性。
一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码 序列中一个或多个碱基的缺失、***或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸 缺失、***或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性。因此，由上 述氨基酸序列组成的短肽，如果其构成的活性肽没有明显的功能差异，也包括在本发明的范 围内。
在具体实施例中，短肽具有如下结构式：
在其中一个实施例中，活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。该活性肽的肽链较短， 易于吸收和利用。
上述活性肽含有His-Tyr-Gly-His，使得该活性肽能够抑制血清脂肪酶引起的炎症细胞因 子过量表达和分泌，以发挥抗炎功效，且该活性肽无毒副作用，安全性较高。经试验验证， 该活性肽能够抑制血清脂肪酶引起的巨噬细胞凋亡，改善血清脂肪酶引起的细胞周期的阻滞， 抑制血清脂肪酶引起的炎症细胞因子的大量分泌或表达，以抑制炎症产生，影响细胞炎症通 路相关的蛋白表达。上述活性肽能够用于制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物中， 还能够应用于食品或保健品中。
其中，血清脂肪酶(Lipase，LPS)是一组特异性较低的脂肪水解酶类，主要来源于胰腺， 其次为胃及小肠，能水解多种含长链脂肪酸的甘油酯。通常胰腺以等量分泌脂肪酶及共脂肪 酶进入循环，但因共脂肪酶相对分子量较小，可以从肾小球滤出，当共脂肪酶/脂肪酶比例变 化时，会引起急慢性胰腺炎、胰液淤滞(胰腺癌、胰腺囊肿、胆管癌、胆石症、***癌等)、 肾功能不全、胰腺损伤、穿孔性腹膜炎、胰腺导管阻塞等症状。
炎症细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子。起主要作用的炎症细胞因子为NO、 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等。
NO为一氧化氮。NO在酸性条件下，能够对局部产生机体防御功能，但过量则可能会导 致气道黏膜水肿、充血及炎症反应等。
TNF-α(肿瘤坏死因子，tumor necrosis factor)是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎 性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活 性并促使其他细胞因子的合成和释放。
IL-1(白细胞介素1，interleukin 1)中的一类，能刺激集落刺激因子、血小板生长因子等 细胞因子的产生和使T细胞产生白细胞介素-2，在免疫应答和组织修复中起作用。IL-1的大 量分泌能够诱导肝脏急性期蛋白合成，引起发热和恶病质，其中，白细胞介素1存在IL-1α 和IL-1β两种形式。
IL-6(白细胞介素6，interleukin 6)能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化 增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。
IL-8(白细胞介素8，interleukin 8)能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋 化，促进中性粒细胞脱颗粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，使微循环血流淤滞，组织坏 死，造成器官功能损伤。
一实施方式的食品包括上述活性肽。上述活性肽作为食用添加剂，以使食品具有一定的 抗炎性，以具有一定的保健功能，同时，上述活性肽能够给机体补充所需的蛋白和氨基酸。
在其中一个实施例中，食品为片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
在其中一个实施例中，食品中活性肽的质量百分含量为10％～20％。
一实施方式的保健品包括上述活性肽。上述活性肽作为活性成分，以使保健品具有较优 的抗炎功效，同时，上述活性肽能够给机体补充所需的蛋白和氨基酸。
在其中一个实施例中，保健品为片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂。
在其中一个实施例中，保健品中活性肽的质量百分含量为3％～10％。
在其中一个实施例中，保健品还包括保健品学上可接受的辅料基质。保健品学上可接受 的辅料基质选自单糖、寡糖、多糖、氨基酸、防腐剂、pH调节剂和抗氧化助剂中的至少一种。 进一步地，活性肽与保健品学上可接受的辅料基质的质量比为3％～20％。
一实施方式的重组载体含有短肽的编码序列。
在其中一个实施例中，短肽的编码序列为如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。具体地， SEQ ID No.2所示的核苷酸序列为5’-CACUACGGACAU-3’。
在其中一个实施例中，短肽的编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有80％同源 性的核苷酸序列。
在其中一个实施例中，短肽的编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个 碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
进一步地，短肽的编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被其兼 并碱基替代得到的核苷酸序列。
需要说明的是，由上述核苷酸序列编码的短肽，如果其构成的活性肽没有明显的功能差 异，也包括在本研究的范围内。
在其中一个实施例中，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
在其中一个实施例中，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于活性肽的分 离纯化。进一步地，纯化标签为His标签、GST标签或SUMO标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。
在其中一个实施例中，重组载体包括基因工程载体。编码上述活性肽的核苷酸***基因 工程载体中。进一步地，基因工程载体为pET-32a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或 pPIC-Zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基 因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。
上述重组载体能够较好地保存编码上述活性肽的核苷酸，有利于活性肽的表达，能够应 用于制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物。
一实施方式的重组细胞含有编码上述活性肽的核苷酸或上述重组载体。
在其中一个实施例中，重组细胞为克隆编码上述活性肽的核苷酸的细胞。
在其中一个实施例中，重组细胞为表达编码上述活性肽的核苷酸的细胞。
在其中一个实施例中，重组细胞包括受体细胞。编码上述活性肽的核苷酸或上述重组载 ***于受体细胞内。
在其中一个实施例中，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细 胞。进一步地，受体细胞为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤 酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。
需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重 组细胞的受体细胞。
上述重组细胞能够克隆或表达上述活性肽，使得能够大规模的制备该活性肽，并且通过 重组细胞定向表达该活性肽，以能够获得纯度较高的活性肽，进而有利于活性肽的应用，因 此，上述重组细胞能够用于制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物。
一实施方式的抗炎组合物，包括活性组分，活性组分包括上述活性肽。
在其中一个实施例中，抗炎组合物还包括辅助载体。辅助载体用于负载活性组分。
在其中一个实施例中，辅助载体包括溶剂、聚合物及脂质体中的至少一种。
溶剂用于溶解或悬浮活性组分。溶剂包括无菌水、生理盐水及常用非水性溶剂中的一种。 其中，常用非水性溶剂例如可以是乙醇。
聚合物用于活性短肽改性。聚合物包括聚赖氨酸、聚赖氨酸改性物、聚乙烯亚胺、聚乙 烯亚胺改性物、壳聚糖、聚乳酸及明胶中的至少一种。其中，聚赖氨酸的改性物例如可以是 聚赖氨酸的水溶性改性物。聚乙烯亚胺的改性物例如可以是聚乙烯亚胺的水溶性改性物。
脂质体用于包裹活性短肽，以得到含有短肽的脂溶性物质，以应用于脂溶性的环境中。 脂质体包括胆固醇及卵磷脂中的至少一种。其中，卵磷脂选自豆卵磷脂及蛋黄卵磷脂中的至 少一种。具体地，豆卵磷脂例如可以为大豆卵磷脂。
在其中一个实施例中，辅助载体还包括稀释剂及赋形剂中的至少一种。
稀释剂用于稀释活性组分。稀释剂包括淀粉、糖、纤维素及无机盐中的至少一种。具体 地，淀粉例如可以为支链淀粉。糖例如可以为甘蔗多糖。纤维素例如可以为甘蔗纤维素。无 机盐例如可以为氯化钠盐。
赋形剂用于使抗炎组合物呈现特定的形态。具体地，赋形剂使抗炎组合物呈片剂、半固 体制剂、液体制剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、混悬剂或气雾剂等形态。需要说明的是，抗炎组合物不限于为上述指出形态，还可以为其他形态，例如可以是膏剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括黏合剂、填充剂及润滑剂中的至少一种。通过包括该 赋形剂，以使抗炎组合物呈片剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括软膏剂的基质部分或霜剂的基质部分。通过包括该赋 形剂，以使抗炎组合物呈半固体制剂。
在其中一个实施例中，赋形剂包括防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂 及着色剂中的至少一种。通过包括该赋形剂，以使抗炎组合物呈液体制剂。
在其中一个实施例中，抗炎组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为5：70～95：3。 可选地，抗炎组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为10：20～90：5。进一步地，抗炎组 合物中，活性组分与辅助载体的质量比为15：45～85：10。更进一步地，抗炎组合物中，活性组分与辅助载体的质量比为30：50～80：15。
在其中一个实施例中，抗炎组合物还包括辅助组分。辅助组分包括维生素C、维生素E、 辅酶Q、谷胱甘肽、胡萝卜素及甜菜碱中的至少一种。通过添加辅助组分，以增强抗炎组合 物的抗炎作用。需要说明的是，辅助组分不限于上述指出的组分，还可以包括具有其他辅助 功效的物质，例如可以是具有抗氧化活性的物质。具体地，具有抗氧化活性的物质例如可以 是虾青素或番茄红素等。
在其中一个实施例中，辅助组分与活性组分的质量比为85:15～95:5。
上述抗炎组合物含有活性肽，能够用于制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物。
一实施方式的活性肽可以从石金钱龟中分离得到，也可以通过化学合成方法合成。
一实施方式的从石金钱龟中分离得到活性肽包括如下操作S110～S120：
S110、将石金钱龟肉酶解，得到酶解物。
具体地，S110包括如下操作S111～S112：
S111、向石金钱龟肉糜加入水混合，得到肉糜水。
在其中一个实施例中，石金钱龟肉糜为石金钱龟肉粉碎后得到。
在其中一个实施例中，水为去离子水或超纯水。
在其中一个实施例中，石金钱龟肉糜的质量与水的体积之比为1～50。进一步地，石金钱 龟肉糜的质量与水的体积之比为1～10。
S112、向肉糜水中加入酶进行酶解，得到酶解物。
在其中一个实施例中，酶为碱性蛋白酶。进一步地，酶为郑州市伟丰生物科技有限公司 的2017-JD-0812的碱性蛋白酶。更进一步地，酶的终浓度为400U/mL～800U/mL。肉糜水与 酶的混合物的pH为7.45～10。酶解温度为35℃～50℃。酶解时间为2h～5h。
在其中一个实施例中，在向肉糜水中加入酶进行酶解之后，还包括如下操作：对酶解后 的肉糜水进行灭酶处理；灭酶结束后，离心收集上清；将上清进行干燥，得到酶解物。
具体地，对酶解后的肉糜水进行灭酶处理的操作具体为：将酶解后的肉糜水放入85℃ ～95℃下灭酶10min～30min。
离心收集上清的操作中，离心转速为8000r/min～10000r/min。离心时间为10min～20min。
将上清进行干燥的方式为冷冻干燥。将酶解物干燥至含水量为0.1％～0.25％。其中，含水 量即为酶解物中水的质量百分含量。需要说明的是，干燥的方式不限于冷冻干燥，还可以为 其他干燥方式，例如风干。
S120、采用有机溶剂对酶解物进行萃取，得到活性肽。
具体地，将酶解物与有机溶剂混合，萃取，得到水相层；将水相层进行纯化，得到活性 肽。其中，水相层即为含有活性肽的溶液。需要说明的是，若水相层中活性肽的纯度能够满 足实际需求的话，对水相层进行纯化的操作可以省略。
在其中一个实施例中，酶解物与有机溶剂的体积比为1：1.5～1：7。
在其中一个实施例中，有机溶剂选自乙酸乙酯及丙酮中的至少一种。
在其中一个实施例中，萃取的时间为30min～40min。
在其中一个实施例中，将酶解物与有机溶剂混合，萃取，得到水相层的操作具体为：将 酶解物、有机溶剂与水混合，萃取，得到水相层。通过将酶解物、有机溶剂与水混合，更有 利于萃取的进行。其中，水为去离子水或超纯水。
更具体地，将450g～550g的酶解物、3150mL～3850mL的乙酸乙酯与900mL～1100mL的 水混合，萃取，得到水相层。进一步地，重复萃取至少三次；将每次萃取得到的水相层合并， 以进行纯化。可选地，将500g的酶解物、3500mL的乙酸乙酯和1000mL的水混合，萃取，重复五次，得到水相层。
在其中一个实施例中，将水相层进行纯化的操作具体为：将水相层进行干燥；将干燥后 的水相层进行色谱法分离，得到活性肽。
具体地，将水相层进行干燥的操作中，干燥的方式为真空低温冷冻干燥。需要说明的是， 干燥的方式不限于冷冻干燥，还可以为其他干燥方式，例如风干。
将干燥后的水相层进行色谱法分离的方法为HPLC，即高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography)。具体地，HPLC的条件为：色谱柱为Cosmosil 5C18，流动相为体积 百分含量为30％的甲醇的水溶液，流速为0.8mL/min～1.0mL/min，检测波长为220nm，进样 量为60μL。
通过上述活性肽的制备方法可以得到天然的活性肽，且活性肽的纯度较高。
一实施方式的活性肽的制备方法，包括如下步骤：通过化学合成方法合成活性肽。
在其中一个实施例中，化学合成方法为多肽固相合成法。进一步地，化学合成方法为Boc 固相合成法或Fmoc固相合成法。其中，Boc为叔丁氧羰基。Boc固相合成法中以易酸解的 Boc基团作为N-ɑ-保护基团。Fmoc为9-芴甲氧羰基。Fmoc固相合成法中以易酸解的Fmoc基团作为N-ɑ-保护基团。
上述活性肽的制备方法，工艺简单、操作方便，且能够制备纯度较高的活性肽。
以下为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验 指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
如未特别说明，以下实施例中，Fmoc-His-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Tyr-OH均购于阿拉丁试剂有限公司。巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院细胞库。DMEM培养基购于LifeTechnologies,Grand Island,NY,USA公司。LPS购于阿拉丁试剂有限公司。FBS(胎牛血清，fetal bovine serum)购于Life Technologies,Grand Island,NY,USA公司。
实施例1
本实施例的活性肽的制备过程如下：
(1)向400g的石金钱龟肉糜加入3500mL的超纯水混合，得到肉糜水。向肉糜水中加入600U/mL的碱性蛋白酶(酶为郑州市伟丰生物科技有限公司的2017-JD-0812的碱性蛋白酶)于35℃、pH为8.5下酶解3h，将酶解后的肉糜水放入85℃下灭酶10min，灭酶结束后，10000r/min离心15min收集上清；将上清进行干燥至含水量为0.1％，得到酶解物。
(2)将500g的酶解物、3500mL的乙酸乙酯和1000mL的超纯水混匀，静置萃取35min，收集水相层，重复萃取四次，将四次萃取收集的水相层混合进行真空低温冻干，得到干燥后的水相层。
(3)将干燥后的水相层进行色谱法分离，得到活性肽。将干燥后的水相层进行色谱法分 离的条件为：色谱柱为Cosmosil 5C18，流动相为体积百分含量为30％的甲醇的水溶液，流速 为0.9mL/min，检测波长为220nm，进样量为60μL。
实施例2
本实施例的活性肽的制备过程如下：
(1)取100mg的Fmoc-His Wang Resin(组氨酸预装树脂，购于阿拉丁公司且货号为2018-01-225-NU)置于固相合成管中，加入25mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)后静置使 预装树脂充分溶胀，滤去溶剂，再加入5mL的含有质量百分含量为20％的哌啶的DMF溶液， 振荡后滤出溶剂，得到处理后的树脂。
(2)将4mg的Fmoc-Tyr-OH(购于阿拉丁公司且货号为2018-01-225-N22)、5mg的1-羟基苯并***、3mg的O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶于20mL的DMF中，在加入30mg的N,N-二异丙基乙胺混匀后避光，得到活化的Fmoc-Tyr-OH。将活化后的Fmoc-Tyr-OH加入步骤(1)得到的处理后的树脂中，常温下氮气吹动搅拌70min，过滤，采用DMF和二氯甲 烷依次洗涤沉淀，去除溶剂，得到第一反应物。
(3)按照步骤(2)的操作活化Fmoc-Gly-OH，得到活化的Fmoc-Gly-OH；按照步骤(2)的操作，将活化后的Fmoc-Gly-OH加入第一反应物中，得到第二反应物。按照步骤(2)的 操作活化Fmoc-His-OH，得到活化的Fmoc-His-OH；按照步骤(2)的操作，将活化后的 Fmoc-His-OH加入第二反应物中，得到第三反应物。
(4)用乙醇洗涤第三反应物，固液分离，将上清液依次进行旋转蒸发浓缩、冷冻干燥， 得到活性肽。
测试：
1、采用高效液相色谱对实施例1～2的活性肽的纯度进行测定，并采用质谱对实施例1 的活性肽进行鉴定。
其中，高效液相色谱测定条件为：Boston Green ODS-AQ色谱柱(250*4.6mm)；以体积 百分含量为0.1％的三氟乙酸的水溶液为流动相A，以体积百分含量为0.1％的三氟乙酸的乙腈 溶液为流动相B，流动相A与流动相B的体积比为75:25；流速为1mL/min；检测波长为220nm； 进样量10μL；标准品为色氨酸；
质谱测定条件：ESI正离子模式，毛细管电压为3kV，锥孔电压为50V，萃取电压为5V， 脱溶剂温度为350℃，雾化气流为350L/h。
测定结果详见表1和图1～2。表1表示的是实施例1～2的活性肽的纯度。图1为实施例1 的活性肽的质谱图。图2为实施例1的活性肽的高效液相色谱图，箭头(2-1)即为活性肽的 吸收峰。
表1实施例1～2的活性肽的纯度
| 实施例1 | 实施例2 | |
| 纯度(％) | 98.2 | 98.8 |
从图1～2可以看出，实施例1的活性肽的氨基酸序列为His-Tyr-Gly-His，其结构式如下：
从表1可以看出，实施例1～2得到的活性肽的纯度均在98.0％以上，说明上述实施方式 的活性肽的制备方法能够获得具有较高纯度的活性肽。
2、不同浓度的活性肽对LSP引起的巨噬细胞RAW264.7(以下简称巨噬细胞)凋亡的影 响
(1)实验共分为四组，分别为实验组1(即LPS组)、实验组2(即OCMMK-1-L组)、 实验组3(即OCMMK-1-H组)、对照组(即Control组)，每组三个平行实验。
(2)将巨噬细胞接种于DMEM培养基中于37℃进行培养。其中，在实验组1的培养基中加入1mg/mL的LPS和体积百分含量为1％的FBS处理12h；在实验组2～3的培养基中分 别加入21.2μM、42.4μM的实施例1的活性肽培养24h，然后在实验组2～3的培养基中均加入1mg/mL的LPS和体积百分含量为1％的FBS处理12h；对照组的培养基添加体积百分含量为1％的FBS，培养12h。培养完全结束后，得到四组培养后的巨噬细胞。
(3)测定四组培养后的巨噬细胞的存活率。具体地，采用对各组培养前和培养后的巨噬 细胞进行计数，并计算巨噬细胞的存活率。测定结果详见图3。图3表示的是LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞存活率的对比图。图3中a表示活 性肽可以明显提高LPS导致的细胞生存率降低。图3中b表示LPS显著降低了细胞的生存率。
从图3可以看出，LPS组的细胞存活率低于Control组，说明LPS的加入能够引起巨噬 细胞凋亡。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的细胞存活率分别为85.6±1.98％和90.8±2.04％， 均高于LPS组(LPS组的细胞存活率为71.3±2.43％)，说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行 处理，能够较为明显地降低巨噬细胞的凋亡。
(4)采用流式细胞仪(即FACS)对步骤(2)中四组培养后的巨噬细胞进行检测，测定结果详见图4～7。
其中，图4为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的凋亡 的FACS分析的散点图；图5为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨 噬细胞的凋亡的柱状统计图，图5中Contol组与LPS组的连线和*表示Contol组与LPS组的 P<0.05，OCMMK-1-H组与LPS组的连线和*表示OCMMK-1-H组与LPS组的P<0.05；图6 为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的细胞周期影响的FACS 分析对比图；图7为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞的细 胞周期影响的影响的柱状统计图，图7中Contol组与LPS组的连线和*表示Contol组与LPS 组的P<0.05，OCMMK-1-H组与LPS组的连线和*表示OCMMK-1-H组与LPS组的P<0.05。
凋亡和坏死的总和(Total Apoptosis&necrosis)是指凋亡早期(EarlyApoptosis)、晚期 凋亡和坏死(Late Apoptosis&necrosis)之和。细胞比例指已经处于相应状态下的细胞占总细 胞的比例，例如：凋亡早期情况下的细胞比例为10％表示已处于进入凋亡早期的细胞占总细 胞10％；G2/M情况下的细胞的比例为10％表示处于G2/M期的细胞占总细胞的10％。
从图4～5可以看出，LPS组的凋亡和坏死的总和的细胞比例高于Control组，说明LPS 的加入能够引起巨噬细胞凋亡或坏死。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的凋亡和坏死的总和的细胞比例均低于LPS组，说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地降低LPS引起的巨噬细胞的凋亡或坏死。
从图6～7可以看出，LPS组的G2/M期的细胞比例高于Control组，说明LPS可以较明显地将巨噬细胞阻滞于细胞周期的G2/M期。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的G2/M期 的细胞比例均低于LPS组，说明活性肽对LPS引起的细胞周期的阻滞具有明显的减弱作用。
(5)测定不同浓度的活性肽对炎症细胞因子的影响。具体地，采用NO ELISA方法(即 NO ELISA试剂盒)测定四组培养后的巨噬细胞内的NO的含量；采用ELISA方法(即 TNF-αELISA试剂盒)测定四组培养后的巨噬细胞内的TNF-α的含量；采用ELISA方法(即 IL-6ELISA试剂盒)测定四组培养后的巨噬细胞内的IL-6的含量；采用ELISSIA方法测定四 组培养后的巨噬细胞内的IL-1β的含量。测定结果详见图8～11。
其中，图8为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内NO 的相对含量的对比图，图8中的相对表达量是指将Control组的表达量设为1，其他组的表达 量即为各组与Control组的表达量的比值，图8中a表示LPS可以明显的升高细胞内的NO 含量，b表示活性肽显著降低了LPS诱导升高的NO含量；图9为LPS组、OCMMK-1-L组、 OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内TNF-α含量的对比图，图9中a表示LPS可以明 显的升高细胞内的TNF-α含量，b表示活性肽显著降低了LPS诱导升高的TNF-α含量；图 10为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞内IL-6含量的对比 图，图10中a表示LPS可以明显的升高细胞内的IL-6含量，b表示活性肽显著降低了LPS 诱导升高的IL-6含量；图11为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨 噬细胞内IL-1β含量的对比图，图11中a表示LPS可以明显的升高细胞内的IL-1β含量，b 表示活性肽显著降低了LPS诱导升高的IL-1β含量。
从图8可以看出，LPS组的NO的相对表达量高于Control组，说明LPS的加入能够引起巨噬细胞内的NO大量分泌。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的NO的相对表达量均低 于LPS组，说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地降低LPS引起的巨噬 细胞的NO大量分泌。
从图9可以看出，LPS组的TNF-α含量高于Control组，说明LPS的加入能够引起巨噬细胞内的TNF-α大量分泌。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的TNF-α含量均低于LPS组， 说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地缓解LPS对巨噬细胞的作用，抑 制巨噬细胞大量分泌TNF-α。
从图10可以看出，LPS组的IL-6含量高于Control组，说明LPS的加入能够引起巨噬细 胞内的IL-6大量分泌。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的IL-6含量均低于LPS组，说明 预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地缓解LPS对巨噬细胞的作用，抑制巨 噬细胞大量分泌IL-6。
从图11可以看出，LPS组的IL-1β含量高于Control组，说明LPS的加入能够引起巨噬 细胞内的IL-1β大量分泌。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的IL-1β含量均低于LPS组， 说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地缓解LPS对巨噬细胞的作用，抑 制巨噬细胞大量分泌IL-1β。
综上，LPS的加入能够引起巨噬细胞内的炎症细胞因子大量分泌，进而诱发炎症，而活 性肽能够缓解LPS对巨噬细胞的作用，抑制巨噬细胞大量分泌或表达炎症细胞因子。
(6)测定活性肽对巨噬细胞内与细胞炎症通路相关的蛋白表达的影响。
具体地，采用Western Blot测定四组培养后的巨噬细胞内与细胞炎症通路相关的蛋白表 达。测定结果详见图12～14。图12为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control 组的巨噬细胞中iNOS蛋白相对表达量的电泳对比图；图13为LPS组、OCMMK-1-L组、 OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞中iNOS蛋白相对表达量的柱状对比图，图13中的相 对表达量是指将LPS组的表达量设为1，其他组的表达量即为各组与LSP组的表达量的比值； 图14为LPS组、OCMMK-1-L组、OCMMK-1-H组、Control组的巨噬细胞中IkB-α、p65、 p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38蛋白相对表达量的电泳对比图。
从图12～13可以看出，LPS组的iNOS的蛋白相对表达量高于Control组，说明LPS能够 引起iNOS过表达。OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的iNOS蛋白相对表达量均低于LPS 组，说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地改善LPS引起的巨噬细胞过 表达iNOS。
从图14可以看出，LPS组的p65、p-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白相对表达量高于Control 组，LPS组的IkB-α、ERK、JNK、p38的蛋白相对表达量低于Control组，说明LPS能够引 起p65、p-ERK、p-JNK、p-p38过表达，抑制IkB-α、ERK、JNK、p38的表达。OCMMK-1-L 组和OCMMK-1-H组的ip65、p-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白相对表达量均低于LPS组， OCMMK-1-L组和OCMMK-1-H组的i IkB-α、ERK、JNK、p38的蛋白相对表达量均高于LPS 组，说明预先采用活性肽对巨噬细胞进行处理，能够较为明显地改善LPS引起的巨噬细胞过 表达p65、p-ERK、p-JNK、p-p38，缓解LPS对巨噬细胞的IkB-α、ERK、JNK、p38表达的 抑制作用。
综上，上述活性肽抑制LPS引起的细胞凋亡，改善LPS引起的细胞周期的阻滞，抑制LPS引起的炎症细胞因子的大量分泌或表达，以抑制炎症产生，影响细胞炎症通路相关的蛋白表达。上述活性肽具有优异的抗炎性，肽链较短，易于吸收，能够直接用于合成蛋白，安全性较高，能够用于制备血清脂肪酶引起的炎症的药物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中 的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾， 都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳凯联健康生物科技有限公司
<120> 活性肽、重组载体、重组细胞、抗炎组合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Thr Gly His 1
<210> 2
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacuacggac au 12
Claims (10)
1.一种活性肽，其特征在于，所述活性肽含有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的短肽。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述短肽的编码序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
所述编码序列为与SEQ ID No.2所示核苷酸序列具有80％同源性的核苷酸序列；或
所述编码序列为由SEQ ID No.2所示核苷酸序列中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有编码权利要求1所述的活性肽的核苷酸；或者，
所述重组细胞含有权利要求2～3任一项所述的重组载体。
5.一种抗炎组合物，其特征在于，包括活性组分，所述活性组分包括权利要求1所述的活性肽。
6.根据权利要求5所述的抗炎组合物，其特征在于，还包括辅助组分，所述辅助组分包括维生素C、维生素E、辅酶Q、谷胱甘肽、胡萝卜素及甜菜碱中的至少一种。
7.权利要求1所述的活性肽、权利要求2～3任一项所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或权利要求5～6任一项所述的抗炎组合物在制备预防或治疗血清脂肪酶引起的炎症的药物中的应用。
8.权利要求1所述的活性肽在制备食品或保健品中的应用。
9.权利要求1所述的活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：从石金钱龟中分离得到所述活性肽；或
通过化学合成方法合成所述活性肽。
10.根据权利要求9所述的活性肽的制备方法，其特征在于，所述从石金钱龟中分离得到所述活性肽包括如下步骤：
将石金钱龟肉酶解，得到酶解物；及
采用有机溶剂对所述酶解物进行萃取，得到所述活性肽。
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