CN109432195B - 一种茶氨酸和γ-氨基丁酸的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及茶氨酸和γ‑氨基丁酸的提取领域，具体公开了一种茶氨酸和γ‑氨基丁酸的提取方法及其应用，通过玛卡、γ‑氨基丁酸、合欢花、茶氨酸、积雪草、蕤核仁的联合应用对睡眠有明显的改善作用，其制备工艺简单，能够充分、高效的提取有效成分，所制备成的药物具有无毒性，安全，可口服，可食用，保健功能等优点。
Description
技术领域
本发明涉及茶氨酸和γ-氨基丁酸的提取领域，尤其涉及一种茶氨酸和γ-氨基丁酸的提取方法及其应用。
背景技术
茶氨酸是茶叶中含量最高的氨基酸，约占游离氨基酸总量的50％以上，占茶叶干重的1％-2％。茶氨酸为白色针状体，易溶于水。具有甜味和鲜爽味，是茶叶的滋味的组分。日本人常用遮荫的方法来提高茶叶中茶氨酸的含量，以增进茶叶的鲜爽味。其主要功效有：(1)吸收与代谢。口服茶氨酸进人人体后通过肠道刷状缘黏膜被吸收，进入血液，通过血液循环分散到组织器官，一部分在肾脏被分解后从尿中被排出。被吸收到血和肝脏的茶氨酸在1小时后浓度下降，脑中的茶氨酸在5小日才后达到最高，24小时后人体中茶氨酸都消失了，以尿的形式排出。(2)调节脑内神经传达物质的变化。茶氨酸影响脑中多巴胺等神经传达物质的代谢和释放，由这些神经传达物质控制的脑部的疾病也有可能因此得到调节或预防。(3)镇静作用。咖啡碱是众所周知的***，但人们在饮茶时反而感到放松、平静、心情舒畅。现已证实这主要是茶氨酸的作用。(4)保护神经细胞。茶氨酸能抑制短暂脑缺血引起的神经细胞死亡，对神经细胞有保护作用。神经细胞的死亡与兴奋型神经传达物质谷氨酸有密切联系。在谷氨酸过多的情况下会出现细胞死，这通常是老年痴呆等症的病因。茶氨酸与谷氨酸结构相近，会竞争结合部位，从而抑制神经细胞死。茶氨酸有可能用于对谷氨酸引起的脑障碍，如脑栓塞、脑出血等脑中风，以及脑手术或脑损伤时出现的虚血和老年痴呆等疾病的治疗及预防。(5)降低血压的作用。在动物试验中，给高血压自发症大鼠注射茶氨酸，其舒张压、收缩压以及平均血压都下降，降低程度与剂量有关，但心率没有大的变化；茶氨酸对血压正常的鼠没有降低血压的作用，表明茶氨酸只对患高血压病的大鼠有降压效果。茶氨酸可能是通过调节脑中神经传达物质的浓度来起到降低血压的作用。(6)增强抗癌药物的疗效。癌症的发病率和死亡率居高不下，为治疗癌症所开发的药物往往具有很强的副作用。在癌症治疗时，除了使用抗癌药物外，还必须同时使用多种抑制其副作用的药物。茶氨酸本身无抗肿瘤活性，但能提高多种抗肿瘤药的活性。茶氨酸与抗肿瘤药并用时，茶氨酸能阻止抗肿瘤药从肿瘤细胞中流出，增强了抗肿瘤药的抗癌效果。茶氨酸还能减少抗肿瘤药的副作用，如调节脂质过氧化水平，减轻抗肿瘤药引起的白血球及骨髓细胞的减少等副作用。茶氨酸还具有抑制癌细胞浸润的作用，癌细胞浸润是癌细胞扩散的必要途径。抑制其浸润可阻止癌症的扩散。
目前通过酶法合成生产的茶氨酸，价格昂贵；用化学合成生产的茶氨酸的安全性还有待验证。从茶叶中直接提取茶氨酸由于它来源于天然产物，有着较好的安全性。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是广泛分布于动物体内的一种重要的抑制性神经递质，是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能，它参与多种代谢活动，在大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用，包括促进脑的活化性，健脑益智，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能；参与产生镇静、镇痛效应、抗焦虑、防治惊厥、舒缓血管和降血压、防止动脉硬化调节心律失常以及调节生殖生理激素的分泌的功能。正是由于具有的多种生理功能，γ-氨基丁酸在医药、保健品、食品、饲料添加剂等领域具有广泛的应用。GABA市场增长较为缓慢，源于消费者对这类产品的认知不足。如今并没有熟练掌握相关高纯度提取技术，并且存在成本与产品的不对等、难以产业化生产的难题，所以GABA提纯制备技术并不完善，尤其是食品级的GABA提取。目前的制备主要分为化学法和生物法两大类，其中生物法又包括植物富集法和微生物发酵法。
目前临床上对失眠的治疗以西药治疗为主，并以非药物治疗为辅，常用药物主要有巴比妥类、苯二氮卓类和吡咯酮类非苯二氮类抗失眠症药物，这些镇静、催眠类化学药物对中枢神经***有明显的不良反应，长期使用不但出现耐药性和依赖性，还有可能加重病情，最终导致治疗失败。因此安全性相对较高的具有改善睡眠功能的药物或食品越来越受到失眠患者的青睐。
从功效上分析，充分利用两者的有效成分，并将其应用在改善睡眠的药物中，具有重要的意义，但是现有技术中，上述物质有效成分的提取方法众多，但大多具有缺陷。简而言之，一般较简单的方法提取效果并不佳，而能有效提取的方法多数存在易引入杂质、提取方法复杂、成本昂贵的问题，并不利于有效成分的提取及效果。
发明内容
为解决上述问题，本发明旨在提供一种茶氨酸和γ氨基丁酸的提取方法及其在制备改善睡眠质量的药物中的应用，安全高效、其制备工艺简单，能够充分的提取有效成分，产物具有无毒性，安全，保健功能等功能。
一种茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，包括以下步骤：
S1：称取白茶和桑叶，放入碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
S2：取步骤S1中药渣，加入柠檬酸水溶液中，浸泡，微波提取，过滤，得上清液2；
S3：将上清液1和2混合，加絮凝剂絮凝，过滤，得上清液3；
S4：取上清液3，浓缩、干燥，得茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物，待用。
优选地，步骤S1中白茶和桑叶的质量比1:1-3，碳酸氢钠的浓度为3-8％，水杨酸钠的浓度为5-15％。
优选地，步骤S2中柠檬酸的浓度为10-20％。
优选地，步骤S2中微波的功率为200-400W，60-100HZ，提取时间为2-4h。
优选地，步骤S3中絮凝剂为壳聚糖、明胶、聚丙烯酰胺中的任一种。
优选地，步骤S3中絮凝剂用量为200-800ppm，作用温度为50-80℃。
优选地，步骤S3中还包括调节pH值，所述pH值为3-5。
优选地，步骤S4中还包括调节pH值，所述pH值为6-8。
本发明的目的还在于，提供一种含有上述提取方法提取的茶氨酸和γ-氨基丁酸的改善睡眠的组合物。
优选地，上述改善睡眠的组合物，还包含以下组分：玛卡、合欢花、蕤核仁、积雪草。
优选地，上述改善睡眠的组合物，按重量份数计，包括以下组分：玛卡3-13份、茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物3-12份、合欢花2-8份、蕤核仁1-5份、积雪草2-7份。
更优选地，上述改善睡眠的组合物，按重量份数计，包括以下组分：玛卡5-10份、茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物4-9份、合欢花5-7份、蕤核仁2-4份、积雪草3-6份。
本发明的目的还在于提供一种上述改善睡眠的组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将玛卡粉碎，放于乙醇中浸泡，得乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取(1)中滤渣加入乙醇溶液，浸泡，水浴回流，减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取合欢花，加入去离子水中浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取积雪草，加入乙醇，提取，分别加入醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入上述的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物，然后加入步骤(4)中的产物，混匀，即得。
优选地，步骤(1)中将玛卡粉碎成10-40目颗粒，乙醇的浓度为70-95％，质量为玛卡的5-8倍，浸泡温度为20-30℃，浸泡时间为6-12h。
优选地，步骤(2)中乙醇为滤渣质量的2-6倍，乙醇的浓度为70-95％，浸泡温度为50-60℃，浸泡时间为4-8h后；减压浓缩在50-60℃下进行。
优选地，步骤(3)中去离子水为合欢花质量的5-10倍；乙醇的浓度为70-95％，质量为合欢花药渣和蕤核仁总质量的6-12倍。
优选地，步骤(4)中乙醇浓度为50-90％，质量为积雪草质量的5-15倍，提取时间3-6h；醋酸乙酯、丙酮的质量分别为积雪草质量的4-8倍。
优选地，上述制备步骤制得的终产物可进一步制成片剂、丸剂、胶囊、糖浆的任一种。
本发明的另一个目的还在于提供所述改善睡眠的组合物或上述制备方法制备的改善睡眠的组合物在制备改善睡眠药物中的应用。
本申请与现有技术比，茶氨酸和γ-氨基丁酸的提取方法的优势在于：
(1)将白茶和桑叶一起放置在碳酸氢钠溶液中，一方面两者可以相互作用，有利于有效成分提取，另一方面，碳酸氢钠溶液给有效成分的提取创造了更好的溶液条件，更有利于提取出的有效成分稳定存在于溶液中。
(2)柠檬酸的加入更有利于进一步提取步骤S1中未提取出来的γ-氨基丁酸。
(3)絮凝剂的加入，有利于除去悬浮或微溶于提取液中的其它无关杂质。
与现有技术比，改善睡眠的组合物制备方法的优势在于：
(1)先采用低温提取法后采用高温提取法分别将活性成分提取后混合，有利于玛卡中活性成分更有效的提取和保存及保持原料的色泽，且产品的溶解性高，大大减少了固体物质的收率，为提取物后期的应用和产品的稳定性的保持提供了很大的优势。
(2)将合欢花药渣和蕤核仁混合后提取，有利于促进蕤核仁有效成分的提取，更有助于发挥二者的协同作用，使得与其他组分组合后具有更好的改善睡眠的效果。
(3)该组合物制备工艺较简单，对设备要求不高，且成本较低，因而具有较好的应用与开发前景。
具体实施方式
实施例1
S1：称取白茶1份和桑叶2份，放入的碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，其中，碳酸氢钠浓度为6％，水杨酸钠的浓度为10％超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
S2：取步骤S1中药渣，加入浓度为15％柠檬酸水溶液中，浸泡，采用微波提取，设置微波功率为300W，80HZ，提取3h，过滤，得上清液2；
S3：将上清液1和2混合，调节pH值至4，60℃下，加入600ppm的明胶絮凝，过滤，得上清液3；
S4：取上清液3，调节pH值至7，浓缩、干燥，得茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物。
实施例2
S1：称取白茶1份和桑叶1份，放入的碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，其中，碳酸氢钠浓度为3％，水杨酸钠的浓度为15％，超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
S2：取步骤S1中药渣，加入浓度为10％柠檬酸水溶液中，浸泡，采用微波提取，设置微波功率为200W，60HZ，提取4h，过滤，得上清液2；
S3：将上清液1和2混合，调节pH值至3，50℃下，加入200ppm的壳聚糖絮凝，过滤，得上清液3；
S4：取上清液3，调节pH值至6，浓缩、干燥，得茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物。
实施例3
S1：称取白茶1份和桑叶3份，放入的碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，其中，碳酸氢钠浓度为8％，水杨酸钠的浓度为5％，超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
S2：取步骤S1中药渣，加入浓度为20％柠檬酸水溶液中，浸泡，采用微波提取，设置微波功率为400W，100HZ，提取2h，过滤，得上清液2；
S3：将上清液1和2混合，调节pH值至5，80℃下，加入800ppm的聚丙烯酰胺絮凝，过滤，得上清液3；
S4：取上清液3，调节pH值至8，浓缩、干燥，得茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物。
实施例4
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于6倍质量的浓度为85％的乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的85％的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
实施例5
(1)将3份的玛卡粉碎成10目颗粒，20℃下，放于5倍质量的浓度为95％的乙醇中浸泡6h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入6倍的95％的乙醇溶液，50℃下，浸泡4h，水浴回流，60℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取2份合欢花，加入10倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取1份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入12倍质量的浓度为70％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取7份积雪草，加入5倍质量的浓度为50％的乙醇，提取3h，分别加入4倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物12份，然后加入上述产物，混匀，加入蔗糖及辅料，制成糖浆，即得。
实施例6
(1)将13份的玛卡粉碎成40目颗粒，30℃下，放于8倍质量的浓度为70％的乙醇中浸泡12h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入2倍的70％的乙醇溶液，60℃下，浸泡8h，水浴回流，50℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取8份合欢花，加入5倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取5份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入6倍质量的浓度为95％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取2份积雪草，加入15倍质量的浓度为90％的乙醇，提取6h，分别加入8倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物3份，然后加入上述产物，混匀，加入辅料，制成片剂。
实施例7
(1)将5份的玛卡粉碎成20目颗粒，20℃下，放于7倍质量的浓度为75％的乙醇中浸泡7h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的75％的乙醇溶液，50℃下，浸泡6h，水浴回流，60℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取5份合欢花，加入10倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取2份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入12倍质量的浓度为75％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取6份积雪草，加入15倍质量的浓度为75％的乙醇，提取4h，分别加入5倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例2的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物9份，然后加入上述产物，混匀，加入辅料，制成丸剂。
实施例8
(1)将10份的玛卡粉碎成30目颗粒，30℃下，放于8倍质量的浓度为85％的乙醇中浸泡10h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入4倍的85％的乙醇溶液，60℃下，浸泡7h，水浴回流，60℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取7份合欢花，加入10倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取4份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入9倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取3份积雪草，加入5倍质量的浓度为60％的乙醇，提取6h，分别加入8倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例3的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物4份，然后加入上述产物，混匀，加入辅料，制成胶囊。
对比例1(与实施例4相比，不含茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例2(与实施例4相比，茶氨酸和γ-氨基丁酸分别提取)
(1)茶氨酸和γ-氨基丁酸的提取(参照实施例1的方法)
S1：称取白茶1份，放入的碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，其中，碳酸氢钠浓度为6％，水杨酸钠的浓度为10％超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
取步骤S1中药渣，加入浓度为15％柠檬酸水溶液中，浸泡，采用微波提取，设置微波功率为300W，80HZ，提取3h，过滤，得上清液2；
将上清液1和2混合，调节pH值至4，加明胶，过滤；上清液，调节pH值至7，浓缩、干燥，得茶氨酸。
S2：称取桑叶2份，放入的碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，其中，碳酸氢钠浓度为6％，水杨酸钠的浓度为10％超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
取步骤S1中药渣，加入浓度为15％柠檬酸水溶液中，浸泡，采用微波提取，设置微波功率为300W，80HZ，提取3h，过滤，得上清液2；
将上清液1和2混合，调节pH值至4，加明胶，过滤；
取上清液3，调节pH值至7，浓缩、干燥，得γ-氨基丁酸。
(2)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(3)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(4)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(5)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(6)将上述浓缩液1-3混合后，加入上述(1)制备的3.5份茶氨酸和3.5份γ-氨基丁酸，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例3(与实施例4相比，不含茶氨酸)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入对比例2(S2)制备的γ-氨基丁酸7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例4(与实施例4相比，不含γ-氨基丁酸)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入对比例2(S2)制备的茶氨酸7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例5(与实施例4相比，不含合欢花)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例6(与实施例4相比，不含蕤核仁)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；将合欢花药渣，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例7(与实施例4相比，组份配比不同)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例8(与实施例4相比，组份配比不同)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于乙醇中浸泡8h，将得到的乙醇浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
对比例9(与实施例4相比，玛卡的制备方法不同)
(1)将8份的玛卡粉碎成30目颗粒，25℃下，放于6倍质量的去离子水中浸泡8h，将得到的浸提液，离心，过滤，分别得上清液和滤渣，取上清液浓缩，得浓缩液1；
(2)取上述滤渣加入5倍的85％的乙醇溶液，55℃下，浸泡6h，水浴回流，57℃下减压浓缩，得浓缩液2，备用；
(3)称取6份合欢花，加入8倍的去离子水浸泡，煮沸，滤过，得合欢花药渣和滤液1；称取3份蕤核仁，粉碎，脱脂处理后，同合欢花药渣混合，再加入7倍质量的浓度为85％的乙醇浸泡，超声波震荡后煮沸，滤过，得滤液2，合并滤液1、2，减压浓缩，得浓缩液3；备用；
(4)称取5份积雪草，加入12倍质量的浓度为70％的乙醇，提取5h，分别加入6倍质量的醋酸乙酯、丙酮至析出白色结晶，边加边搅拌，冷藏，抽滤，产物备用；
(5)将上述浓缩液1-3混合后，加入实施例1的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物7份，然后加入上述产物，混匀，即得。
效果试验
试验例 对小鼠改善睡眠的功效研究
参照《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》中“十、改善睡眠功能检验方法”的试验方法进行研究。
给药方式：待测样品(受试物)为本发明实施例1-8以及对比例1-9制备得到的组合物，以灌胃方式给受试物，灌胃量为0.4g/kg，受试时间为30天。以动物的翻正反射消失超过60s判为进入睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒。
1.1直接睡眠实验
按照上述给药方式给药，末次给受试物后观察小鼠睡眠情况，实验动物在给予受试物后，有部分动物表现为嗜睡、安静和活动减少，但没有翻正反射消失者，表明样品对小鼠没有明显的直接睡眠作用。
1.2延长戊巴比妥钠睡眠时间
按照上述给药方式给药，各组动物在末次给受试物后15min，经腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，以动物的翻正反射消失为指标，观察受试物能否延长戊巴比妥钠睡眠时间。
表1不同组合物对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响
注：不同字母之间代表具有显著性差异P<0.05
受试物各实验组小鼠的睡眠时间均比空白组延长，且与差异均具有极显著性意义，表明该样品具有显著延长戊巴比妥钠睡眠时间的作用，且实施例4-8的实验效果优于实施例1-3，和对比例1-9。
1.3戊巴比妥钠阈下剂量催眠
按照上述给药方式给药，各组动物在末次给受试物后15min，经腹腔注射戊巴比妥钠15mg/kg，观察30min内小鼠的睡眠情况。
表2不同组合物对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响
注：不同字母之间代表具有显著性差异P<0.05
各实验组入睡动物发生率高于空白组，提示该样品与阈下剂量的戊巴比妥钠有一定的协同催眠作用，其中实施例4-8的作用优于实施例1-3和对比例1-9的催眠作用。
1.4巴比妥钠睡眠潜伏期
按照上述给药方式给药，各组动物在末次给受试物后20min，经腹腔注射巴比妥钠200mg/kg，观察巴比妥钠睡眠潜伏期。
表3不同组合物对巴比妥钠诱导小鼠入睡的潜伏期的影响
注：不同字母之间代表具有显著性差异P<0.05
本发明改善睡眠功效实验结果表明，本发明提供组合物具有良好的改善睡眠的效果，其中直接睡眠时间实验结果为阴性，其余三项均为阳性，比对比例1-9的效果更好，说明本申请制备得到的改善睡眠的组合物各组分之间具有良好的协同作用，对比例2与实施例4组分相同，但在茶氨酸和γ氨基丁酸的制备方法上有区别，对比例9与实施例4相比在于其它组分(玛卡)的制备方法上有区别，但是对比例2、对比例9在改善睡眠方面的效果比本申请实施例4差很多，进一步说明本发明的制备方法能够将有效成分充分提取出来，帮助组分之间更好地发挥协同效应，提高改善睡眠的效果。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，包括以下步骤：
S1：称取白茶和桑叶，放入碳酸氢钠和水杨酸钠的混合溶液中，超声提取，过滤，得药渣和上清液1；
S2：取步骤S1中药渣，加入柠檬酸水溶液中，浸泡，微波提取，过滤，得上清液2；
S3：将上清液1和2混合，调节pH值至3-5，加絮凝剂絮凝，过滤，得上清液3；
S4：取上清液3，浓缩、干燥，得茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物，待用；
步骤S1中白茶和桑叶的质量比1:1-3，碳酸氢钠的浓度为3-8%，水杨酸钠的浓度为5-15%；步骤S2中柠檬酸的浓度为10-20%。
2.如权利要求1茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，其特征在于：步骤S2中微波的功率为200-400W，60-100HZ，提取时间为2-4h。
3.如权利要求1茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，其特征在于：步骤S3中絮凝剂为壳聚糖、明胶、聚丙烯酰胺中的任一种。
4.如权利要求3茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，其特征在于：步骤S3中絮凝剂用量为200-800ppm，作用温度为50-80℃。
5.如权利要求1茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合提取方法，其特征在于：步骤S4中还包括调节pH值，所述pH值为6-8。
6.一种改善睡眠的组合物，按照重量份数计，所述组合物的原料为：权利要求1所述提取方法提取的茶氨酸和γ-氨基丁酸的混合物3-12份、玛卡3-13份、合欢花2-8份、蕤核仁1-5份、积雪草2-7份。
7.如权利要求6所述改善睡眠的组合物在制备改善睡眠药物中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |