CN109430245A - 一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置,包括载杆和外套管,所述的载杆由前到后依次包括冷冻条、载杆杆体和手柄部,所述的载杆杆体上设有滑槽,所述的外套管套在载杆杆体上,外套管内设有与滑槽相配合的舌部。本发明可用于人类辅助生殖技术中胚胎或卵子玻璃化冷冻保存,不仅结构简单、降温速度快、冷冻效率高、安全无创,而且解决了套外套管时必须双手操作的问题,缩短了操作时间,提高了操作效率,减少了胚胎丢失、载杆弯折、胚胎暴露在液氮外而死亡等意外的发生,降低了操作人员的失误和冻伤的概率,便于临床常规大批量胚胎冷冻。
Description
技术领域
本发明涉及玻璃化冷冻技术领域,具体涉及一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置。
背景技术
1990年,Gordts等报道了用玻璃化冷冻人卵裂期胚胎获得妊娠,标志着玻璃化保存技术走向临床实用化。玻璃化冷冻是通过高浓度的冷冻液和较快的冷却速率使液体转变为非晶态的固化过程,避免了冷冻过程中细胞内外冰晶的形成,胚胎的存活率得到了大大提高,而且操作简便快捷,因此很快在全世界范围内得到广泛应用。
目前,应用广泛的玻璃化冷冻载体主要有两种,一种是开放式载体,即装载胚胎的载体直接投入液氮后,在其外面套上塑料管或塑料瓶保护,如冷冻条(cryotop)、冷冻环(cryloop)等;另一种是封闭式载体,即载体装载胚胎后,套上外套管,再投入液氮,即胚胎不与液氮直接接触,如冷冻片(cryoleaf)、闭合型麦管(CPS、CBS)等。
常规使用的载体在操作过程中,必须同时双手操作,一手捏载杆,一手用镊子夹住外套管(如在液氮中操作一类的载体)或徒手拿外套管(如不在液氮中操作一类的载体),不能单手操作,所需时间长,效率低,且易出现外套管与载杆发生触碰,导致装载的胚胎脱落、丢失等意外。
Cryotop载体由日本KITAZATO公司生产,因操作简单,冷冻速率较高而受到国内外各生殖中心的广泛使用。载体由载杆、外套管组成,外套管自带金属平衡头。使用时将胚胎连同少量冷冻液装上载杆前端,再用吸管尽量吸走胚胎周围的冷冻液,直接投入液氮,在液氮中用双手将外套管套上后冷冻保存。由于胚胎与液氮的接触面积增大,热阻减少,冷冻速率得到大大提高,改善了冷冻存活率。
Cryotop载体虽然操作简单,不足之处是在液氮中装外套管时必须同时需要左右手操作,不能单手操作。由于载杆一般呈细长型,与之相配的外套管内径也很小,外套管容易触碰到载杆前端,容易使装载在载杆前端的胚胎脱落丢失。此外,液氮沸点低,容易汽化,表面形成雾,使操作者视线受阻,使得操作难度增加,在液氮中套外套管的时间延长,容易造成意外,如胚胎丢失、载杆弯折、胚胎暴露在液氮外而死亡等。
Cryoleaf载体由加拿大捷鹰(JY)公司生产,由载杆和外套管组成,使用时将胚胎吸到载杆叶片前端,套上外套管后讯速投入液氮。
CBS载体由法国CryoBioSystem公司生产,包括载杆、外套管以及配套的封口机器和专用剪刀。使用时将胚胎和尽量少的冷冻液吸到载杆前端,套上外套管,用机器封口,再投入液氮保存。解冻时需要专业剪刀剪掉外套管,露出载杆。
上述两种封闭式载体的优点是在投入液氮前就可以很直观的装外套管,且避免了与液氮的直接接触,阻止了液氮里面可能存在的各种病原体对胚胎的潜在污染。它们的缺点在于套外套管时仍需要双手操作,过程复杂,操作不便,不适合大批量胚胎冷冻。此外,封闭式载体由于胚胎与液氮间有外套管间隔,导致热阻增加,降温速率受到影响,进而影响胚胎的冷冻效率。
发明内容
针对本领域现有载体需要双手操作,过程复杂,操作时间长,冷冻效率低等问题,本发明提供了一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置,可用于人类辅助生殖技术中胚胎或卵子玻璃化冷冻保存,不仅结构简单、降温速度快、冷冻效率高、安全无创,而且解决了套外套管时必须双手操作的问题,缩短了操作时间,提高了操作效率,减少了胚胎丢失、载杆弯折、胚胎暴露在液氮外而死亡等意外的发生,降低了操作人员的失误和冻伤的概率,便于临床常规大批量胚胎冷冻。
一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置,包括载杆和外套管,所述的载杆由前到后依次包括冷冻条、载杆杆体和手柄部,所述的载杆杆体上设有滑槽,所述的外套管套在载杆杆体上,外套管内设有与滑槽相配合的舌部。
所述的舌部长5~6mm。
所述的冷冻条分为前后两部分,前部为长条形,上有凹槽,用来装载胚胎。凹槽采用圆弧形槽,凹槽深0.5mm,长20~25mm。冷冻条的后部为实心圆柱体,直径1~1.5mm,长5~10mm。
所述的载杆杆体可以为圆柱体,也可以是四方柱体,优选为圆柱体,直径2~3mm,长50~60mm。
所述的载杆杆体的前部锥形逐渐变细,形成前端延伸部后与冷冻条后部相接。前端延伸部长5~8mm。
优选地,所述的载杆杆体上所设的滑槽的前部锥形闭合,与之相适应,所述的舌部前端也为锥形,与滑槽前部以锥形逐渐缩小相配合,目的是增加外套管滑到槽底时与载杆杆体之间的摩擦力,起到固定作用,防止外套管在外力作用下回弹。
优选地,所述的滑槽采用圆弧底部,所述的舌部的下部也采用圆弧面,与滑槽的圆弧底部相配合,这样,二者不产生挤压变形和应力,方便外套管在载杆杆体上的灵活滑动。
所述的外套管的长度不大于载杆杆体的长度,以保证向上滑动外套管时,能使冷冻条完全暴露,方便操作。
所述的外套管为两端开口的中空圆管,外径3~4mm。外套管的内径稍大于载杆杆体的直径,方便载杆杆体的放入和抽出。
优选地,所述的外套管的前端固定有金属环,起到配重和保护冷冻条的作用。金属环的长度一般为5~10mm。
所述的载杆杆体与手柄部的连接处设有环形凸台,环形凸台的宽度不小于外套管的外径,防止外套管滑出载杆杆体。
优选地,所述的环形凸台为四方柱体,边长3~4mm。
所述的载杆杆体后部锥形加粗形成后端延伸部与环形凸台连接,后端延伸部的外表面以及与后端延伸部外表面接触的外套管的内表面均为粗糙面,目的是增加外套管与载杆杆体之间的摩擦力,使外套管上滑到顶时不会轻易掉下而影响操作。
一般情况下,后端延伸部长0.3~0.6mm,最大外径等于外套管的内径。
所述的手柄部一般采用圆柱体,也可以是四方柱体,优选为圆柱体,直径与载杆杆体相等,长度为20~30mm。
所述的手柄部既为操作者手捏载体装置的部位,同时也可以是黏贴标签的部位,以便于进行标识辨认。
单手操作的玻璃化冷冻载体装置的操作流程包括:
(1)准备胚胎冷冻液,包括平衡液(Equilibration Solution,ES)和玻璃化液(Vitrification Solution,VS);
(2)准备胚胎解冻液,包括TS解冻液(Thawing Solution)、DS解冻液(DilutionSolution)和WS解冻液(Washing Solution);
(3)胚胎冷冻过程:室温操作环境,将胚胎移至平衡液ES,平衡5~15min,胚胎卵裂球从皱缩至完全恢复原形,转移至玻璃化液VS中,一只手捏住载体手柄部,另一只手用细管将胚胎在60s内转移至载体冷冻条前端,迅速把载体前端冷冻条***液氮,此时仍捏住载体手柄部的手可以单手操作将外套管沿滑槽顺势往下滑动,直至槽底,松手,载体完全浸入液氮保存;
(4)胚胎解冻过程:先确认标签,将载体手柄部露出液氮,一只手捏住手柄部,另一只手拿镊子夹住外套管沿滑槽往上滑,迅速把装有胚胎的冷冻条***37℃的TS解冻液中,胚胎在TS解冻液中60s后,依次转移至室温DS解冻液中平衡3min,室温WS解冻液中平衡5~10min,再移入胚胎培养液,放置于37℃、6%CO2培养箱培养备用;
(5)上述的胚胎冷冻液和解冻液可以选用其它玻璃化冷冻液和解冻液代替。
本发明与现有技术相比,主要优点包括:
(1)外套管和载杆杆体之间通过槽舌结构相连,外套管在滑动过程中不产生挤压和弹性变形,操作更为简便,避免了变形时可能导致的外套管滑落等意外事件发生。
(2)提高了冷冻效率。在胚胎装好投入液氮后,只需一只手即刻套上外套管完成冷冻保存,克服了传统载体双手操作的问题,同时有效的将另一只手解放出来,有效节省了时间,提高了冷冻效率。
(3)操作过程中不受液氮表面雾气对操作者视线的影响。胚胎装好投入液氮后,一只手即可将外套管轻轻向下滑到底,步骤简单,无需在液氮中移动载体,也无需仔细辨认,即使操作者的视线受阻也不会妨碍操作,也大大降低了胚胎或卵子意外脱落丢失或暴露液氮外死亡的发生率。
(4)本发明结构简单,设计合理,降温速度快,成本低廉,特别适应于大批量的胚胎或卵子冷冻。
附图说明
图1为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的剖面结构示意图;
图2为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的载杆的结构示意图;
图3为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的冷冻条凹槽部分的横截面示意图;
图4为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的滑槽的横截面示意图;
图5为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的外套管的俯视示意图;
图6为实施例1单手操作的玻璃化冷冻载体装置的外套管的横截面示意图;
图中:1-冷冻条;11-冷冻条前部;12-冷冻条后部;2-载杆杆体;21-滑槽;22-前端延伸部;23-后端延伸部;3-手柄部;31-环形凸台;4-外套管;41-舌部;42-金属环。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,本发明的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
如图1、图2所示,单手操作的玻璃化冷冻载体装置,包括载杆和外套管4。载杆由前到后依次包括冷冻条1、载杆杆体2和手柄部3。外套管4为两端开口的中空圆管,套在载杆杆体2上。
如图3所示,冷冻条1分为前后两部分,前部11为长条形,上有凹槽,用来装载胚胎。凹槽采用圆弧形槽,凹槽深0.5mm,长20mm。冷冻条的后部12为实心圆柱体,直径1mm,长5mm。
载杆杆体2为圆柱体,直径2mm,长50mm,前部锥形逐渐变细,形成前端延伸部22后与冷冻条后部12相接。前端延伸部22长5mm。
如图4所示,载杆杆体2上设有滑槽21,滑槽21为圆弧底部,前部锥形闭合。
载杆杆体2与手柄部3的连接处设有环形凸台31。环形凸台31为四方柱体,边长4mm,边长等于外套管4的外径。
载杆杆体2后部锥形加粗形成后端延伸部23与环形凸台31连接,后端延伸部23的外表面以及与后端延伸部23外表面接触的外套管4的内表面均为粗糙面。后端延伸部23长0.6mm,最大外径等于外套管4的内径。
手柄部3为圆柱体,直径与载杆杆体2相等,长度20mm。手柄部3既为操作者手捏载体装置的部位,同时也可以是黏贴标签的部位,以便于进行标识辨认。
如图5所示,外套管4长度等于载杆杆体2的长度,外径4mm,内径2.4mm,前端固定有长5mm的金属环42。
如图5所示,外套管4内设有长5mm的舌部41,舌部41与滑槽21相配合。如图6所示,舌部41的下部为与滑槽21的底部相配合的圆弧面。舌部41前端也为锥形,与滑槽21前部以锥形缩小相配合。
单手操作的玻璃化冷冻载体装置的操作流程包括:
(1)准备胚胎冷冻液,包括平衡液ES和玻璃化液VS。
平衡液ES含7.5%乙二醇(ethyleneglycol,EG),7.5%二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),20%血清替代品(Synthesis Serum Subtituent,SSS)。
玻璃化液VS含15%乙二醇,15%二甲基亚砜,0.5mol/L蔗糖和20%SSS。
(2)准备胚胎解冻液,包括TS解冻液、DS解冻液和WS解冻液。
TS解冻液含1mol/L蔗糖和20%SSS。
DS解冻液含0.5mol/L蔗糖和20%SSS。
WS解冻液为含20%SSS的缓冲液。
(3)胚胎冷冻过程:室温操作环境,将胚胎移至平衡液ES,平衡10min,胚胎卵裂球从皱缩至完全恢复原形,转移至玻璃化液VS中,左手大拇指和食指捏住载体手柄部,右手用细管将胚胎在60s内转移至载体冷冻条前端,迅速把载体前端冷冻条***液氮,此时左手大拇指和食指仍然捏住载体手柄部,利用左手中指沿滑槽顺势往下滑动外套管,直至槽底,左手大拇指、食指和中指完全松开,载体完全浸入液氮保存。
(4)胚胎解冻过程:先确认标签,将载体手柄部露出液氮,左手捏住手柄部,右手拿镊子夹住外套管沿卡槽往上滑到顶端,迅速把装有胚胎的冷冻条***37℃的TS解冻液中,胚胎在TS解冻液中60s后,依次转移至室温的DS解冻液中平衡3min,室温WS解冻液中平衡10min,再移入胚胎培养液,放置37℃、6%CO2培养箱培养备用。
应用例
(1)统计比较冷冻操作时间。
用实施例1的单手操作的玻璃化冷冻载体装置和市售常规的Cryotop载体对小鼠胚胎进行玻璃化冷冻。实验组用实施例1的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,对照组用Cryotop载体。每组冷冻20根载体,每根载体冷冻两枚胚胎,所有操作均为同一技术人员完成。计时范围为从装载胚胎到投入液氮保存,对照组平均每根载体操作时间20.16s,实验组平均每根载体操作时间5.62s,约为对照组平均操作时间的1/4,说明本实施例1的单手操作的玻璃化冷冻载体装置有效节省了操作时间,提高了冷冻操作效率。
(2)统计比较冷冻效果。
实验组用实施例1的单手操作的玻璃化冷冻载体装置对215枚小鼠胚胎进行玻璃化冷冻,回收214枚,回收率99.5%;存活208枚,存活率96.7%。对照组用Cryotop载体冷冻,胚胎回收率99.5%(189/190),胚胎存活率97.9%(185/189)。两组相比差异不显著。
此外对解冻的胚胎进行囊胚培养,观察胚胎的发育潜能,目的是观察冷冻过程对胚胎是否有后续发育影响。实验组解冻后进行囊胚培养,获囊胚97枚囊胚,成囊胚率46.6%。对照组成囊胚率45.4%(84/185)。两组相比差异不显著。
上述结果显示,本实施例1的单手操作的玻璃化冷冻载体装置在胚胎回收率、存活率和成囊率方面与Cryotop载体无明显差异,但在冷冻操作时间和效率方面具有显著的优越性,这是因为在胚胎装上载体直接投入液氮后,只需一只手一步操作即可完成,大大缩短了操作时间,提高了技术人员的工作效率。
此外应理解,在阅读了本发明的上述描述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种单手操作的玻璃化冷冻载体装置,包括载杆和外套管,所述的载杆由前到后依次包括冷冻条、载杆杆体和手柄部,其特征在于,所述的载杆杆体上设有滑槽,所述的外套管套在载杆杆体上,外套管内设有与滑槽相配合的舌部。
2.根据权利要求1所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的滑槽的前部锥形闭合。
3.根据权利要求2所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的舌部前端与滑槽前部相配合。
4.根据权利要求3所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的滑槽为圆弧底部,所述的舌部的下部与滑槽的圆弧底部相配合。
5.根据权利要求1所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的外套管的长度不大于载杆杆体的长度。
6.根据权利要求1所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的外套管的前端固定有金属环。
7.根据权利要求1所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的载杆杆体与手柄部的连接处设有环形凸台。
8.根据权利要求7所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的环形凸台的宽度不小于外套管的外径。
9.根据权利要求7所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的载杆杆体后部锥形加粗形成后端延伸部与环形凸台连接。
10.根据权利要求9所述的单手操作的玻璃化冷冻载体装置,其特征在于,所述的后端延伸部的外表面以及与后端延伸部外表面接触的外套管的内表面均为粗糙面。
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