CN109422814A - 一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。具体地，本发明提供了一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，所述融合蛋白具有优化的式I所示结构：X₁‑X₂‑L₁‑X₃‑X₄‑X₅(I)，其中各元件如说明书所述。实验结果表明，本发明所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞(如LaA‑CAARNK92MI细胞)能靶向治疗La/SSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，并且具有疗效好、副作用小、生产成本低等诸多优点。

Description

一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其 应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用。

背景技术

自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，其最显著的特点是B细胞过度反应，产生高滴度的自身抗体和全身炎症反应，这些最终导致各种器官的病变。近期，人们越来越意识到B细胞在自身免疫性疾病的发生发展中起到越来越广泛的作用，这为B细胞靶向治疗自身免疫性疾病提供了令人振奋人心的前景。其中CD20靶向的B细胞耗竭实验表明，95％的天疱疮(PV)病人出现短期的疾病衰退，但是81％的病人复发并出现致命的感染。CD20靶向的B细胞耗竭之后，患者血清中自身抗体滴度明显降低，这预示着在天疱疮疾病中，短寿命的浆细胞是自身抗体的来源，并且靶向CD20阳性的记忆性B细胞前体间接性的杀死了分泌自身抗体的浆细胞。为了能够在治疗天疱疮的同时又不引发广泛的免疫抑制，抗Dsg3 B细胞受体作为胞外片段，与相应的信号区域融合，构建的anti-Dsg3 CAAR-T在天疱疮小鼠模型中取得了较好的实验结果。

然而，一些其它的自身免疫性疾病(如红斑狼疮)的病因非常复杂，并且自身免疫性疾病患者本身的免疫***是紊乱的，T细胞功能异常，Th细胞控制耐受，B细胞过度反应，自身免疫潜能细胞(PAL)大多处于未活化或者活性封闭状态。所以自体性嵌合体抗原受体(CAR)T细胞治疗困难重重，达不到理想的状态，而异体性CAR-T细胞移植存在移植物抗宿主反应的风险。

因此，本领域迫切需要探索靶向治疗自身免疫性疾病的新策略，能在治疗自身免疫疾病的同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，能靶向治疗自身免疫疾病，同时不引发广泛的免疫抑制、移植物抗宿主反应风险小、生产成本低。

本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白具有式I所述结构：

X₁-X₂-L₁-X₃-X₄-X₅ (I)，

其中，

X₁为无或信号肽序列；

X₂为LaA肽；

L₁为无或连接肽序列；

X₃为跨膜结构域；

X₄为共刺激元件；

X₅为胞浆信号传导序列CD3ζ；

“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

在另一优选例中，X₃为CD28的跨膜结构域。

在另一优选例中，X₄选自下组：共刺激元件4-1BB、共刺激元件CD28、或其组合。

在另一优选例中，X₃和X₄共同由含跨膜结构域的CD28和4-1BB构成。

在另一优选例中，L₁为Fc元件。

在另一优选例中，所述Fc元件为哺乳动物免疫球蛋白的Fc元件，优选为人的免疫球蛋白的Fc元件。

在另一优选例中，所述Fc元件为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc元件，优选地，Fc元件为IgG的Fc元件，更优选地，Fc元件为IgG1或IgG2的Fc元件。

在另一优选例中，所述Fc元件的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。

在另一优选例中，所述Fc元件具有如SEQ ID NO.:1中第130-359位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述Fc元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第130-359位所示。

在另一优选例中，所述多肽元件X₁选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件X₂选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件L₁选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件X₃选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件X₄选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件X₃和X₄共同由SEQ ID NO.:1中第360-469位所示的氨基酸序列构成。

在另一优选例中，所述多肽元件X₃和X₄共同具有与SEQ ID NO.:1中第360-469位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述多肽元件X₃和X₄共同为将SEQ ID NO.:1中第360-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽。

在另一优选例中，所述多肽元件X₅选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白为重组蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白能与LaA-BCR蛋白特异性结合。

在另一优选例中，所述融合蛋白能与抗La/SSB抗体特异性结合。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:1所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥80％)的多核苷酸；

(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第三方面，提供一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体以pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro质粒为骨架。

在另一优选例中，所述载体是病毒载体。

在另一优选例中，所述载体是慢病毒载体。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所述的融合蛋白；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。

在另一优选例中，所述的细胞为原核细胞或真核细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是人细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是NK细胞、T细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是NK92细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞是NK92MI细胞。

本发明的第五方面，提供一种基因工程化的NK细胞，所述NK细胞为哺乳动物的NK细胞，并且所述的NK细胞的细胞膜上表达有本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述NK细胞是离体。

在另一优选例中，所述NK细胞是自体或异体的。

在另一优选例中，所述NK细胞来自灵长目动物。

在另一优选例中，所述NK细胞是人细胞。

在另一优选例中，所述NK细胞是NK92细胞。

在另一优选例中，所述NK细胞是NK92MI细胞。

本发明的第六方面，提供一种药物组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述载体或本发明第五方面所述NK细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物组合物是液态制剂。

在另一优选例中，所述药物组合物是注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物中所述NK细胞的浓度为1×10⁵－1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁶－1×10⁷个细胞/ml。

本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述载体、或本发明第五方面所述的NK细胞的用途，用于制备治疗自身免疫疾病的药物或制剂。

在另一优选例中，所述自身免疫疾病为与La/SSB自体抗体阳性相关的自身免疫疾病。

在另一优选例中，所述自身免疫疾病选自下组：***性红斑狼疮、干燥综合征。

本发明的第七方面，提供一种制备本发明第五方面所述的NK细胞的方法，所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了LaA-BCR蛋白的纯化及其与LaA抗原的亲和力测定。其中，图1A为LaA-BCR-pfuse-hIgG1-FC真核表达载体；图1B为LaA-pET28a(+)原核表达载体；图1C为纯化后的LaA的SDS-PAGE电泳图；图1D为纯化后的LaA-BCR的SDS-PAGE电泳图；图1E为LaA-BCR与LaA蛋白亲和力的Western印迹分析；图1F为LaA-BCR对LaA肽的ELISA分析。

图2显示了LaA-CAAR NK92MI细胞的结构特点及其功能性验证。图2A为LaA-CAAR的结构示意图；图2B为LaA-CAAR慢病毒稳定转染NK92MI细胞后，western印迹检测LaA-CAAR在NK92MI细胞中的表达情况；图2C为流式细胞术检测LaA-CAAR在NK92MI细胞中的表达情况；图2D为稳定转染LaA-CAAR结构的NK92MI细胞的平均荧光强度分析。

图3显示了LaA-BCR-Jurkat、LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1细胞功能性验证。图3A为LaA-BCR的结构示意图；图3B为流式细胞术检测LaA-BCR分别在Jurkat、Romas及Maver-1细胞上的表达情况；图3C,D,E分别为稳定转染LaA-BCR结构的Jurkat、Romas及Maver-1细胞的平均荧光强度分析。

图4显示了流式细胞仪分析CD19和CD56在NK92MI、LaA-CAAR NK92MI、Romas、LaA-BCR-Romas、Maver-1、LaA-BCR-Maver-1及CD3和CD56在Jurkat、LaA-BCR-Jurkat细胞中的表达情况。

图5显示了LaA-CAAR-NK92MI细胞可以特异性消除LaA-BCR稳定表达的淋巴瘤细胞系。图5A,C显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92MI对Romas及LaA-BCR-Romas细胞的毒性作用；图5B,D显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92MI对Romas及LaA-BCR-Romas细胞的毒性作用；图5E,G显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92MI对Maver-1及LaA-BCR-Maver-1细胞的毒性作用；图5F,H显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92MI对Maver-1及LaA-BCR-Maver-1细胞的毒性作用。

图6显示了LaA-CAAR-NK92MI细胞可以特异性消除LaA-BCR稳定表达的T细胞急性淋巴细胞白血病细胞。图6A,C显示了在E:T＝1:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92 MI对Jurkat及LaA-BCR-Jurkat细胞的毒性作用；图6B,D显示了E:T＝2:1的时候NK92MI及LaA-CAAR NK92 MI对Jurkat及LaA-BCR-Jurkat细胞的毒性作用。

图7显示了NK92MI细胞对LaA-BCR-Jurkat、LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1细胞的增殖反应。图A,B显示了Jurkat、LaA-BCR-Jurkat细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖；图C,D显示了Romas、LaA-BCR-Romas细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖；图E,F显示了Maver-1、LaA-BCR-Maver-1细胞不能刺激NK92MI及LaA-CAAR-NK92MI细胞的增殖。

图8显示了流式细胞术检测了LaA-BCR在自身免疫性疾病病人血液B细胞中的表达情况。

图9显示了自身免疫性疾病病人样本全血B细胞缺失实验。图A显示了全血B细胞缺失实验流程；图B显示了NK92MI及LaA-CAAR NK92MI细胞对自身免疫性病人的T细胞没有杀伤作用；图C显示了NK92MI对自身免疫性病人的B细胞没有杀伤作用；图D显示了LaA-CAARNK92MI细胞对自身免疫性疾病病人的B细胞具有靶向杀伤作用。

图10显示了NK92MI及LaA-CAAR NK92MI细胞对正常健康人的T及B细胞没有杀伤作用。图A显示了流式细胞技术分析了健康人全血与NK92MI及LaA-CAAR NK92MI细胞共孵育24h后，检测T及B细胞的存活比率；图B显示了NK92MI及LaA-CAAR NK92MI细胞对正常的T细胞没有杀伤作用；图C显示了NK92MI及LaA-CAAR NK92MI细胞对正常的B细胞没有杀伤作用。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地获得一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的融合蛋白及表达该融合蛋白的NK细胞，所述融合蛋白具有优化的式I所示结构。实验结果表明，本发明所提供的经所述融合蛋白修饰的特定NK细胞(如LaA-CAARNK92MI细胞)能靶向治疗La/SSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，并且具有疗效好、副作用小、生产成本低等诸多优点。在此基础上完成了本发明。

在自身抗体La/SSB强阳性的自身免疫性疾病中，过度反应及致病性的记忆性B细胞表面表达抗La/SSB B细胞受体。因此，本发明将La/SSB作为嵌合体免疫受体的胞外区域，以NK细胞作为效应细胞，细胞毒性靶向于特异性表达抗La/SSB B细胞受体的B细胞(La/SSB-BCR-B)，而不会抑制整个机体的免疫***，避免了一系列的副反应，从而为靶向治疗La/SSB自身抗体强阳性的自身免疫疾病提供了强有力的手段。此靶向治疗策略在直接消除膜表面表达抗La/SSB B细胞受体的过度反应B细胞和记忆性B细胞的同时，也间接的消除了分泌致病性La/SSB自身抗体的短寿命的浆细胞。

在本发明中，针对抗LaA的B细胞特异性受体(LaA-BCR)为靶点，嵌合体抗原基因修饰的NK细胞靶向治疗La/SSB自身抗体阳性的自身免疫性疾病，将NK细胞与B细胞特异性受体结合起来，为探索靶向治疗自身免疫性疾病提供一个新的策略，为临床应用CAR-NK治疗自身免疫疾病提供了新的有效方法和制剂。

术语

La/SSB

La/SSB基因是一种管家基因，在细胞核内表达，在一些物理及化学因素的作用下，La/SSB抗原释放并被B细胞识别，从而产生高滴度的针对La/SSB自身抗原的抗体，这些抗体沉积在机体血管及器官各处，从而引起机体的损害。La/SSB自身抗原共分为三个免疫区域：LaA(1-107aa)，LaC(111-242aa)和LaL2/3(346-408aa)。针对保守翼型螺旋决定簇LaA的自身抗体具有重大的意义，它们几乎百分之百出现在沉淀素阳性的血清中，并且出现在抗La/SSB自身抗体的早期，在自身免疫疾病出现之前具有一定的诊断作用。另外，La/SSB自身抗原被激活后，其特异性的B细胞抗原表位只在过度反应的B细胞和记忆性B细胞上表达，从而避免了脱靶毒性的可能性。

LaA

LaA区域是La/SSB最主要的功能性区域。本发明将LaA抗原区域作为胞外片段，后面连接一系列的功能区域(FC，CD28，4-1BB及CD3ζ)，构建具有特异性识别致病B细胞的结构(CAAR)，最后将此结构构建在NK92MI细胞上，从而获得了具有靶向致病性B细胞(LaA-BCR-B细胞)的LaA-CAAR NK92MI效应细胞。

La/SSB抗体

针对La/SSB的自身抗体在一些自身免疫性疾病的血清中高滴度存在，尤其在***性红斑狼疮(SLE)和干燥综合征(SS)等病人的血清中，是SS诊断标记性抗体，La/SSB抗体阳性病人97％表现为干燥综合征。

研究表明，抗La/SSB抗体产生早于SLE症状的出现和诊断，同时也是SLE发病过程中的重要参与者。靶向消除抗La/SSB过度反应的B细胞和记忆性B细胞应该能够治疗及缓解La/SSB自身抗体强阳性的自身免疫性疾病的症状，同时也不存在机体被免疫抑制的风险。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡(减少)是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。而NK92细胞是目前唯一被FDA批准临床试验的细胞系，细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92-MI细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。在本发明中，选择NK细胞作为效应细胞。

NK92MI细胞

通过基因修饰的NK92MI(CAAR-NK92MI)细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。NK92MI细胞对各种各样的肿瘤都具有很强的细胞毒作用，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤及一些实体肿瘤。一些临床试验表明高剂量的NK92MI细胞输入也具有很大的安全性。

与自体CAR-T细胞相比，CAAR-NK92MI还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似，CAR-NK92或者CAR-NK92MI不会引起免疫耐受。

Fc片段

如本文所用，术语“Fc片段”、“Fc元件”具有相同的含义，没有特别的限制，是本发明融合蛋白的连接肽片段(或绞链域)。在本发明中，Fc片段可以是哺乳动物免疫球蛋白的Fc片段，优选为人的免疫球蛋白的Fc片段。在优选例中，Fc片段为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的Fc片段，优选地，Fc片段为IgG的Fc片段，更优选地，Fc片段为IgG1或IgG2的Fc片段。Fc片段的长度为200-250个氨基酸，较佳地220-240个氨基酸，更佳地约230个氨基酸。在本发明的优选例中，Fc片段具有如SEQ ID NO.:1中第130-359位所示的氨基酸序列。在另一优选例中，Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1中第130-359位所示。

融合蛋白

如本文所用，术语“LaA-CAAR”、“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、“活性多肽”和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第一方面所述的结构。本发明融合蛋白包括：前导序列、能够与LaA-BCR特异性结合的LaA肽、铰链域(Fc)、CD28跨膜结构域TM、两个共刺激结构域(CD28和4-1BB)和CD3ζ等一系列的信号区域，将此结构定义为LaA-CAAR。

本发明的所述融合蛋白具有以下特点：

a)本发明融合蛋白表达后，会穿过细胞膜并定位在细胞膜上，形成一个将LaA元件暴露在胞外的膜蛋白。此外，本发明融合蛋白还具有位于胞内的共刺激分子(或元件)和CD3ζ。此外，本发明融合蛋白还可含有任选的信号肽、连接肽元件(linker)、或其他元件。

b)本发明融合蛋白能够非常有效结合于自身免疫性疾病患者(如人)中B细胞(或其他细胞如T细胞)表面上的LaA-BCR或LaA-TCR蛋白。

c)本发明融合蛋白能够有效地中和、抑制和清除自身免疫性疾病患者中的抗La/SSB抗体。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPMAENGDNEKMAALEAKICHQIEYYFGDFNLPRDKFLKEQIKLDEGWVPLEIMIKFNRLNRLTTDFNVIVEALSKSKAELMEISEDKTKIRRSPSKPLPEVTDEYKNDESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID No.:1)。

其中，在SEQ ID No.:1中第1-22位为信号肽；第23－129位为LaA肽；第130－359位为连接肽(Fc)；第360－427位为跨膜结构域(CD28)；第428－469位为共刺激元件(4-1BB)；第470－581位为CD3ζ。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:1所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

在本发明较佳的实施方式中，所述多核苷酸的的序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

本发明的多肽的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

ATGCTGCTCCTGGTGACCTCCCTGCTGCTGTGTGAACTCCCCCACCCCGCTTTCCTGCTGATCCCCATGGCTGAAAATGGTGATAATGAAAAGATGGCTGCCCTGGAGGCCAAAATCTGTCATCAAATTGAGTATTATTTTGGCGACTTCAATTTGCCACGGGACAAGTTTCTAAAGGAACAGATAAAACTGGATGAAGGCTGGGTACCTTTGGAGATAATGATAAAATTCAACAGGTTGAACCGTCTAACAACAGACTTTAATGTAATTGTGGAAGCATTGAGCAAATCCAAGGCAGAACTCATGGAAATCAGTGAAGATAAAACTAAAATCAGAAGGTCTCCAAGCAAACCCCTACCTGAAGTGACTGATGAGTATAAAAATGATGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAGATGTTCTGGGTGCTGGTCGTGGTGGGTGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACAGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTGAGGAGCAAGCGGAGCAGAGGCGGCCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCCGGAGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCTCCCAGGGACTTCGCCGCCTACCGGAGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAGTTCAGCCGGAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCCGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCGGAGAAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGATGA(SEQ ID No.:2)。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

制备方法

本发明的融合蛋白(多肽)可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。本发明采用常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸来表达或生产本发明的融合蛋白。

本发明提供了一种制备LaA-CAAR NK细胞的方法，所述方法包括将本发明的多核苷酸或载体转导入NK细胞内，从而获得所述LaA-CAAR NK细胞。

一般来说有以下步骤：

(1).用编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞。

药物组合物和施用方法

本发明LaA-CAAR NK细胞可以靶向消除具有LaA特异性BCR的致病性B细胞(记忆性B细胞)，间接性的抑制了浆细胞分泌抗La/SSB自身抗体，从而实现治疗效果。

另一方面，本发明还提供了一种药物(包括疫苗)组合物，它含有(a)安全有效量的本发明LaA-CAAR NK细胞；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的LaA-CAAR NK细胞。

本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用于治疗自身免疫疾病。

“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

通常，药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个药片或一支注射针剂。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。

“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但不限于：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。

在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂或载体混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分一种或多种混合：

(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和/或(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。

胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物，较佳地为注射剂或液体制剂。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选20～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明药物组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明药物组合物也可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式和剂量保持不变，而同时或随后服用本发明药物组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用本发明药物组合物与其它一种或几种已知药物。当本发明药物组合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，本发明药物组合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药时的剂量较低。

本发明的主要优点

(1)本发明提供的LaA-CAAR NK92MI能够特异性的杀伤表达LaA-BCR的致病性B细胞(记忆性B细胞)，间接的杀死分泌抗LaA自身抗体的浆细胞，从而减轻自体抗体对机体的破坏，缓解自身免疫性疾病的症状，同时不引发广泛的免疫抑制，对正常的T细胞和B细胞没有明显的杀伤作用，不影响机体的正常免疫功能，无副反应。

(2)本发明提供的LaA-CAAR NK细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，生产成本低，没有移植物抗宿主反应的危险。

(3)本发明提供的LaA-CAAR NK细胞对LaA-BCR-Jurkat同样具有很强的细胞溶解作用，为将来进一步探索CAAR-NK细胞特异性杀伤自身反应性T细胞淋巴细胞提供了研究基础。

(4)La/SSB自身抗原被激活后，其特异性的B细胞抗原表位只在过度反应的B细胞和记忆性B细胞上表达，因此本发明提供的LaA-CAAR NK92MI在靶向治疗时，脱靶毒性的可能性低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用方法

1.细胞系及血液样本

人T细胞性急性淋巴母细胞白血病Jurkat细胞与人淋巴瘤细胞株Maver-1和Romas细胞应用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。HEK293T细胞应用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养。NK92MI是一株IL-2非依赖的自然杀伤细胞系，来源于通过稳定转染的方法把IL-2稳定表达在NK92细胞系。应用含有0.2mM的肌醇、0.1mM的β-巯基乙醇、0.02mM叶酸及12.5％马血清的MEM-α培养基培养。这些细胞系均来自于ATCC，培养基中添加100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，37度含有5％CO₂的培养箱中培养。

La/SSB自体抗体强阳性的病人及健康人血液样本在经过本人同意参与该研究之后采集，也通过了苏州大学伦理委员会的同意。

2.统计分析

统计分析由GraphPad Prism软件版本5.0来完成的。Paired-T检验用来比较组间差异，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

实施例1 LaA蛋白和LaA-BCR蛋白的纯化

1.1LaA蛋白的诱导及纯化

为了诱导可溶性LaA蛋白的表达，将编码LaA蛋白的cDNA亚克隆进入含有6×HIS的pET28a原核表达载体(LaA-pET28a)(图1B)，6×HIS标签用来进行蛋白的纯化。接着将LaA-pET28a质粒转化进入E.coli BL21(DE3)菌株中培养。

LaA蛋白按照以下步骤进行诱导和纯化：挑取LaA-pET28a单克隆在3ml含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中37℃培养过夜。然后按照1:100的比例稀释在含有100μg/mL卡那霉素新鲜的培养基中继续培养，在细菌早期对数期(OD＝0.6-0.8)时，加入0.5mMisopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG,Sangon Biotech)37℃诱导2.5-3小时。接着LaA蛋白按照试剂说明书经过Ni-NTA agarose(GE Healthcare Life Sciences)纯化。咪唑应用PBS4℃透析过夜去除。蛋白分子量及纯度应用sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)检测，蛋白浓度应用BCA检测试剂盒检测(Beyotime)。另外纯化了一个非LaA蛋白作为阴性对照。

LaA可溶性蛋白经His La/SSB标签纯化后，SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色显示在15kd左右出现单一的条带(图1C)。

1.2LaA-BCR蛋白的构建、表达、纯化及鉴定

合成基因LaA-BCR，将一个包含信号肽(SP)、LaA-BCR的重链(VH)可变区、G4S接头和LaA-BCR的轻链(VL)可变区的串联信号域，连接进入pfuse-hIgG1-Fc真核表达载体(购自Invivogen)，构建后命名为LaA-BCR-pfuse-hIgG1-Fc(图1A)。将LaA-BCR-pfuse-hIgG1-Fc载体按照质粒：脂质体＝1:2的比例转染HEK293T细胞。转染48h后收集转染的细胞上清。转染后收集的细胞上清，分别13000rpm，15分钟离心。细胞上清中加入10×乙酸钠溶液，加入10×乙酸钠按细胞上清：10×乙酸钠＝9：1的比例加入，调节PH至5.0。将上述加入乙酸钠的细胞上清按照试剂说明书应用Protein G纯化。纯化后的LaA-BCR蛋白通过应用FC抗体Western blot检测，蛋白浓度应用BCA检测试剂盒检测(Beyotime)。另外纯化了一个非LaA-BCR蛋白作为阴性对照。

LaA-BCR可溶性蛋白经蛋白G柱纯化浓缩后，SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色显示在55kd左右出现单一条带(图1D)。

实施例2 LaA-BCR蛋白与LaA抗原的亲和力测定

以纯化的加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(P0015L,Beyotime，中国上海)的LaA抗原及作为阴性对照的非LaA蛋白作为样本，经过12％SDS-PAGE分离，SDS-PAGE上的蛋白被转移到PDVF膜上(IPVH00010,Millipore,MA)，5％的脱脂牛奶室温封闭1小时(Guangming，中国上海)后，应用纯化的LaA-BCR蛋白4℃孵育过夜，接着应用含有0.1％的Tween-20的PBST清洗三次后，PVDF膜应用horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG(H+L)二抗(A10677,Life Technologies,CA)孵育。PBST清洗三次后，通过应用增强的化学发光试剂盒(WBKLS0500,Millipore Corporation,MA)使PDVF膜化学发光可视化。

纯化的LaA蛋白包被ELISA微孔板4℃过夜。此微孔板PBS清洗三次，一系列稀释的LaA-BCR蛋白及作为阴性对照的非LaA-BCR蛋白加入微孔板内，然后应用含有0.1％Tween-20的PBST清洗三次，horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG(H+L)二抗(A10677,Life Technologies,CA)孵育。最终，应用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB,WBKLS0500,Millipore Corporation,MA)显色。ELISA效价使用ELISA microplate reader(IVD10,Spectremax)在450nm测定。

结果分别如图1E和图1F所示，结果表明：LaA抗原与LaA-BCR蛋白亲和力很好，两者之间能够特异性结合，提示本发明的LaA-CAAR NK92MI能够细胞体外杀伤LaA-BCR阳性的肿瘤细胞株。

实施例3 LaA-CAAR NK92MI细胞的构建、特点及功能性验证

3.1LaA-CAAR的结构设计及慢病毒转染

LaA-CAAR的分子结构设计包括：一个CD8的穿膜信号肽导向LaA-CAAR在NK92MI细胞表面表达，LaA抗原片段作为细胞外片段，F_C连接片段，CD28分子(包含跨膜区)、4-1BB共刺激因子与CD3ζ信号区域连接形成融合蛋白(图2A)。LaA-CAAR融合蛋白包含：前导序列、LaA肽、铰链域(FC)、CD28跨膜结构域TM、两个共刺激结构域(CD28和4-1BB)和CD3ζ细胞内信号域。

基因合成SP-LaA-Fc-CD28/TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列，然后将其构建到pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro(System Biosciences)慢病毒表达载体。293T细胞铺板，包装质粒△R6.5μg、V-VSG3.5μg、Rev2.5μg及目的质粒10μg在CaCl₂的作用下，转染293T细胞；12小时后更换新鲜培养基；然后24h及48h各收集一次病毒；最后25000rpm超速离心浓缩病毒。NK92MI细胞计数(1×10⁶)与慢病毒上清液(MOI＝30)37度共孵育4-6小时后，病毒上清液被去除，在含有12.5％的马血清的MEM-α培养基中继续培养。

3.2检测LaA-CAAR在NK92MI细胞中的表达

慢病毒转染NK92MI细胞三天后，转染的NK92MI细胞应用FACSCalibur(BD)分析FC阳性的细胞比率，其中对照组为NK92MI加FC抗体，FC抗体没有非特异性染色。细胞使用PBS冲洗三次，应用PBS重悬后进行流式检测。LaA-CAAR阳性的NK92MI细胞通过流式细胞分选仪(BD)富集后，用1μg/ml的嘌呤霉素筛选，可使CAAR稳定表达在NK92MI细胞表面4-6个月。还通过Western印迹分析LaA-CAAR在NK92MI细胞的表达情况。裂解NK92MI和LaA-CAAR NK92MI细胞，在还原性与非还原性条件下经过SDS-PAGE分离，最后使用鼠单克隆抗体检测CD3ζ的表达。

结果如图2B-2D所示。从图2C中可以看出，流式检测LaA-CAAR在NK92MI细胞表面表达90％以上。如图2D所示，LaA-CAAR NK92MI的平均荧光强度是对照组NK92MI的200多倍。从图2B中可以看出，在还原性条件下，NK92MI(泳道1)和LaA-CAAR NK92(泳道2)细胞中都能检测到内源性CD3ζ的表达，大约16kDa。65kDa左右的条带仅出现在LaA-CAAR NK92MI细胞中(泳道2)。在非还原性的条件下，其它一系列的条带出现在LaA-CAAR NK92MI细胞中(泳道4)，在平行对照组NK92MI细胞中不出现(泳道3)，这些条带表明LaA-CAAR之间形成的同源二聚体和LaA-CAAR与内源性CD3ζ形成的异源二聚体。NK92MI和LaA-CAAR NK92MI细胞中都能检测到单体的和同源二聚体的CD3ζ。结果表明，LaA-CAAR能在构建的LaA-CAAR NK92MI细胞中稳定表达LaA-CAAR结构。

实施例4 LaA-BCR稳定肿瘤细胞株的构建

为体外模拟NK92MI细胞对致命性过度活化的B细胞的杀伤作用，本发明构建稳定膜表达LaA-BCR结构的肿瘤细胞株作为靶细胞。为了更有效的评估对致命性B细胞的杀伤效果，将LaA-BCR稳定膜表达在具有B细胞特性的B细胞来源的肿瘤细胞株(Rmoas和Maver-1)上。另外，同时也把LaA-BCR稳定膜表达在具有T细胞特征的T细胞来源的肿瘤细胞株(Jurkat)上，验证LaA-CAAR对T细胞来源的肿瘤细胞是否同样具有杀伤作用。LaA-BCR的结构包括：引导LaA-BCR稳定膜表达的信号肽，LaA-BCR重链可变区与轻链可变区，FC片段及穿膜片段(图3A)。LaA-BCR连接入PCDH-CMV-MCS-EF1慢病毒表达载体，病毒包装浓缩后稳定转染Romas、Maver-1及Jurkat肿瘤细胞，流式分选及嘌呤霉素加压筛选后，获得稳定膜表达的肿瘤细胞株(包括LaA-BCR-Romas、LaA-BCR-Maver-1及LaA-BCR-Jurkat)，并用FC流式抗体检测LaA-BCR在Romas、Maver-1及Jurkat肿瘤细胞上的表达。

从图3B中可以看出，LaA-BCR在Romas、Maver-1及Jurkat肿瘤细胞稳定表达率均在90％以上。LaA-BCR-Romas、LaA-BCR-Maver-1及LaA-BCR-Jurkat的平均荧光强度是对照组的100-600倍(图3C-E)。

实施例5 LaA-CAAR NK92MI对LaA-BCR阳性的肿瘤细胞具有很强的细胞毒性作用

5.1LaA-CAAR NK92MI及肿瘤细胞标记的选择

实施例3和实施例4中，构建的LaA-CAAR在NK92MI细胞上的表达90％以上，LaA-BCR在Romas、Maver-1及Jurkat上的表达也在90％以上。本实施例验证了CD56在NK92MI细胞表面表达90％以上，而在Romas、Maver-1及Jurkat上不表达；CD19及CD3分别在Romas、Maver-1及Jurkat细胞表面表达90％以上，而在NK92MI细胞上不表达，其中对照组是没有抗体染色的细胞(图4)。

因此，选择CD56作为NK92MI细胞的标记，CD19作为Romas与Maver-1细胞的标记，CD3作为Jurkat细胞的标记。

5.2LaA-CAAR NK92MI对LaA-BCR阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用

为评估LaA-CAAR NK92MI对LaA-BCR阳性的肿瘤细胞的细胞毒性作用，将肿瘤细胞与LaA-CAAR NK92MI共培养。将LaA-BCR阳性的肿瘤细胞与NK92MI细胞共培养6个小时后，应用CD56、CD3及CD19流式抗体孵育30min-1hr后，CD3抗体检测Jurkat细胞的生存率，CD19抗体检测Romas及Maver-1细胞的生存率，从而间接的算出肿瘤细胞的死亡率。

结果表明，效靶比E:T＝1：1时，LaA-CAAR NK92MI细胞与B细胞来源的肿瘤细胞LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1共培养6个小时后，LaA-CAAR NK92MI杀死大约60％的LaA-BCR-Romas细胞(图5A,C)；杀死LaA-BCR-Maver-1细胞比率约为70％(图5E,F)。当提高效靶比E:T＝2:1时，LaA-CAAR NK92MI杀死LaA-BCR-Romas与LaA-BCR-Maver-1细胞的比率接近90％(图5B,D与图5G,H)，表现出更强的细胞毒效应。将LaA-CAAR NK92MI细胞与T细胞来源的肿瘤细胞LaA-BCR-Jurkat共培养6-8h后检测，E:T＝1：1时，LaA-CAAR NK92MI杀死大约70％的肿瘤细胞(图6A,C)；E:T＝2：1时，杀死大约80％的细胞(图6B,D)。可以看出LaA-CAAR NK92MI对LaA-BCR表达的肿瘤细胞具有较强的细胞毒效应，并且细胞毒效应随着效靶比的增高更加显著。

5.2LaA-CAAR NK92MI细胞的增殖

此外，当NK92MI、LaA-CAAR NK92MI与肿瘤细胞共培养时，同时检测了NK92MI与LaA-CAAR NK92MI细胞的增殖情况。将1×10⁶的NK92MI细胞及LaA-CAAR NK92MI细胞种植在六孔板中(Costar)。NK92MI及LaA-CAAR NK92MI应用CFSE染色，Jurakt、LaA-BCR-Jurkat、Maver-1、LaA-BCR-Maver-1、Romas及LaA-BCR-Romas以E:T＝2：1的比例与NK92MI和LaA-CAAR-NK92MI细胞共培养。四天后应用流式技术检测NK92MI及LaA-CAAR NK92MI的相对增殖水平(平均荧光强度MFI)。

从图7中可以看出，体外肿瘤细胞系并不能刺激NK92及LaA-CAAR NK92MI细胞的增殖。这表明LaA-CAAR NK92MI细胞具有良好的安全性，为以后临床试验提供了有力的安全性依据。

实施例6 LaA-CAAR NK92MI特异性靶向及杀伤原发LaA抗体强阳性的自身免疫病患者B细胞

本实施例采用自体全血B细胞缺失测定方法体外检测LaA-CAAR NK92MI对自身免疫性疾病患者全血B细胞的缺失情况，从而评估LaA-CAAR NK92MI对表达LaA-BCR的B细胞杀伤效果。收集三例自体抗体La/SSB强阳性的自身免疫性疾病患者的血液样本，使用LaA-HIS抗原，检测自身免疫性疾病病人血液中LaA-BCR阳性的B细胞的比例，分别为11.5％，14％及13.4％(图8)。

NK92MI与LaA-CAAR NK92MI应用CFSE染色标记后，与200ul抗La/SSB自体抗体强阳性病人的新鲜血液在含有5％的CO₂ 37℃的培养箱中共培养24小时后，应用CD3、CD45、及CD19抗体孵育30min，BD红细胞裂解液裂解红细胞。收集1×10⁴个淋巴细胞(CFSE-/CD45+)，数据应用流式分析软件FlowJo进行分析。

由于LaA-CAAR-NK92MI引发的B细胞缺失的百分率被定义为细胞毒性指数(CTI)，用以下公式计算：

LaA-CAAR-NK92MI的CTI＝[(100/在没有LaA-CAAR-NK92MI细胞的样品中B细胞:T细胞比)×(在有LaA-CAAR-NK92MI细胞的样品中B细胞:T细胞比)]。

没有加入NK92MI和LaA-BCR-NK92MI样本的为对照组，对照组的B细胞缺失百分率设置为0。

结果表明，与NK92MI实验组相比，LaA-CAAR NK92MI实验组大约引起25％左右的B细胞缺失(图9A,D)，这表明LaA-CAAR NK92MI能够特异性的杀伤表达LaA-BCR的记忆性B细胞，间接的杀死分泌抗La/SSB自身抗体的浆细胞，从而减轻自体抗体对机体的破坏，缓解自身免疫性疾病的症状。

NK92MI与LaA-CAAR NK92MI对病人血液中的正常的T细胞没有杀伤作用(图9B)；与对照组相比，NK92MI对病人血液中的正常的B细胞也没有明显的杀伤作用(图9C)。

另外同时也收集了3例健康病人的血液样本，实验方法同上。结果表明NK92MI与LaA-CAAR NK92MI对健康病人正常的T及B细胞没有杀伤作用(图10)。

讨论

近年来，CAR治疗已经成为一种极具希望的治疗各种血液恶性肿瘤的手段。迄今为止，使用CD19CAR治疗各种B细胞来源的恶性肿瘤取得了很大的进展，已经通过临床试验的验证且疗效显著。然而，自身免疫性疾病是一种复杂难治的由于机体识别自身抗原分泌高滴度的自体抗体从而破坏机体的疾病，目前没有很好的治疗标准，缺乏有效的治疗方案。很少有CAR应用于治疗自身免疫疾病的尝试。

目前，人们对于自身免疫性疾病的治疗越来越关注到B细胞的功能上。其中最具有代表性的就是CD20单克隆抗体(Rituximad)靶向B细胞缺失实验，在***性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)及寻常型天疱疮(PV)中均取得了一定的疗效，但是CD20单克隆在杀伤病变B细胞的同时，也损伤了机体固有的免疫***，出现了一系列的副反应，例如致命的感染等等。

文章报道，应用CAR-T技术治疗寻常型天疱疮，在体外及寻常型天疱疮小鼠模型中均取得了一定的效果。但是，在自身免疫性疾病中，机体整体的免疫***是紊乱的，T、B细胞功能异常。研究表明，在SLE中Th辅助细胞(CD4+)数目增加、Treg细胞数目下降及具有分化为浆细胞能力的记忆性B细胞数目增加。另外，发挥细胞毒作用的CD8+的数目及活性都是随着滤泡辅助性T细胞(TFH)的增加而下降。因此，应用自体CAR-T细胞去治疗自身免疫性疾病，不是一个理想的选择，而异体CAR-T细胞治疗不能避免移植物抗宿主反应(GvDH)。

在自身抗体介导的自身免疫性疾病中，根据B细胞受体(BCR)的特异性，自身抗原为基础的嵌合体免疫受体能够直接导向NK92MI细胞杀伤过度反应的B细胞。本发明重新编辑了NK92MI细胞，使其表达一个抗嵌合体抗体修饰的结构(CAAR)，此结构包括自身免疫性疾病自身抗原La/SSB及CD28-4-1BB-CD3ζ信号结构域。La/SSB嵌合体抗原修饰的NK92MI(La/SSB-CAAR NK92MI)细胞能够特异性有效的杀伤特异性表达抗La/SSB B细胞受体(La/SSB-BCR)的B细胞来源的肿瘤细胞(LaA-BCR-Romas，LaA-BCR-Maver-1)及T细胞来源的肿瘤细胞(LaA-BCR-Jurkat)。此外，La/SSB嵌合体抗原修饰的NK92细胞(La/SSB-CAAR NK92MI)也能够引起La/SSB自身抗体强阳性的自身免疫性疾病患者血液样本中B细胞的缺失，此现象说明La/SSB嵌合体抗原修饰的NK92细胞(La/SSB-CAAR NK92MI)能够直接杀伤表达抗La/SSB BCR过度反应的B细胞(La/SSB-BCR-B)，并间接杀伤分泌La/SSB自身抗体的浆细胞。

CAAR治疗能够发挥最大的细胞溶解作用，其中最重要的因素之一就是抗原和抗体的特异性结合及其功能性验证。本发明首先验证了LaA抗原能够与LaA-BCR序列特异性结合并具有较好的亲和力。之后验证了LaA-CAAR NK92MI细胞对LaA-BCR-Romas及LaA-BCR-Maver-1肿瘤细胞具有很强的细胞溶解作用(E:T＝2:1)。自身免疫性疾病的免疫损伤机制除了自身抗体引起的自身免疫性疾病之外，还包括自身反应性T淋巴细胞介导的自身免疫病，例如(胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)。因此，本发明还选择了T细胞来源的肿瘤细胞株LaA-BCR-Jurkat作为靶细胞，结果表明，LaA-CAAR NK92MI细胞对LaA-BCR-Jurkat同样具有很强的细胞溶解作用。这为将来进一步探索CAAR NK92MI特异性杀伤自身反应性T细胞淋巴细胞提供了研究基础。本发明收集了La/SSB自体抗体强阳性的***性红斑狼疮或者干燥综合征患者的血液，首先检测LaA-BCR在B细胞中的表达情况，然后与LaA-CAAR NK92MI共培养过夜，结果发现LaA-CAAR NK92MI对LaA-BCR-B细胞具有很强的细胞溶解作用，而对正常功能的T及B细胞没有杀伤作用。

总的来说，LaA-CAAR NK92MI效应细胞只靶向消除具有LaA特异性BCR的致病性B细胞(记忆性B细胞)，间接性的抑制了浆细胞分泌抗La/SSB自身抗体。自身免疫性疾病的发病机制尚不清楚，机体内自体抗体种类繁多。本文探索了一种新的临床应用可行性高的靶向治疗策略，同时为联合各种CAAR靶向治疗多种抗体引起的自身免疫性疾病提供了重要的研究基础。因此，CAAR NK细胞治疗是一种创新性的靶向治疗方法，避免了机体被免疫抑制的风险。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司

<120> 一种抗La/SSB嵌合体抗原修饰的NK细胞、其制备方法及其应用

<130> P2017-1227

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Ala Glu Asn Gly Asp Asn Glu Lys Met

20 25 30

Ala Ala Leu Glu Ala Lys Ile Cys His Gln Ile Glu Tyr Tyr Phe Gly

35 40 45

Asp Phe Asn Leu Pro Arg Asp Lys Phe Leu Lys Glu Gln Ile Lys Leu

50 55 60

Asp Glu Gly Trp Val Pro Leu Glu Ile Met Ile Lys Phe Asn Arg Leu

65 70 75 80

Asn Arg Leu Thr Thr Asp Phe Asn Val Ile Val Glu Ala Leu Ser Lys

85 90 95

Ser Lys Ala Glu Leu Met Glu Ile Ser Glu Asp Lys Thr Lys Ile Arg

100 105 110

Arg Ser Pro Ser Lys Pro Leu Pro Glu Val Thr Asp Glu Tyr Lys Asn

115 120 125

Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

130 135 140

Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

145 150 155 160

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

165 170 175

Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

180 185 190

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

195 200 205

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

210 215 220

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

225 230 235 240

Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

245 250 255

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn

260 265 270

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

275 280 285

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

290 295 300

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

305 310 315 320

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys

325 330 335

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

340 345 350

Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

355 360 365

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

370 375 380

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn

385 390 395 400

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

405 410 415

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys

420 425 430

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

435 440 445

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

450 455 460

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

465 470 475 480

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

485 490 495

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

500 505 510

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

515 520 525

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

530 535 540

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

545 550 555 560

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

565 570 575

Ala Leu Pro Pro Arg

580

<210> 2

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atgctgctcc tggtgacctc cctgctgctg tgtgaactcc cccaccccgc tttcctgctg 60

atccccatgg ctgaaaatgg tgataatgaa aagatggctg ccctggaggc caaaatctgt 120

catcaaattg agtattattt tggcgacttc aatttgccac gggacaagtt tctaaaggaa 180

cagataaaac tggatgaagg ctgggtacct ttggagataa tgataaaatt caacaggttg 240

aaccgtctaa caacagactt taatgtaatt gtggaagcat tgagcaaatc caaggcagaa 300

ctcatggaaa tcagtgaaga taaaactaaa atcagaaggt ctccaagcaa acccctacct 360

gaagtgactg atgagtataa aaatgatgag agcaagtacg gccctccctg ccccccttgc 420

cctgcccccg agttcctggg cggacccagc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 480

accctgatga tcagccggac ccccgaggtg acctgtgtgg tggtggacgt gtcccaggag 540

gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 600

aagccccggg aggagcagtt caatagcacc taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 660

caccaggact ggctgaacgg caaggaatac aagtgtaagg tgtccaacaa gggcctgccc 720

agcagcatcg agaaaaccat cagcaaggcc aagggccagc ctcgggagcc ccaggtgtac 780

accctgcccc ctagccaaga ggagatgacc aagaatcagg tgtccctgac ctgcctggtg 840

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac 900

aactacaaga ccaccccccc tgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg 960

ctgaccgtgg acaagagccg gtggcaggag ggcaacgtct ttagctgctc cgtgatgcac 1020

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgtccc tgagcctggg caagatgttc 1080

tgggtgctgg tcgtggtggg tggcgtgctg gcctgctaca gcctgctggt gacagtggcc 1140

ttcatcatct tttgggtgag gagcaagcgg agcagaggcg gccacagcga ctacatgaac 1200

atgacccccc ggaggcctgg ccccacccgg aagcactacc agccctacgc ccctcccagg 1260

gacttcgccg cctaccggag caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 1320

ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 1380

gaagaagaag aaggaggatg tgaactgcgg gtgaagttca gccggagcgc cgacgcccct 1440

gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggccg gagggaggag 1500

tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa gccccggaga 1560

aagaaccctc aggagggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac 1620

agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg cctgtaccag 1680

ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc 1740

agatga 1746

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有式I所述结构：

X₁-X₂-L₁-X₃-X₄-X₅ (I)，

其中，

X₁为无或信号肽序列；

X₂为LaA肽；

L₁为无或连接肽序列；

X₃为跨膜结构域；

X₄为共刺激元件；

X₅为胞浆信号传导序列CD3ζ；

“-”表示连接上述各元件的连接肽或肽键。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述多肽元件X₁选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第1-22位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述多肽元件X₂选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第23-129位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述多肽元件L₁选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第130-359位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述多肽元件X₃选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第360-427位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述多肽元件X₄选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第428-469位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述多肽元件X₅选自下组：

(A)具有SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；更优选地≥98％的同源性；最优地≥99％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO.:1中第470-581位所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白；和/或

所述宿主细胞基因组中整合有外源的权利要求4所述的多核苷酸；和/或

所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体。

7.一种基因工程化的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞为哺乳动物的NK细胞，并且所述的NK细胞的细胞膜上表达有权利要求1所述的融合蛋白。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述载体或权利要求7所述NK细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

9.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述载体、或权利要求7所述的NK细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗自身免疫疾病的药物或制剂。

10.一种制备权利要求7所述的NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。