CN109418396A - 人工脂滴及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人工脂滴及其应用。该人工脂滴包括芯体，乳化剂层，其中乳化剂层形成在芯体的外表面，乳化剂层中含有磷脂。该人工脂滴以及包含人工脂滴的乳制品具有好的营养特性和高的生物利用率，消化效果好。

Description

人工脂滴及其应用

技术领域

本发明涉及食品领域，具体地，本发明涉及人工脂滴及其应用，更具体地，本发明涉及人工脂滴、乳制品及其制备方法。

背景技术

婴幼儿的健康关系到一个民族、一个国家的未来。由于婴幼儿正处于一生中生长和智力发育最为迅速的时期，关键营养素的缺乏与不足将造成终生无法挽回的伤害，因此这一阶段的食物摄入尤其重要。众所周知，母乳被誉为“白色血液”，其中所含的各种营养素，如蛋白质，脂肪，碳水化合物，矿物质，维生素等含量适中，比例恰当，无疑是婴儿最理想的天然食品。尽管如此，由于职业、疾病等原因，当前的母乳喂养情况仍不乐观。庞大的婴幼儿消费群体更是孕育了我国巨大的婴幼儿奶粉市场。

母乳是婴幼儿配方乳粉设计的金标准，然而，婴幼儿配方乳粉的具体配方的设计仍需进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

天然乳脂肪球膜上的磷脂对婴幼儿的早期神经发育及脂代谢发挥着重要作用。婴幼儿配方奶粉中的脂滴是人工构造的乳化微粒，和天然乳脂肪球相比粒径缩小了10倍，且界面组分由酪蛋白替换了原有的磷脂层，这些结构方面的差异对消化效果的影响尚不明确。基于上述问题的发现，发明人通过以乳源磷脂和酪蛋白酸钠作为乳化剂，构建出不同粒径及界面组分的脂滴，进而分析脂滴结构对消化的影响。发明人惊喜地发现，小粒径脂滴或磷脂脂滴在幼儿消化道中的消化效果显著优于大粒径脂滴或酪蛋白酸钠脂滴。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种人工脂滴，根据本发明的实施例，所述人工脂滴包括：芯体，乳化剂层，所述乳化剂层形成在所述芯体的外表面，所述乳化剂层中含有磷脂。根据本发明的实施例的人工脂滴，水解速度快，消化效果好。

根据本发明的实施例，上述人工脂滴还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳化剂层是由酪乳粉形成的。发明人发现，酪乳粉中含有较多磷脂组分，能够作为重新构造脂滴壁材的原料。

根据本发明的实施例，所述磷脂包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的至少之一。

根据本发明的实施例，所述人工脂滴的直径为100纳米～1微米。发明人发现，人工脂滴的直径在100纳米～1微米范围内，其消化效果更好。

根据本发明的实施例，所述芯体是由1，3-二油酸2-棕榈酸形成的。发明人发现，1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯结构油脂与天然母乳脂肪中的脂肪酸结构更为相似，能够显著减少婴儿便秘的发生率。

根据本发明的实施例，所述乳化剂层的厚度为10-50nm。

根据本发明的实施例，基于所述人工脂滴的总重量，所述磷脂的含量为3％～5％。发明人发现，磷脂含量在该范围内时能够形成较为完整的脂滴结构。

根据本发明的实施例，基于所述人工脂滴的总重量，所述磷脂的含量为4％。发明人发现，磷脂含量为4％时能够形成更为完整的脂滴结构。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种乳制品。根据本发明的实施例，所述乳制品含有前面所述的人工脂滴。根据本发明实施例的乳制品，具有较好的消化效果。

根据本发明的实施例，上述乳制品还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述乳制品为婴幼儿配方奶粉。根据本发明的实施例，当婴幼儿配方奶粉中含有上述人工脂滴时，所述婴幼儿配方奶粉更易消化、具有更好的营养特性和更高的生物利用率。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种形成前面所述的乳制品的方法。根据本发明的实施例，包括：将磷脂与植物油进行混合、剪切预乳化和二级均质处理，以便获得所述乳制品，所述乳制品含有前面所述的人工脂滴。利用根据本发明实施例的方法制备的乳制品，具有好的消化效果。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述磷脂包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的至少之一。

根据本发明的再一具体实施例，所述植物油为1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯。如前所述，1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯结构油脂与天然母乳脂肪中的脂肪酸结构更为相似，能够显著减少婴儿便秘的发生率。

附图说明

图1是根据本发明实施例的成人及早产婴儿在摄食后180min内的胃内pH变化图；

图2是根据本发明实施例的利用HPLC-ELSD得到的三种不同磷脂标准曲线图，其中PE、PC和SM分别表示磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂；

图3是根据本发明实施例的酪乳粉原料(A)及所提取总脂质(B)中三种磷脂的HPLC-ELSD分析色谱图；

图4是根据本发明实施例的不同乳化剂在油水界面间的界面张力变化图；

图5是根据本发明实施例的不同压力下均质四次得到的小脂滴粒径分布结果图；

图6是根据本发明实施例的不同压力下均质六次得到的小脂滴粒径分布结果图；

图7是根据本发明实施例的不同浓度酪蛋白酸钠溶液均质得到的脂滴粒径图；

图8是根据本发明实施例的不同浓度磷脂溶液均质得到的脂滴粒径图；

图9是根据本发明实施例的不同浓度酪蛋白酸钠乳液的表面浮油情况图，其中由左至右浓度依次为A：0.1％、B：0.5％、C：1.0％；

图10是根据本发明实施例的不同浓度磷脂乳液的表面浮油情况图，其中，由左至右浓度依次为A：2％、B：4％、C：6％；

图11是根据本发明实施例的不同类型乳化剂包埋的脂滴荧光显微镜结果图，其中，A为CN-L组脂滴，绿色表示固绿染蛋白；B为PL-L组脂滴，红色表示丽丝胺罗丹明染磷脂；

图12是根据本发明实施例的蛋白组大小脂滴的脂质TLC分析结果图，其中，A、B分别代表CN-L、CN-S组；

图13是根据本发明实施例的磷脂组大小脂滴的脂质TLC分析结果图，其中，A、B分别代表PL-L、PL-S组脂滴；

图14是根据本发明实施例的CN-L组SDS-PAGE电泳结果图，其中，条带1-8分别表示胃0、30、60、90、120min及肠5、60、120min；

图15是根据本发明实施例的不同脂滴在胃、肠消化过程中的粒径变化图，其中，A、B、C、D分别表示CN-L、CN-S、PL-L、PL-S组；

图16是根据本发明实施例的不同界面组分脂滴在消化过程中的微观结构变化图；

图17是根据本发明实施例的各组脂滴在胃内消化过程中的zeta电位变化图，其中，Mean±SD，n＝3，同一时间标注不同字母a-d表示具有显著性差异，P<0.05；

图18是根据本发明实施例的各组脂滴在肠内消化过程中的zeta电位变化图，其中，Mean±SD，n＝3，同一时间标注不同字母a-c表示具有显著性差异，P<0.05；

图19是根据本发明实施例的不同大小的酪蛋白包被脂肪球在消化过程中的脂肪酸释放模式图，其中，A、B分别表示CN-L、CN-S组；以及

图20是根据本发明实施例的不同大小的磷脂包被脂滴在消化过程中的脂肪酸释放模式图，其中，A、B分别表示PL-L、PL-S组；

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

其中，缩写“MFG”含义是Milk fat globule，中文释义为乳脂肪球；缩写“MFGM”含义是Milk fat globule membrane，中文释义为乳脂肪球膜；缩写“HM”含义是Human milk，中文释义为人乳；缩写“PE”含义是Phosphatidyl ethanolamine，中文释义为磷脂酰乙醇胺；缩写“PC”含义是Phosphatidylcholine，中文释义为磷脂酰乙醇胺；缩写“SM”的含义是Sphingomyelin，中文释义为经鞘磷脂；缩写“CN-L”的含义是Casein sodium–large，中文释义为酪蛋白酸钠-大粒径组；缩写“CN-S”的含义是Casein sodium–small，中文释义为酪蛋白酸钠-大粒径组；缩写“TLC”的含义是Thin layer chromatography，中文释义为薄层色谱法；缩写“TAG”的含义是Triglyceride，中文释义为甘油三酯；缩写“FFA”的含义是Freefatty acid，中文释义为游离脂肪酸；缩写“DAG”的含义是Diacylglycerol，中文释义为甘油二脂。

术语“天然乳脂肪球”是在动物乳腺分泌细胞内形成的。粗面内质网合成甘油三酯后，脂肪球先以乳脂微粒的形式在细胞质内积累。这时的胞内微粒表面覆有一层内质网赋予的，由磷脂、鞘磷脂、胆固醇和蛋白质组成的弥散状单层薄膜。乳脂微粒在迁移至细胞顶膜的过程中相互融合，体积增大，形成大小不同的脂质滴，并通过细胞质被转运到细胞顶端。术语“天然乳脂肪球膜是”在上皮细胞的分泌过程中，脂肪球不断被顶端质膜包裹，形成脂质滴表面的10～20nm厚的三层有序膜结构的外脂双层膜。其在乳体系中起着乳化作用，能够保护脂肪球不发生聚合或被脂肪酶水解。

术语“天然脂肪球膜”是指由蛋白质、磷脂、神经鞘脂、糖蛋白共同组成的复杂体系。

术语“均质”作为一种广泛应用在乳制品生产的加工方法，对脂肪球具有着重要影响。乳品均质的主要目的是减小脂肪球的粒径，以防止脂肪上浮。其工作原理是利用乳液在高压条件下流经均质阀中的微小狭缝时所产生强烈的湍流和剪切效应，使乳液中的脂肪球破碎，形成粒径更小的脂滴。

术语“磷脂”也称极性脂质，是含磷酸根脂质的总称，作为细胞膜的主要组成物质，对于生物代谢具有重要意义。磷脂本身是一种混合物，包含一个极性的磷酸头部和一个或两个非极性脂肪酰基尾部基团，按化学结构可分为两大类，一种是甘油磷脂，一种是神经鞘磷脂。其中，甘油磷脂以甘油为基本骨架，连接磷酸、脂肪酸组成的衍生物。

术语“酪乳粉”是在黄油的制作过程中，搅拌稀奶油产生黄油的同时会产生一种水状液副产物，通常称为酪乳，再经喷雾干燥而得到。

以下实施例中所用的实验材料与方法如下所述：

1乳脂肪球膜脂质提取及磷脂含量测定

1.1材料与方法

1.1.1材料与设备

1.1.1.1主要设备

表1为本章提取及检测所使用到主要仪器设备。

表1：实验主要仪器与设备

1.1.1.2主要原料

酪乳粉(食品加工用)购自恒天然商贸(上海)有限公司，其蛋白质含量、脂肪含量、乳糖含量分别为28.4％，7.5％和45.2％。婴幼儿配方奶粉专用油脂，购自领先油脂公司，其中1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯含量为22.2％，脂肪酸构成为C12:0(12.2％)、C14:0(4.3％)、C16:0(18.5％)、C18:0(3.3％)、C18:1(37.8％)、C18:2(19.8％)、C18:3(1.9％)。

1.1.1.3主要试剂

表2：实验主要试剂

1.1.2酪乳粉中总脂质的提取

酪乳粉中总脂质的提取方法根据Thi Thanh Que Phan等人的方法进行改进，采用二氯甲烷/甲醇作为主要萃取溶剂组合。具体方法如下：

将酪乳粉以10％(w/w)的浓度，常温下搅拌1h充分溶解，之后在超速离心机中以10000g的转速，20度下超速离心1h，获得“脂肪-乳清-酪蛋白凝胶”上中下三层，弃去下层酪蛋白沉淀，取用脂肪和乳清两层，以10倍体积的二氯甲烷：甲醇(2:1)作为萃取剂，先加甲醇并在4度低温搅拌30min，充分解离出蛋白，再加二氯甲烷，低温搅拌30min后全部倒入分液漏斗，充分震荡萃取脂质，静置分层2h，倒出下层较重的二氯甲烷相，剩余物加入等量二氯甲烷：甲醇(20:1)以及10mL的0.58％(w/w)氯化钠溶液进行洗涤，充分震荡，静置分层2h，倒出下层二氯甲烷相，与第一次的合并后，36℃旋蒸去除溶剂，最后氮吹至恒重，得到酪乳粉总脂质。

1.1.3不同提取剂组合提脂率的计算

记录不同提取剂组合萃取得到的总脂质重量，以及相应所用的原料酪乳粉重量，根据以下公式计算得到提脂率，式中W单位为克(g)：

提脂率(％)＝W(总脂)/W(酪乳粉)×100％

1.1.4磷脂总量的测定

磷脂总量采用磷脂检测试剂盒进行测定。具体操作方法如下：

标准曲线绘制：

a.配制标准工作液：取24微升的2mM磷脂原液，加入216微升超纯水，得到200uM的标准工作溶液。

b.配制标准曲线溶液：分别取该工作液0、30、60、100微升加入100、70、40、0微升的超纯水，得到浓度依次为0、60、120、200微摩尔/升的标准溶液。

测定步骤：

a.取每个浓度的标准曲线溶液，以及用Assay buffer稀释50倍的总脂质溶液，各转移20微升到96孔板中，三次平行。

b.制备Reacting mix，分别取80微升的Assay buffer以及Enzyme mix、PLDenzyme、Dye reagent各1微升，充分混合，平衡到室温待用。

c.向96孔板中的每孔加入20微升的标准溶液或样品稀释液，以及80微升的Reacting mix，水平震荡，室温下避光孵育30min后立即测定570nm下的吸光值。样品吸光值需扣除空白后使用。

1.1.5磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂的测定

所得总脂质中的三种主要磷脂组分的测定采用正相高效液相色谱(NP-HPLC)连蒸发光检测器(ELSD)进行，根据Avalli等人的方法进行改进。准确称取0.2g总脂样品以10mL氯仿充分溶解后，吸取500微升加入内标物质，定容至10mL，经过0.45微米的过滤器过滤后，转移至HPLC小瓶中，用正相HPLC-ELSD对磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)及神经鞘磷脂(SM)的含量进行分析，其种类和含量根据标品的保留时间和标准曲线进行计算，标品及样品进样量均为50微升，所有样品重复3次。所用色谱柱为Kromasil硅胶柱(100-5，250*4.6mm；1mL/min，45℃)，蒸发光检测器温度为65℃(3.5bar，gain 6)。流动相A为三氯甲烷/甲醇/氨水(80：19.5：0.5，v/v/v)，流动相B为三氯甲烷/甲醇/氨水(60：34.5：0.5，v/v/v)，磷脂的洗脱程序如表3所示：

表3：脂肪球膜磷脂成分梯度洗脱程序

1.1.6界面张力测定

乳化剂溶液与油相间的界面张力采用K100全自动表界面张力仪，以白金板法(Wilhelmy plate method)进行测定。该方法常用于测量两种液体间的界面张力(IFT)。板长19.9mm，宽10mm，厚度为0.2mm，固定在表面张力仪的力传感器上，用以测定IFT数值并记其随时间的变化，以及到达平衡时的结束值。

具体操作方法为，配置15mL乳化剂溶液，置于样品池内，Wilhelmy平板随后以15mm/min的速度缓慢浸没到液面下3mm深处，之后取50mL油相，小心注入样品池并覆盖在乳化剂之上，以形成油水界面，加油过程中避免产生气泡。室温(25℃)下运行程序2000秒，直至界面张力达到平衡后程序终止。

1.1.7数据处理及统计分析

所有实验进行三次重复实验，实验数据以Means±SD表示，运用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析采用Duncan方法比较显著性差异。当P<0.05时认为在统计学上差异显著。

2不同界面组分脂滴的制备及表征

2.1材料与方法

2.1.1材料与设备

2.1.1.1主要设备

本章中制备脂滴及表征所需的主要仪器设备如表4所示。

表4：实验主要仪器与设备

2.1.1.2主要原料

同1.1.1.2

2.1.1.3主要试剂

表5：实验主要试剂

2.1.2乳液的制备

将酪蛋白酸钠以0.1、0.5、1％(w/w)的浓度，以及乳脂肪球膜磷脂以2、4、6％(w/w)的浓度，常温下搅拌3h以上充分溶解，随后以最终乳液中2.5％(w/w)的比例加入婴幼儿配方乳粉专用植物油，继续搅拌30min，混合均匀后，用高速剪切仪以6500rpm预乳化1min，以常温进料温度尽快倒入高压均质机完成乳化。当天无法用完的乳液加入叠氮钠(0.02％，w/v)，以防止腐败菌的生长，于常温储存，两天内用完。

2.1.3粒径分布分析

样品中脂滴粒径采用Malvern的Mastersizer 3000测定，其量程达到0.01-3500μm。仪器基于激光衍射技术工作，当激光照射样品颗粒时，会在颗粒表面产生衍射、表面反射、颗粒对光的吸收，介质与颗粒的折射等现象，这些现象的互相作用导致了干涉效应，产生激光散射图谱。其中，散射光角度θ与样品颗粒的直径成反比，散射光强度会随角度θ的增加呈对数规律衰减，利用这一原理就能够测量出样品的颗粒大小和浓度。Mastersizer3000依据Mie(米氏)理论进行颗粒粒度分析，该理论能够通过预测球形颗粒衍射光的方法及光被颗粒吸收的途径，再通过检测器处的光学元件收集散射光，推算出衍射模式，继而运用米氏理论计算样品颗粒大小。

测试前将样品池中加满500mL纯水，粒子浓度范围设置为10-20％，颗粒类型选择球形，470nm蓝光光源检测背景后，加入样品乳液直到粒子浓度在合适范围内，即可进行测量。每个样品分析重复3次。

2.1.4zeta电位的测定

样品中脂滴表面zeta电位利用Malvern的Nano ZS ZEN3600完成。zeta电位是颗粒与周围环境间的滑动平面上存在的电位。仪器基于动态光散射原理(Dyanmic LightScattering，DLS)进行分析：带电颗粒在外加电场作用下发生定向移动，当光束照到颗粒上时，就会引起光束频率或相位发生变化，且颗粒运动速度越快，光的频率和相位变化速度也快。因此可以通过测定光的频率或相位变化来间接测出颗粒的电泳速度，进而推算出zeta电位值。

为减小多重散射对测量的误差，测量时取样品乳液10微升均用超纯水稀释1000倍至10ml。每个样品分析重复3次。

2.1.5脂肪上浮的观察

婴幼儿配方乳粉专用植物油与酪蛋白酸钠或磷脂混合之前，以0.04％(w/w)加入油红染料，充分溶解后，在低速离心机中以4000×g/5min常温离心除去杂质，均质制备乳液，得到的乳液立即放置在室内灯下的固定位置观察。

2.1.6结构照明超分辨荧光显微镜

不同脂滴样本利用结构照明超高分辨率荧光显微镜进行研究。乳液在4000g、5min下低速离心，挖取0.35g上层脂滴，轻柔溶解于5mL超纯水中。将固绿(Fast Green)以1mg/mL的浓度溶解于超纯水中，充分溶解后，在低速离心机中以4000×g/5min常温离心除去杂质，吸取上层染料100微升，与250微升稀释后的乳液混合，避光处均匀染色1h以上，用于标记蛋白。25微升丽丝胺罗丹明B染料(激发波长543nm)与250微升脂滴溶液混合，于室温下避光染色1h以上，用于标记磷脂。取1％(w/w)的低熔点琼脂糖溶液，提取先在45℃热水中融化恒温，待用。取染色后的样品乳液10微升，添加40微升的恒温好的低熔点琼脂糖作为脂滴的稳定剂，固定在单面凹载玻片中，锡箔纸避光包好。采用Conventional模式研究并采用反卷积技术进行图像反卷积处理，XY轴方向分辨率250nm，Z轴方向分辨率300nm。

2.1.7数据处理及统计分析

所有实验进行三次重复实验，实验数据以Means±SD表示，运用SPSS20.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析采用Duncan方法比较显著性差异。当P<0.05时认为在统计学上差异显著。

3脂滴界面组成及粒径对消化过程的影响

3.1材料与方法

3.1.1材料与设备

3.1.1.1主要设备

本章中为实现模拟体外消化实验及各指标检测所使用的主要仪器设备如表6所示。

表6：实验主要仪器与设备

3.1.1.2主要试剂

表7：实验主要试剂

3.1.2不同界面组分及粒径脂滴的制备

以1％(w/w)酪蛋白酸钠、4％(w/w)磷脂溶液为乳化剂，加入2.5％(w/w)infant混合植物油搅拌30min，混合均匀后，高速剪切仪1档(6500rpm)预乳化1min后，在高压均质机中以5MPa/1MPa/4次及50MPa/5MPa/6次的条件分别制备得到不同界面组分的大、小脂滴。

3.1.3体外消化过程

3.1.3.1胃、肠模拟消化液的制备

模拟胃肠消化液及其成分综合Bourlieu及Gallier所述并有所修改，具体如表8所示。

表8：胃肠阶段所需模拟消化液

3.1.3.2胃肠消化酶的制备

模拟胃肠阶段所需消化酶及其配置方法综合Bourlieu，Gallier及Dupont等人所述并有所修改，具体如表9所示。

表9：胃肠阶段所需消化酶液

3.1.3.3胃内消化

取乳液120ml于250ml玻璃烧杯中，放入2.5cm转子，在磁力搅拌器上以370rpm转速加热到乳液中心温度37℃并恒温待用。启动pH-stat程序，设置胃内消化阶段持续120min，如图1所示，为更好的模拟婴幼儿胃内的真实pH环境，将胃内pH设定分为四个阶段梯度下降，即0-30min(pH6.5)、30-60min(pH6.0)、60-90min(pH5.5)、90-120min(pH5.0)。程序开始后，加入模拟胃液(SGF)调节乳液至pH6.5后，准确加入胃蛋白酶和胃脂肪酶浓溶液各4.8ml，使两种酶在整个消化体系中的浓度分别为0.4mg/mL和0.8667mg/mL。消化过程中用0.05mol/L的氢氧化钠溶液不断滴定以维持设定的pH值，全称记录实时pH及消耗的碱液体积。取出待检的样品于80℃加热30min灭酶处理。

3.1.3.4肠内消化

取经过胃消化120min消化的乳液90ml于250ml玻璃烧杯中，放入2.5cm洁净转子，在磁力搅拌器上以370rpm转速加热到乳液中心温度37℃并恒温待用。设置程序肠内消化阶段持续120min，pH恒定在7.0。程序开始后，加入模拟肠盐溶液30mL、胆盐溶液30mL及含有胰液素、胰脂酶的混合酶液30mL，使两种消化酶在乳液中的浓度为1.6mg/mL。消化过程中用0.05mol/L的氢氧化钠溶液不断滴定以维持设定的pH值，全称记录实时pH及消耗的碱液体积。取出待检的样品于80℃加热30min灭酶处理。

3.1.4消化过程中脂滴水解情况的表征

对消化过程中脂滴的水解表征从微观结构观察，水解产物表征等两个方面进行。微观结构方面包括粒径大小、zeta电位等，水解产物包括脂肪酸释放总量、释放模式分析、脂肪提取TLC分析及SDS-PAGE蛋白电泳等。具体方法如下所述：

3.1.4.1粒径测定方法同2.1.3

3.1.4.2脂滴微观结构观察

消化过程中吸取10微升乳液于载玻片中央，轻柔覆盖盖玻片，用倒置显微镜观察，调节显微镜焦距至画面清晰后拍照。分析软件为显微镜摄影图像处理软件ZEN。

3.1.4.3Zeta电位检测方法同2.1.4

3.1.4.4脂肪酸总释放量

消化过程中释放出的脂肪酸不断被0.05mol/L的氢氧化钠溶液滴定中和，以维持设定pH，因而可用滴定过程中的碱液消耗量来表示脂肪酸释放情况，以1mol氢氧化钠滴定1mol游离脂肪酸计。

3.1.4.5脂肪酸释放模式的测定

采用GBT22223-2008中所述方法分析乳液消化过程中所产生的游离脂肪酸。对于初始样品中需检测其甘油三酯水解后的总脂肪酸，省略皂化步骤即可。具体方法如下：

a.提取脂肪。准确称取10g乳液于230mL烧瓶中，加入约100mg焦性没食子酸及5mg/mL的十一碳酸甘油三酯内标溶液2mL，加入几粒沸石、2mL的95％乙醇以及4mL超纯水，混匀后加入25-28％的氨水5mL，放入70-80℃水浴锅中，水解20min后取出冷却，再加10mL的95％乙醇混匀，全部转移到分液漏斗中，加50mL***冲洗原烧瓶，少量***：石油醚(1:1，v/v)混合液冲洗瓶塞，转入分液漏斗，加盖充分震荡，静置10min后收集醚层，水解液重复提取三次脂肪，所有醚液均汇合到一起，蒸干溶剂，得到脂肪提取物。

b.皂化及甲酯化。在装有脂肪提取物的烧瓶中加入2％氢氧化钠溶液8mL，连接回流冷凝器在80℃水浴上回流，直至油滴消失，从回流冷凝器上端加入15％三氟化硼溶液7mL，继续80℃回流2min后，用超纯水冲洗回流冷凝器，停止加热，烧瓶取下并冷却到室温，准确加入20mL正庚烷，充分震荡后，加少量饱和氯化钠溶液，静置分层，吸取上层正庚烷约5mL，转移到30mL玻璃试管中，加入3-5g无水硫酸钠，震荡后静置5min，吸取上层溶液到进样小瓶中待检。

c.气相色谱检测。所用色谱柱为含50％氰丙基的交联键合固定相毛细管色谱柱(60米×0.25毫米，0.25微米)，进样器温度270℃，检测器温度为280℃。载气为高纯氮气，分流比50:1，进样量为10微升，升温程序为，初始温度130℃，持续1min；130-170℃，升温速率6.5℃/min；170-215℃，升温速率2.75℃/min；215℃保持12min；215-230℃，升温速率4℃/min；230℃保持3min，检测结束。

3.1.4.6薄层色谱观察甘油三酯水解情况

利用薄层色谱法观察各组在消化过程中的脂肪水解情况，具体方法如下：

a.微量提取脂质。取消化过程中的乳液200uL，与1.2ml氯仿/甲醇(2:1)混合，并加80ul的0.1mol/L盐酸酸化终止反应，充分混匀后，用48ul的0.73％氯化钠溶液震荡，再加入300ul的氯仿/甲醇(2:1)。混合均匀后，常温下4000g/5min离心，收集下层氯仿相用于点样。

b.配置展开剂。展开剂成分为氯仿：甲醇：水：醋酸(70:30:4:2，v/v)。

c.薄层色谱板划线后点样品，每点上样量为4微升，在展开缸中饱和20min后展开，到达标志线后取出，挥干，碘蒸气显色15min。

3.1.4.7SDS-PAGE电泳方法测定蛋白水解情况

电泳方法参照Laemmli等人的方法。具体条件为：分离胶浓度12.5％丙烯酰胺，浓缩胶浓度4％丙烯酰胺。将不同样品离心脱脂后的下清液在5×样品缓冲液(60mM Tris-HCl溶液，pH 6.8，250g丙三醇，20g SDS，50mLβ-巯基乙醇，溴酚蓝1g/L)中稀释，并煮沸5分钟，冷却待用。上样量为10微升。电泳操作电压浓缩胶为80V，分离胶为120V。待样品跑至分离胶底部时停止，取出凝胶放入平皿中，加入考马斯亮蓝溶液在摇床上缓慢振荡染色半小时，弃去染色液，将凝胶在脱色液中漂洗数次直至清晰地条带显现出来。脱色完全之后，将凝胶经扫描仪扫描成像并进行蛋白分子量的分析。

3.1.5数据处理及统计分析

所有实验进行三次重复实验，实验数据以Means±SD表示，运用SPSS20.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析采用Duncan方法比较显著性差异。当P<0.05时认为在统计学上差异显著。

实施例及实验结果与分析

实施例1不同提取剂组合的提取效果对比

利用三组不同的萃取剂对酪乳粉中的总脂质进行提取，蒸干溶剂后获得的脂质得率及其中的磷脂总量如表10所示。由表可知，氯仿/甲醇和二氯甲烷/甲醇作为提取剂组合的效率最高，而正己烷/异丙醇组合的提脂率显著较低，此外由表可见，获得的脂质中的磷脂总量，氯仿/甲醇明显高于另外两个提取剂组合。

表10：三组萃取剂所得总脂质得率及其磷脂含量

不同提取剂组合	比例	脂肪提取率(％)	磷脂总量(微摩尔/升)
				氯仿/甲醇	2：1	5.52±0.10<sup>ab</sup>	196.78±5.77<sup>b</sup>
二氯甲烷/甲醇	2：1	5.71±0.16<sup>b</sup>	162.68±4.63<sup>a</sup>
				正己烷/异丙醇	2：1	5.43±0.08<sup>a</sup>	157.83±3.57<sup>a</sup>

Mean±SD，同一列标注不同字母a-b，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

提取效果的差异可能和有机溶剂的极性大小相关。氯仿/甲醇、二氯甲烷/甲醇、正己烷/异丙醇等三种溶剂组合的极性分别为4.4/6.6、3.4/6.6、0.06/4.3。由于酪乳粉总脂质中含有比一般脂肪更多的的磷脂，因此正己烷/异丙醇组合的低极性可能导致了其萃取出的脂肪中极性磷脂浓度比另外两组低。因此选择氯仿/甲醇或二氯甲烷/甲醇作为大量提取脂质的提取组合，结合后期旋转蒸发步骤中的可操作程度，二氯甲烷的沸点(39.75℃)远低于氯仿(61.15℃)，更易蒸干，节省能源，并且毒性也更低，最终选择二氯甲烷/甲醇作为大量提取酪乳粉中脂质的萃取剂组合。

实施例2酪乳粉及其总脂中的磷脂组成分析

利用HPLC-ELSD方法对酪乳粉原料及萃取后所得总脂质中的三种主要磷脂，即磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl ethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)、神经鞘磷脂(Sphingomyelin，SM，也即SPH)进行定性定量分析。以内标法对三种磷脂标准品所作的标准曲线如图2所示，R2均在0.99以上。可以看出，利用该方法得到的结果线性较好。

对酪乳粉原料及萃取后所得总脂质中的磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、神经鞘磷脂(SM)进行定性定量分析结果如图3所示。PE、PC、SM的保留时间分别在11.011min、14.137min及15.165min左右，峰与峰之间区分较为清晰。

根据标准曲线计算得到的酪乳粉及其总脂质中的三种主要磷脂含量如表11所示。由表可知，经过萃取处理，酪乳粉原料中三种主要磷脂在总脂质中得到了10-15倍的富集，约占总脂质中15.27％(w/w)的比例。

表11：酪乳粉及所提取总脂质中的三种主要磷脂组分

样品	PE(％)	PC(％)	SM(％)
				酪乳粉	0.32±0.02	0.46±0.02	0.39±0.01
总脂质	3.68±0.00	6.30±0.10	5.29±0.06

实施例3所提取脂质的乳化能力表征

油水两相之所以互不相溶，是由于两相间存在界面张力，即油和水的接触面上有相互排斥和各自尽量缩小彼此接触面积的作用力。因此，乳化剂对于降低界面张力的能力可能作为衡量其乳化性强弱的一个参考。

磷脂属于生物表面活性剂，已经作为食品添加剂得到了诸多应用。在磷脂分子中，既含有疏水性的脂肪链，又含有亲水性的磷酸脂基，双亲特性使其既能以薄膜状包裹在油滴表面，同时又以其亲水性，与水分子互相吸引，大大降低水油之间的界面张力，从而帮助互不相溶的水油两相形成均匀稳定的乳化液。

以常用浓度的酪蛋白酸钠，以及等量卵磷脂作对比，评价酪乳粉磷脂降低界面张力的能力。用婴幼儿配方乳粉专用油脂为油相，分别用磷脂(4％，w/w)、酪蛋白酸钠(1％，w/w)、大豆卵磷脂(0.252％，w/w)作为乳化剂绘制出的表面张力降低曲线图如图4所示。可以看出，磷脂的起始油水界面张力显著小于酪蛋白酸钠及当量的大豆卵磷脂，且达到平衡的时间更短，最终的界面张力也更低。由此可见与常用的酪蛋白酸钠或小分子大豆卵磷脂乳化剂相比，从酪乳粉中萃取得到的磷脂具有更强的乳化能力。

乳化剂在油水体系中的乳化作用与其亲水-亲油平衡值，即HLB值相关。HLB值越低则疏水性越强，越适合形成油包水(W/O)型乳液；反之，该值越高约易于形成水包油(O/W)型乳液。通常磷脂的HLB值介于9-10之间，具体数值随其中各磷脂种类的含量多少而有所不同，例如磷脂酰胆碱(PC)的含量较高，有利于形成O/W型乳液，而磷脂酰肌醇(PI)含量高则更易于形成W/O型乳化体系。结合表11中的磷脂组分分析结果，可以推测，酪乳粉中提取出的磷脂能够以一定浓度作为O/W型乳液的乳化剂，包裹住油滴，形成符合要求的乳液。

实施例4均质工艺研究

为研究脂滴粒径及界面组分对消化过程造成的影响，首先需要均质获得不同大小以及不同界面组分的脂滴。为确定合适的均质条件，实验以1％酪蛋白酸钠作为壁材，婴幼儿配方乳粉专用物油脂为芯材的乳液作为样品，研究不同均质条件及乳化剂浓度对粒径产生的影响，筛选出满足要求的工艺参数。

粒径结果用D[4，3]、D[3，2]、PDI以及分布曲线来表示。其中D[4，3]为体积平均直径，该值对乳状液中的大颗粒数量变化比较敏感。D[3，2]称表面积平均直径，该指标对乳状液中的小颗粒数量变化比较敏感。PDI(Polydispersity Index)即多分散系数，用于表示乳液中粒径的分布集中程度，该值越大，表示颗粒分布范围越宽，值越小表示颗粒分布越集中。

4.1大粒径脂滴制备条件的筛选

天然母乳中的脂肪球粒径大小从0.1微米到15微米不等，平均在3-5微米之间。实验所需的大脂滴需要尽量模拟天然母乳中脂肪球的粒径。常见的二级均质工艺(15-25MPa/5MPa)得到的脂滴粒径较小，大部分介于1微米左右，因此考虑采用15MPa以下的一级均质压力以获得大粒径脂滴。不同压力下均质4次得到的脂滴粒径数据如表12所示。

表12：乳液在不同压力下均质四次得到的大脂滴及母乳中脂肪球粒径

Mean±SD，同一列标注不同字母a-b，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05；母乳粒径引自Yao YP。

可以看出，经过5MPa/1MPa和10MPa/1MPa四次均质得到的脂滴大部分都在1-10微米的范围内。从D[4，3]和D[3，2]结果来看，5MPa/4次下得到的脂滴和天然母乳脂肪球粒径分布更加相似。因此，采用5MPa/4次的均质条件来制备大粒径脂滴。

4.2小粒径脂滴制备条件的筛选

通常，液态乳经过均质后的脂肪球粒径在1微米左右，而婴幼儿配方乳粉中的脂滴由混合植物油和水溶性乳蛋白经高压均质及喷雾干燥而成，平均粒径约在0.4微米，比天然乳脂肪球小得多。为研究粒径大小对脂肪消化造成的影响，还需制备小粒径脂滴。实验尝试用不同均质压力(40MPa/4MPa、50MPa/5MPa、60MPa/6MPa)和均质次数中(4次、6次)制备乳液，以期获得能和大粒径脂滴径完全分开的小粒径脂滴。其粒径测定结果如表13及图5、6所示。

表13：乳液在不同压力条件下得到的小脂滴粒径

Mean±SD，同一列标注不同字母a-b，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

40MPa/4MPa和50MPa/5MPa均质四次得到的脂滴粒径没有显著性差异，均在1微米左右，且PDI较小，表明粒径分布较为集中，但仍和大脂滴粒径分布没有完全分开。而60MPa/6MPa虽然压力最高，但均质后得到的脂滴分布不均，甚至出现了100微米以上的脂滴。实际操作中也发现，由于均质压力更高，均质出口流出的乳液温度也更高，这可能直接导致了乳液中脂滴的宽范围分布。均质温度会影响均质过程中乳化剂向油水界面的迁移速度，一般而言，温度越高，乳化剂吸附的速度越快，但温度过高可能导致蛋白变性，反而降低乳液的均质效果及稳定性。

在此基础上进一步提高均质次数为6次，得到的脂滴粒径分布如图6所示。可以看出，当均质次数达到6次，不同均质压力造成的差异更加明显。

首先，在60MPa/6MPa条件下均质得到的脂滴，不仅曲线发生右移，PDI也进一步增加，粒径分布范围更宽。40MPa/4MPa与50MPa/5MPa均质条件下得到的脂滴粒径无显著性差异，但40MPa/4MPa得到的脂滴和大粒径脂滴相比，在1微米附近出现少部分重合，无法完全分开。反之，50MPa/5MPa均质6次的条件不仅能与大脂滴粒径分布完全分开，而且PDI最小，表明该条件下能够获得与大粒径差异显著，且分布最为集中的小脂滴。综合以上结果，实验最终采用50MPa/5MPa/6次的均质条件来制备小粒径脂滴。

实施例5乳化剂浓度的选择

5.1不同浓度乳化剂制备得到的脂滴粒径结果

分别采用0.1、0.5、1.0％(w/w)浓度的酪蛋白酸钠溶液以及2、4、6％(w/w)的磷脂溶液制备乳液，根据粒径、电位等指标判断其乳化效果，旨在筛选出能够包被2.5％(w/w)油脂芯材的乳化剂浓度。

首先根据粒径判断各乳化剂浓度在均质操作下制得的脂滴粒径是否符合要求。两组的粒径结果如表14及图7、图8所示。

表14：不同浓度乳化剂均质得到的脂滴粒径

Mean±SD，同一列标注不同字母a-d，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

从蛋白组的粒径结果来看，三个浓度的酪蛋白酸钠溶液经5MPa/1MPa/4次的均质操作，均能获得理想粒径的大脂滴。而磷脂组中三个不同浓度的乳化效果则存在差别。从图8中可以看出，随着乳化剂中磷脂浓度的增加，脂滴粒径有逐渐变小的趋势，分布也更为集中。而表14显示，当磷脂乳化剂浓度为最低的2％时，PDI值显著增加，均质效果较差。与6％浓度相比，用4％均质得到的脂滴粒径分布更为集中。

5.2不同浓度乳化剂制备得到的脂滴zeta电位结果

Zeta电位指的是双电层中扩散层内外交界处之间的电位差，其绝对值代表着体系趋向稳定或趋向絮凝的趋势，是衡量体系稳定性的重要指标。表15为不同样品间脂滴表面zeta电位的检测结果。通常在液态体系中，当颗粒表面电荷的绝对值大于30mV时，粒子间的静电斥力可有效阻止粒子间发生聚集，也即体系较为稳定。可以看出，不同浓度酪蛋白酸钠组间的脂滴表面zeta电位并无显著性差异，同样，磷脂组内也无显著性差异，这说明不同浓度间，脂滴表面的乳化剂吸附情况相似，并不随乳化剂浓度增加而发生脂滴表面的明显改变。而乳化剂类型造成的差异非常显著，磷脂组的脂滴zeta电位远低于蛋白组。文献报道中酪蛋白酸钠在不同环境中的zeta电位存在差异，但基本在-20mV左右。而乳磷脂则相对更低，有研究结果表明，以3％酪乳粉制备得到的脂质体zeta电位在pH6.7时为-62mV，且随体系pH越低，电位绝对值越小。因此，以磷脂为界面组分的脂滴可能稳定性比蛋白乳化剂组更高。

表15：不同类型及浓度乳化剂制备的脂滴zeta电位

Mean±SD，同一列标注不同字母a-b，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

实施例6脂肪上浮情况

观察乳液表面的浮油量是判断乳液包埋效果的一个直观方法。图9以及图10分别是不同浓度酪蛋白酸钠、磷脂制备得到的乳液表面浮油情况。由图可见，随着乳化剂浓度增加，乳液表面的浮油均在减少。对于酪蛋白酸钠组而言，0.1％浓度浮油明显，随着乳化剂浓度增加到0.5％，浮油量明显减少，但仍和1％浓度间存在差别。磷脂组内，2％浓度比另外两个较高浓度组浮油情况严重许多，而4％和6％间的差异并不明显。

综合不同乳化剂浓度组间，脂滴粒径及表面zeta电位的结果，可以判断，针对酪蛋白酸钠组，不同浓度间的粒径分布以及zeta电位值间并无显著性差异，而就浮油情况而言1％浓度远优于另外两个较低浓度，这可能是由于乳化剂的增加显著提高了油脂芯材的包埋量，而对单个微观粒子的包埋效果却没有造成差异。综合考虑，采用1％作为酪蛋白酸钠乳化剂制备CN组脂滴的乳化剂浓度。同样的，磷脂组的不同浓度间，粒径分布以及zeta电位间也基本相同，观察浮油情况可以得到4％和6％浓度效果相近，而二者优于2％的结果。考虑到酪乳粉磷脂的获取难度，因此，选择4％的磷脂溶液浓度制备PL组乳液，一方面足以满足乳液要求，另一方面能够节省脂质消耗量。

实施例7结构光照明超高分辨率荧光显微镜结果

结构光照明超分辨荧光显微成像技术(Structured Illumination Microscopy，SIM)是近年来出现的新型成像技术，相比传统荧光显微镜，SIM的横向分辨率可以达到其两倍，且成像速度更快，对荧光标记也没有特殊要求。利用SIM得到的微观结构图像能够直接反映脂滴在乳液中的真实存在情况，同时荧光染色手段则能够表征脂滴的表面组分，验证不同乳化剂的包埋效果。

由酪蛋白酸钠及磷脂乳化剂制备得到的脂滴，分别经固绿、丽丝胺罗丹明染料染色后得到的SIM结果如图11所示。可以看出，两种类型的乳液中均存在着大小不一的脂滴。固绿被用于指示蛋白的存在，而丽丝胺罗丹明被广泛用于染磷脂。从图11中可以看出，经固绿染色后的酪蛋白酸钠脂滴表面主要由蛋白包被(图11A)，而经丽丝胺罗丹明染色的磷脂脂滴，表面则散布着磷脂(图11B)。从而验证实验成功制备得到了表面组分不同的两种脂滴。

实施例8不同界面组分及粒径脂滴的消化速率对比

在胃肠消化过程中，通过不断滴加低浓度NaOH溶液(0.05mol/L)来维持恒定pH值，通过该过程中的耗碱量，来换算总脂肪酸释放量并对游离脂肪酸的产生速率进行对比。

表16所示为胃内消化阶段，各组在不同时间点的脂肪酸释放情况。可以看出，不同界面组分及粒径脂滴之间的脂肪酸释放总量有明显区别。具体而言，在等体积、等含油量的四组乳液中，磷脂包裹的两个PL组，在胃内消化阶段最终消耗的碱液量明显更多，这表明与CN组相比，PL组的脂肪球所释放的FFA总量更多，脂解程度更高，且无论大小脂滴均是如此。而粒径对FFA释放量造成的影响与界面组分相关，对于CN组而言，小脂滴比大脂滴消耗了更多的碱液，而PL-L与PL-S组之间的差异却并不如CN组明显。

显著性分析结果表明，两组PL包被的脂滴，从胃消化第15min开始，就显示出更快的脂肪酸释放速度，并一直持续到胃消化终点120min。对于每组各自的消化速度而言，CN-L和CN-S均在第30min就基本到达了胃内消化的平衡，之后的90min内几乎不再释放脂肪酸；而两个PL组在更长的时间内保持着高速消化状态，且PL-L比PL-S更快到达平衡。具体而言，PL-L在胃内第60min时，脂肪酸释放速度开始变慢，之后仍保持着缓慢消化的状态，而PL-S直到第90min时脂肪酸仍有明显释放。可以看出在胃内消化阶段，与CN组相比，PL组脂滴不仅水解程度更高，且在整个消化过程中的水解速度也更快更持续，同时粒径对于CN组的影响比PL组更大。

表16：不同粒径及界面组分脂滴在模拟胃消化过程中的脂肪酸释放变化

Mean±SD，同一列标注不同字母a-h，同一行标注不同字母A-C，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

表17所示为模拟肠内消化阶段，各组在不同时间点的脂肪酸释放情况。从可以看出，在肠内消化阶段，四组脂滴均在继续释放脂肪酸，且不同界面组分脂滴之间的脂肪酸释放总量存在显著区别。具体而言，PL组的耗碱量始终高于CN组，说明在肠内消化阶段，磷脂作为界面组分的脂滴仍然保持了消化程度上的明显优势。然而粒径所带来的影响并不如在胃中的显著。

显著性分析结果表明，PL-S组最先表现出了更快的脂肪酸释放速度，其他三组则较慢，但PL-L在肠内第75min达到了PL-S的水平，之后逐渐放缓。对于每组各自的消化速度而言，四组脂滴基本都从第90min开始消化速度变慢。后期大脂滴似乎比小脂滴的消化更持久一些，但差异并不显著。这与不同大小脂滴在进入肠腔后，粒径差异减小所可能带来的结果相一致。

表17：不同粒径及界面组分脂滴在模拟肠消化过程中的脂肪酸释放变化

Mean±SD，同一列标注不同字母a-f，同一行标注不同字母A-B，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

从表17中可以看出在肠内消化阶段，不同界面组分的脂滴之间消化速度方面的差异并不如在胃内的明显，但PL组的脂肪酸释放总量仍旧更多。如前面所述，胆盐的参与可能替换掉了一部分原有的界面乳化剂，缩小了原本界面组分之间的差距。同时，粒径仍对脂解造成一定影响，但后期随着消化放缓，不同大小脂滴之间的脂肪酸释放量差异逐渐缩小，最后基本相同。Berton等人研究发现，在人体肠道消化阶段，脂肪球膜上存在蛋白组分能够提高结合胰脂酶的水解效率，然而同时会降低其界面质量，反之，表面包被更多天然膜组分的脂肪球更容易和胰脂酶发生作用。

实施例9薄层色谱结果

对各组脂滴在胃肠消化过程中的脂质进行提取，并进行薄层色谱分析结果如图12及13所示。每组的斑点从左至右依次为模拟胃消化0、30、60、90、120min及模拟肠消化0、30、6、120min。

如图12所示，随着消化的进行，CN组脂滴的甘油三酯(TAG)被不断被降解，水解产物游离脂肪酸(FFA)、甘油二脂(DAG)逐渐增加。可以看出，在进入模拟肠道消化阶段后，TAG的斑点逐渐以更快的速度变浅，表明脂肪进一步被降解，且消化速度比在胃内更快。

和CN-L(图12A)相比，CN-S(图12B)组脂滴在胃消化阶段的水解产物斑点面积更大，颜色更深，但在肠内消化阶段两者之间的差异则并不像在胃中那么明显，说明在CN组中，小粒径脂滴在胃内消化速度比大脂滴更快，但原始粒径在模拟肠消化阶段造成的差异明显减小，这也与前面结果中脂肪酸释放量的结果相一致。

图13为PL组大小脂滴在胃肠消化过程中的TAG水解情况。同样，随着消化进行，脂肪不断被降解，水解产物FFA、DAG斑点颜色逐渐加深。与图12中的CN组相比，PL组的甘油三酯降解程度更高，水解产物增加更明显。并且PL组脂滴在肠内的消化速度也比在胃内快，这也说明脂肪的消化从胃内就已经开始，而更进一步的降解则主要在肠道内进行。

TAG及其水解产物下方斑点可见磷脂的存在。可以看出，随着模拟消化的进行，PL-L及PL-S组脂滴上的磷脂组分都存在一定程度的降解，并且主要发生在模拟肠消化阶段。一般而言，人体中的胃脂酶是不会水解磷脂的；而胰液素作为消化酶混合物，其中含有的磷脂酶A2则可以水解食物中的磷脂组分。图13显示，PL-S组脂滴的磷脂降解速度在模拟肠消化阶段要快于PL-L组。

实施例10SDS-PAGE蛋白电泳结果

CN-L组脂滴在消化过程中的SDS-PAGE电泳结果如图14所示，蛋白质marker右侧条带从左至右(1-8)依次为胃0、30、60、90、120min以及肠5min、60min、120min。可以看出，在消化开始前，作为脂滴界面乳化剂的酪蛋白含量很高，之后随着消化的进行不断降解。从图中可以明显看出，酪蛋白酸钠在胃内水解较为缓慢，而在肠内则很快消化完全。

婴幼儿摄食后胃中pH约为5-6，而胃蛋白酶(Pepsin)的最适pH在2左右，因此胃蛋白酶在婴儿胃中的活性比成人更低。尽管如此，酪蛋白及乳清蛋白在婴幼儿的胃蛋白酶的作用下仍会发生部分水解，并且酪蛋白的水解速度更快。酪蛋白在消化过程中会出现一些问题，例如在pH4.6附近会发生絮凝，较大的酪蛋白胶束还会在婴儿胃中形成坚硬凝块，不利于蛋白消化的进行。除乳铁蛋白及少量脂肪球膜蛋白外，几乎全部乳蛋白都在肠腔内完全消化，这也与图14中的结果一致。

实施例11脂滴在消化过程中的粒径变化

各组脂滴在消化过程中的粒径变化如图15及表18所示，A、B、C、D依次表示酪蛋白酸钠组大脂滴(CN-L)、酪蛋白酸钠组小脂滴(CN-S)及磷脂组大脂滴(PL-L)、磷脂组小脂滴(PL-S)。由上自下分别为模拟胃消化0、30、60、90、120min及模拟肠消化0、30、60、120min的粒径分布图。表18中的粒径结果用D[4，3]即体积平均直径来表示。

可以看出，四组脂滴在前120min的胃内消化阶段，粒径都在逐渐增大。有研究表明，和模拟胃液(SGF)混合后，乳液中的脂肪球粒径会急剧增加，这是由于成人胃中的酸性环境(pH1.5-2.0)引发了脂肪球聚集，而婴幼儿摄食后胃中的pH较高(pH5-6)，因此粒径在胃消化初始并没有显著增加。

在胃蛋白酶和胃脂肪酶的共同作用下，脂肪球逐渐发生聚集，粒径变大，同时脂解反应释放出的游离脂肪酸附着在脂滴表面使聚集加剧。尤其是CN组，随着消化进行，胃内pH下降至等电点附近，造成酪蛋白剧烈絮凝，粒径大小发生突变，CN-L及CN-S组脂滴聚集后粒径均增加到100微米以上。

与模拟肠液混合后，pH回升到7.0，以及及胆盐的加入，都使聚集的脂肪球重新分散开，因而CN组脂滴粒径立即减小(图15AB)，与文献中报道的，W/O乳液中脂滴在肠内的粒径通常在1-50微米相一致。和CN-L相比，CN-S组在肠消化阶段的粒径峰不明显，表明小脂滴消化更快。随着肠内消化的进行，CN组脂滴在胰脂酶作用下进一步水解，粒径不断减小。

表18：各组脂滴在模拟胃肠消化过程中的D[4，3]粒径变化

Mean±SD，同一列标注不同字母a-g，同一行标注不同字母A-D，表示具有显著性差异，n＝3，P<0.05。

PL组脂滴的粒径在胃里不断增大，逐渐呈双峰分布，原本分布在1-10微米的脂滴不断减少，同时增加了一个10-100nm之间的粒径峰(图15CD)，这表明PL组在模拟胃消化阶段脂滴结构部分丧失，TAG逐渐溢出并相互聚集。和CN组相比，PL组在0-60min内出现了更大粒径的脂滴。这可能说明由小分子磷脂形成的界面膜比由其它乳化剂形成的界面涂层抗聚集能力差。但在60-90min(pH5.5)及90-120min(pH5.0)阶段，PL组并没有受到酸性环境的影响出现类似CN组的剧烈絮凝，这表明以磷脂为乳化剂的脂滴可能在胃内能够更加持续、平稳的进行消化。

从表18中可以看出，进入模拟肠消化阶段后，PL组脂滴的初始粒径峰消失，粒径增大为10-100nm，这表明胆盐竞争性吸附到脂滴表面，使得原来的乳化剂脱落，脂滴表面遭到破坏，脂滴结构全部丧失。除了胆盐吸附在界面会降低脂滴稳定性外，TAG水解后产生的表面活性物质也会使粒径进一步增大。随着肠内消化的进行，脂滴不断被胰脂酶水解，造成粒径减小。与PL-L相比，PL-S组在肠消化阶段的粒径峰更不明显，这表明在TAG从脂滴中释放出来后更快的被水解成为脂肪酸，因而粒径峰几乎消失。

显微镜下不同界面组分的两组脂滴的变化如图16所示。同粒径结果一致，CN组脂滴在模拟胃消化90min开始出现絮凝现象，而PL组脂滴则始终保持了球状结构，并在胃脂肪酶的作用下甘油三酯溢出，粒径逐渐增大。在模拟肠消化阶段，两组脂滴都在胆盐作用下形成了部分新界面。

实施例12脂滴在消化过程中的Zeta电位对比

Zeta电位是指示粒子分散体系稳定性的重要指标，代表着体系趋向稳定或趋向絮凝的趋势，能够借颗粒的微观带电特性说明其稳定性大小，并间接反映表面组分的变化情况。各组脂滴在胃内消化阶段的界面zeta电位变化如图17所示。

体系pH对zeta电位影响较大，由于胃内各阶段的消化pH值不同，因此对不同阶段之间的脂滴zeta电位进行比较意义并不大。从图17中可以看出，除了初始时刻外，在胃消化的整个120min内，PL组脂滴的zeta电位绝对值都要显著大于CN组，且PL-L的zeta电位绝对值比PL-S明显要高，这可能是由于，同样的乳化剂浓度，大脂滴表面积更小，相应单位面积上覆盖的磷脂更多，带来的磷酸负电荷更多。五种主要乳源磷脂中主要包含3种化学基团，即磷酸基团(R2HPO4/R2PO4-)、羧基基团(COOH/COO-)、胺基基团(NH3+/NH3)。在中性环境中，三种基团分别以R2PO4-、COO-和NH3+形式存在，使磷脂呈负电性。当pH下降到3.6时，COO-转而以COOH形式存在，zeta电位绝对值减小，但磷脂仍显负电性。而酪蛋白酸钠在pH4.6时就已到达其等电点。这说明在胃内消化阶段，以磷脂为界面组分的脂滴，其所在乳液稳定性始终强，受到体系pH变化带来的影响更小。

肠内消化阶段体系pH始终为7.0。与模拟肠液混合后，四组脂滴的zeta电位绝对值均明显增加。一方面，pH由胃120min的5.0上升到7.0，使CN组中的酪蛋白远离了等电点，另一方面胆盐替换了脂滴界面原有的酪蛋白或磷脂组分，因此在模拟肠消化阶段，脂滴的zeta电位由胆盐提供，而pH7.0时胆盐带有很强的负电性。从图18中可以看出，PL-S的电位绝对值始终显著高于其他各组，这可能是由于粒径较小利于胆盐更快的吸附在界面，因而PL-S组脂滴一进入模拟肠消化阶段就被胆盐包裹并替代了磷脂组成。此外，PL-S在肠段的消化率始终最高，甘油三酯水解产生的FFA在中性pH下部分去质子化，因此当更多的FFA吸附在脂滴界面，PL-S组zeta电位就相对更低。模拟肠消化后期，各组滴释放的FFA在界面上达到了吸附-溶解的平衡，因而zeta电位不再发生明显变化。

实施例13界面组分及粒径对脂肪酸释放模式的影响

不同界面组分及粒径大小脂滴在模拟婴幼儿胃肠道消化过程中产生的游离脂肪酸(Free Fatty Acid，FFA)模式如图19及图20所示。图19中A、B所示分别为CN-L、CN-S的脂肪酸释放模式。结果表明，粒径对消化过程中CN组脂滴的脂肪酸释放模式无显著性影响。从结果可以看出，就CN-L而言，脂滴在消化过程中主要释放出的脂肪酸种类及其各自在总脂肪酸中的占比为辛酸(C8:0，1.03％)、葵酸(C10:0，0.93％)、月桂酸(C12:0，11.74％)、肉豆蔻酸(C14:0，4.05％)、棕榈酸(C16:0，18.57％)、硬脂酸(C18:0，3.17％)、油酸(C18:1N9C，40.27％)、亚油酸(C18:2N6C，19.68％)、花生酸(C20:0，0.57％)、α-亚麻酸(C18:3N3，0.00％)、二十碳一烯酸(C20:1，0.00％)等11种。其中，含量较高的主要为12碳以上的长链脂肪酸，即C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1N9C、C18:2N6C、C18:3N3。

总脂肪酸表示当脂滴中全部的脂肪酸被释放出时，各类脂肪酸的占比情况。从图19中可以看出，CN组脂滴在胃中消化了60min时，C16:0及C18:2N6C分别以19.95％及20.19％的比例被优先释放出来。随着消化进行，C16:0在胃120min时仍以20.25％的比例被优先释放出来，而C12:0、C14:0、C18:2N6C、C18:0及C18:3N3的释放速度则基本稳定，在胃消化终点时的占比依次为11.42％、4.05％、20.04％、2.70％及1.88％，最大量的C18:1N9C则不断被缓慢释放。当消化环境转换到模拟肠道内，脂肪酸释放模式基本没有发生改变，但C16:0的释放进一步加快，肠消化终点时其在总脂肪酸中的占比达到25.02％，而C18:1N9C的释放优先程度始终较低。

图20中A、B所示分别为PL-L、PL-S的脂肪酸释放模式。粒径带来的影响同样并不明显。PL组在消化过程中释放出了22种脂肪酸，除了CN组中的11种外，还有丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、肉豆蔻油酸(C14:1N15)、十五碳酸(C15:0)、棕榈油酸(C16:1N7)、十七碳酸(C17:0)、十七碳一烯酸(C17:1N7)、反式油酸(C18:1N9T)、反式亚油酸(C18:2N6T)、二十二碳酸(C22:0)及EPA(C20:5N3)。其中含量较高的仍是长链脂肪酸，另外增加了一种中链葵酸(C10:0)。

PL-L的初始脂肪酸组成为C4:0(1.46％)、C6:0(1.18％)、C8:0(1.12％)、C10:0(2.00％)、C12:0(7.10％)、C14:0(8.39％)、C14:1N15(0.74％)、C15:0(0.72％)、C16:1N7(1.37％)、C16:0(26.12％)、C17:0(0.79％)、C17:1N7(0.18％)、C18:0(7.17％)、C18:1N9T(1.81％)、C18:1N9C(27.97％)、C18:2N6T(0.27％)、C18:2N6C(8.74％)、C20:0(0.18％)、C18:3N3(1.40％)、C20:1(1.00％)、C22:0(0.12％)、C20:5N3(0.18％)。从图20中可以看出，PL组脂滴在胃中消化了60min时，C14:0、C16:0、C18:3N3分别以9.22％、27.58％、1.43％的占比被优先释放出来。随着模拟胃内消化的进行，三种脂肪酸始终以较高速度被释放出来，而C10:0、C12:0、C16:1N7、C18:2N6C、C18:0及C18:3N3的释放速度基本稳定，胃120min时在总脂肪酸中的占比依次为1.93％、6.74％、1.58％、8.39％、6.99％、1.43％，含量较高的C18:1N9C则不断被缓慢释放。当消化环境转换到模拟肠道内时，C14:0及C16:0的释放进一步加快，120min时在总脂肪酸中的比例增加到12.66％和35.65％，而C18:0及C18:1N9C的释放明显变慢，在肠消化终点时的占比降低为5.42％和23.77％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种人工脂滴，其特征在于，包括：

芯体；

乳化剂层，所述乳化剂层形成在所述芯体的外表面，其中，所述乳化剂层中含有磷脂。

2.根据权利要求1所述的人工脂滴，其特征在于，所述乳化剂层是由酪乳粉形成的。

3.根据权利要求1所述的人工脂滴，其特征在于，所述磷脂包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的至少之一。

4.根据权利要求1所述的人工脂滴，其特征在于，所述人工脂滴的直径为100纳米～1微米。

5.根据权利要求1所述的人工脂滴，其特征在于，所述芯体是由1，3-二油酸2-棕榈酸形成的。

6.根据权利要求1所述的人工脂滴，其特征在于，基于所述人工脂滴的总重量，所述磷脂的含量为3％～5％。

7.根据权利要求6所述的人工脂滴，其特征在于，基于所述人工脂滴的总重量，所述磷脂的含量为4％。

8.一种乳制品，其特征在于，含有权利要求1所述的人工脂滴。

9.根据权利要求8所述的乳制品，其特征在于，所述乳制品为婴儿配方奶粉。

10.一种形成权利要求8～9任一项所述的乳制品的方法，其特征在于，包括：将磷脂与植物油进行混合、剪切预乳化和二级均质处理，以便获得所述乳制品，所述乳制品含有权利要求1～7任一项所述的人工脂滴；

任选地，所述磷脂包括选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的至少之一；

优选地，所述植物油为1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯。