CN109414492A - 针对cd81的人源化和嵌合单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了人源化或嵌合抗CD81(分化簇81)单克隆抗体。所述抗体结合至人CD81，并且可用于各种治疗方法中，包括但不限于减少或预防肿瘤转移。还提供了重链和轻链可变区序列以及相关的互补决定区(CDR)序列。

Description

针对CD81的人源化和嵌合单克隆抗体
交叉引用
本申请要求2016年6月16日提交的美国临时专利申请号62/351,054的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
CD81是四跨膜蛋白(tetraspanin)分子，属于进化上保守的蛋白质家族。所有多细胞生物都表达此家族的成员。四跨膜蛋白通过四个跨膜结构域包埋在质膜中，所述跨膜结构域位于短的氨基和羧基细胞质末端以及小的和大的细胞外环(分别为SEL和LEL)的侧翼。LEL的三维结构由两个较长螺旋的柄和新颖的蘑菇样头部结构组成，所述头部结构借助于两个二硫桥折叠(参见Zimmerman等人(2016)Cell167(4):1041-1051.e11)。大多数抗CD81mAb与LEL反应，如通过与重组LEL蛋白的反应性所证明的。
四跨膜蛋白在亚细胞膜微结构域中彼此缔合，所述亚细胞膜微结构域是充当信号传导平台的动态膜实体。这些富含四跨膜蛋白的微结构域(TEM)包括缔合蛋白(伴侣蛋白)。这些伴侣关系在不同细胞类型以及它们的缔合强度方面不同。通常，四跨膜蛋白倾向于与细胞类型特异性的伴侣关系中的整联蛋白缔合。因此，在表达几种整联蛋白的细胞中，可能仅发现这些整联蛋白中的一种与特定四跨膜蛋白分子缔合。其他配偶体包括免疫球蛋白超家族的成员，如CD19和EWI-2，所述成员通常与四跨膜蛋白分子缔合。
TEM促进细胞外刺激向细胞内信号传导途径的传递。例如，它们使得能够通过活化ERM家族蛋白埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白募集细胞骨架肌动蛋白。此外，CD81与EWI-2的缔合显示将a-辅肌动蛋白募集至T细胞免疫突触。因此，包埋在TEM中的CD81将在细胞膜处接收的信号传递至下游信号传导分子和衔接蛋白，从而有助于特异性免疫功能。例如，当抗原与其同源BCR接合并且同时结合CD19/CD81/CD21复合物时，B细胞活化的阈值被降低，从而增强下游信号传导事件。
最近，显示在人黑素瘤细胞系中表达外源性CD81增强其在异种移植物模型中的迁移、侵入和转移能力。这一证据和其他证据表明CD81可促成肿瘤细胞运动。
除了在肿瘤细胞上表达CD81之外，有证据表明CD81调节宿主适应性和先天性免疫应答。肿瘤细胞通过募集调控性T细胞(Treg)和先天性骨髓源性抑制细胞(MDSC)来抵消先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，其促进免疫逃逸和转移性播散。已经表明CD81虽然不是这些细胞的正常发育所必需的，但对于它们的免疫抑制功能是必需的。调节CD81在Treg和MDSC上的功能可提供重要的临床应用，因为旨在阻断Treg-T细胞相互作用的疗法已被证明可逆转肿瘤诱导的免疫抑制。
本发明提供临床上有用的抗CD81抗体。
发明内容
提供了与人源化或嵌合抗CD81单克隆抗体有关的组合物和方法。本发明的抗体包含源自5A6单克隆抗体的序列，结合至人CD81，抑制肿瘤细胞的侵袭并且减少体内的肿瘤生长和转移。因此，这些抗体可用于治疗癌症的各种治疗方法中。本发明的实施方案包括分离的抗体及其衍生物和片段；包含所述人源化或嵌合抗CD81单克隆抗体中的一种或多种的药物制剂；以及产生这些单克隆抗体的细胞系。还提供了所述抗体的氨基酸序列。
目标抗体包括所提供的人源化或嵌合抗体以及其变体。本发明的单克隆抗体特别适用作用于人的与CD81相关的疾病的诊断和免疫疗法(特别是癌症疗法中)的试剂。本发明的单克隆抗体的优点源于人源化过程和人Fc区的使用。因此，将本发明的单克隆抗体体内用于免疫疗法大大减少了对所述抗体的显著宿主免疫应答的问题。
本文考虑了各种形式的抗体。例如，所述抗CD81抗体可以是全长嵌合或人源化抗体，例如具有任何同种型的人免疫球蛋白恒定区，例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA等；或抗体片段，例如F(ab')2片段和F(ab)片段等。包含CDR区的片段也是感兴趣的，例如用于成像目的。此外，所述抗体可用可检测标记进行标记。本发明的抗体可包含添加至通过可裂解接头连接的N末端区域的额外氨基酸序列，所述氨基酸序列减少与体内随机位点的结合并且仅允许在具有裂解接头并释放抗体的组织酶的位点(即肿瘤细胞)中结合，所述抗体然后自由结合至其靶抗原。抗体可固定在固相上和/或与异源化合物缀合。所述抗体还可提供为可与第二抗原反应的双特异性或多特异性抗体，所述抗原特别包括免疫治疗抗原性上的癌抗原。
本发明的实施方案包括分离的抗体及其衍生物和片段，所述抗体包含如本文提供的至少一个、通常至少3个CDR序列，所述序列通常与来自人可变区的框架序列组合或呈分离的CDR肽形式。在一些实施方案中，抗体包含至少一条轻链，所述至少一条轻链包含本文提供的位于可变区框架中的3个轻链CDR序列，所述可变区框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架；以及至少一条重链，所述至少一条重链包含本文提供的位于可变区框架中的3个重链CDR序列，所述可变区框架可以是但不限于人或小鼠可变区框架。
人源化抗体可包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5、SEQID NO:2和SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6作为可变区。可选择可与SEQ ID NO:1、2或3中的任一个配对的重链恒定区以获得所需功能中的功效，例如，人IgG1显示在人效应细胞背景下改善ADCC；并且改善CDC。小鼠IgG2A显示在小鼠效应细胞的背景下改善功效。
本发明进一步提供：编码所述抗体及其变体的分离的核酸；一种包含所述核酸的载体，所述核酸任选地与由用所述载体转化的宿主细胞识别的控制序列可操作地连接；一种包含所述载体的宿主细胞；一种用于产生所述抗体的方法，所述方法包括培养所述宿主细胞以使得表达所述核酸，以及任选地从所述宿主细胞培养物中(例如从所述宿主细胞培养基中)回收所述抗体。本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含一种或多种人抗CD81抗体和药学上可接受的载体或稀释剂。用于治疗用途的这种组合物是无菌的并且可以是冻干的，例如与稀释剂和递送装置(例如吸入器、注射器等)一起以单位剂量提供为预包装。
还提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括施用一个或多个有效剂量的本发明的抗CD81抗体持续足以减少肿瘤生长和/或转移的时间段。在一些实施方案中，所述肿瘤是表达CD81的肿瘤。在其他实施方案中，所述肿瘤不表达CD81，例如其中所述抗体靶向患者的Treg和/或MDSC细胞以减少免疫抑制。在一些此类实施方案中，本发明的疗法与一种或多种另外的抗肿瘤治疗组合，所述抗肿瘤治疗是例如化学疗法、放射疗法、外科手术、抗肿瘤抗体、免疫调控抗体等。
附图说明
图1.本发明的抗体的序列比对。
图2A.小鼠抗人CD81单克隆抗体5A6抑制人乳腺癌细胞的侵袭。3D侵袭测定证明抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ IDNO:1/SEQ ID NO:4)抑制人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)侵袭到细胞外基质(ECM)中。在指示的时间取得MDA-MB-231球状体的侵袭测定图像。上图：含有小鼠IgG1对照抗体的ECM；下图：含有抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)的ECM。图2B.侵袭的抑制是5A6的特性，其他抗CD81抗体不抑制人乳腺癌细胞的侵袭。MDA-MB-231人乳腺癌细胞的3D侵袭测定证明抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)在3D侵袭测定中在其抑制人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的侵袭的能力方面在抗CD81Ab中是独特的。图：No ECM＝在不存在细胞外基质情况下的乳腺癌细胞球状体，IC＝包埋有对照小鼠IgG1抗体(同种型对照)的ECM，5A6＝包埋有抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ IDNO:1/SEQ ID NO:4)的ECM，1D6、JS81和1.3.3.22＝包埋有具有小鼠恒定区IgG1的所指示抗人CD81抗体的ECM。条形图描绘了所指示的抗人CD81抗体和对照的侵袭面积。t检验***p值＝0.0001。
图3A.小鼠抗人CD81单克隆抗体5A6延长了用人B细胞淋巴瘤(Raji)激发的SCID小鼠的存活。将表达荧光素酶的人B细胞淋巴瘤(Raji-Luc)注射到SCID小鼠中(1.5x106/小鼠)，用100μg的小鼠抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)、100μg的对照小鼠IgG1以及100μg利妥昔单抗每周一次处理肿瘤x4。通过生物发光可视化肿瘤，示出第23天成像(在接受2个剂量的抗体后)。小鼠的存活表明通过小鼠抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)和利妥昔单抗(人恒定区IgG1)处理的相似功效。对数秩检验5A6对比对照小鼠IgG1***p值＝0.0001；利妥昔单抗对比对照小鼠IgG1***p值＝0.0002。图3B.转换恒定区增强5A6和嵌合抗人CD81抗体的治疗功效，比利妥昔单抗更好地保护SCID小鼠免于被人B细胞淋巴瘤(Raji)激发。将表达荧光素酶的人B细胞淋巴瘤(Raji-Luc)注射到SCID小鼠中(1.5x106/小鼠)。用100μg的抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1或IgG2a、或具有人轻链恒定区κ和人重链恒定区IgG1或IgG4的SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:4)每周一次处理肿瘤x4。对照组每周一次接受100μg的小鼠IgG1(MsIgG1)或利妥昔单抗(人恒定区IgG1)x3。在第22天通过生物发光可视化的肿瘤显示通过小鼠抗人CD81I(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)、随后嵌合5A6抗体(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)处理的优越性。t检验*p值＝0.149。
图4A.小鼠抗人CD81单克隆抗体5A6在异种移植物模型中减少人乳腺癌转移。将人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)在基质胶中注射到SCID小鼠的乳腺垫中(2.5x106/小鼠)。在肿瘤接种后第7天开始，用100μg的抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:4)或对照小鼠IgG1mAb每周一次处理小鼠持续4周。在第75天处死小鼠，将肺充气并注射印度墨水以可视化肿瘤转移(作为白斑观察到)。左：从用对照mAb处理的小鼠获得的肺，右：从用抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)处理的小鼠获得的肺。图4B.转换5A6的恒定区减少用人乳腺癌细胞激发的SCID小鼠中的肿瘤生长和转移。将表达荧光素酶的人乳腺癌MDA-MB-231(MDA-MB-231-Luc)的更具侵袭性克隆的细胞在基质胶中注射到SCID小鼠的乳腺垫中(1.5x106/小鼠)。在肿瘤接种后第7天开始，用100μg的抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG的SEQ IDNO:1/SEQ ID NO:4)、(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ ID NO:1/SEQID NO:4)或对照小鼠IgG1mAb每周一次处理小鼠持续3周(如上图中所示)。每隔一天测量肿瘤体积(示出第23天，左下图)。在第26天处死小鼠，并使用生物发光成像测量肺、肝脏和脾脏中的转移。5A6小鼠抗人CD81的IgG2a同种型(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)在减少肿瘤生长(左下图)和转移至肺、肝脏和脾脏方面最有效。t检验*p值＝0.01，**p值＝0.0023。
图5A.小鼠抗人CD81抗体5A6比其他抗人CD81抗体更好地介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在直接杀伤Raji细胞方面5A6也比其他抗人CD81抗体和利妥昔单抗更好。抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)在其介导人B细胞淋巴瘤(Raji)的ADCC的能力方面在抗CD81抗体中是独特的。抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ IDNO:1/SEQ ID NO:4)的直接杀伤优于利妥昔单抗和其他抗人CD81抗体的直接杀伤。将Raji细胞与1μg/ml的单独的所指示mAb一起或在纯化的人NK细胞(NK:Raji 5:1)存在下孵育过夜，通过膜联蛋白V/7AAD阳性定量细胞死亡。t检验*p值＝0.034，***p值＝0.000。图5B.将5A6的恒定区转换为人IgG1的恒定区增加了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。嵌合抗人CD81mAb(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)比小鼠抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)更有效，它在NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方面也比利妥昔单抗更有效。将Raji细胞与0.5μg/ml的单独的所指示mAb一起或在纯化的人NK细胞(NK:Raji 2:1)存在下孵育过夜，通过膜联蛋白V/7AAD阳性定量细胞死亡。图5C.与利妥昔单抗相比，人源化抗人CD81抗体更好地介导ADCC并直接杀伤Raji细胞。人源化抗人CD81mAb(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的H1L1SEQ IDNO:2/SEQ ID NO:5)和H2L1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5)与嵌合抗人CD81mAb(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)一样有效。嵌合抗人CD81mAb介导ADCC，与批产物无关。人源化和嵌合抗人CD81在介导ADCC和直接杀伤Raji细胞方面比利妥昔单抗更有效。将Raji细胞与1μg/ml的单独的所指示mAb一起或在纯化的人NK细胞(NK:Raji 10:1)存在下孵育过夜，通过膜联蛋白V/7AAD阳性定量细胞死亡。
图6A.由小鼠抗人CD81IgG1抗体介导的补体依赖性细胞毒性通过将恒定区转换为小鼠IgG2a的恒定区并且通过使用人IgG1恒定区嵌合所述抗体而高度增强。小鼠抗人CD81抗体MSIgG2a(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)和嵌合HuIgG1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)高度增强补体依赖性细胞毒性(CDC)。相比之下，抗人CD81MsIG1(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)和嵌合HuIgG4(具有人重链恒定区IgG4和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:4)以及利妥昔单抗较差地介导CDC。t检验**MsIgG1对比5A6MsIgG2a，p值＝0.0051，**MsIgG1对比5A6HuIgG1，p值＝0.0015。图6B.由嵌合抗人CD81IgG1和人源化抗人CD81IgG1抗体介导的补体依赖性细胞毒性高度优于由小鼠抗人CD81IgG1介导的补体依赖性细胞毒性。嵌合HuIgG1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)和人源化抗CD81抗体(具有人重链恒定区IgG1和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5)与小鼠抗人CD81抗体MSIgG1(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQID NO:4)和利妥昔单抗相比是CDC的优异介体。t检验***p值＝0.0001。
图7A.Raji细胞在结合小鼠抗人CD81抗体5A6方面比PBMC(源自健康供体)更有效(特别是在较低的抗体浓度下)，并且即使以1:1000的比例存在时，对抗CD81介导的CDC也更敏感。为了确定小鼠抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)与PBMC对比Raji细胞的相对结合，用紫色追踪染料(VTD)标记PBMC并且用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记Raji细胞并以1:1的比例混合。然后将抗体的系列稀释液添加至所述混合的细胞中。如在细胞结合测定中所观察到(左图)，抗体在低浓度下结合至Raji细胞，而PBMC仅在较高抗体浓度下结合。为了确定PBMC对比Raji细胞对小鼠抗人CD81(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:4)进行的CDC介导的杀伤的敏感性，用VTD标记PBMC并且用CFSE标记Raji细胞并以增加的PBMC与Raji细胞比例混合。在1:1的混合物下，抗体杀死90％的Raji细胞，但仅杀死6％的PBMC(中图)。值得注意的是，即使与PBMC以1:1000的比例存在时，Raji细胞对抗CD81介导的CDC也更敏感(右图)。图7B.源自患者的淋巴瘤B细胞比同一活检标本中存在的正常T细胞对CD81介导的CDC更敏感。CD81在滤泡性淋巴瘤(FL)肿瘤B细胞以及FL样品的活检内的正常T细胞上表达。示出3个FL活检标本的B细胞和T细胞上以及健康供体(HD)PBMC上的CD81表达的直方图。小鼠抗人CD81抗体(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ IDNO:1/SEQ ID NO:4)在同一FL患者的肿瘤B细胞和正常T细胞上的CDC介导的杀伤揭示肿瘤B细胞比正常T细胞对5A6介导的杀伤更敏感。使用嵌合抗人CD81抗体(具有人重链恒定区IgG1和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:1/SEQID NO:4)获得相同的结果。B细胞(正方形)，T细胞(三角形)。
具体实施方式
本发明涉及对CD81具有特异性的人源化单克隆抗体。还公开了一种核酸，以及此类抗体的氨基酸序列。所述抗体可用于与CD81相关的治疗方法和诊断方法中。
“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者。需要治疗者包括已患有病症者以及待预防病症者。
“哺乳动物”出于治疗目的是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“抗体”以最广泛意义使用且具体地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体表现出对特定抗原的结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子两者。后种多肽例如由淋巴***以低水平产生且由骨髓瘤以高水平产生。
如在本发明中所用，术语“表位”是指抗体的互补位所结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组群(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。
“天然抗体和免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至一条重链，而二硫键联的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规律性间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，之后跟随多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域；所述轻链的恒定结构域与所述重链的第一恒定结构域对准，并且所述轻链可变结构域与所述重链的可变结构域对准。认为特定氨基酸残基在轻链可变结构域与重链可变结构域之间形成界面(Clothia等人,J.Mol.Biol.186:651(1985)；Novotny和Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4592(1985))。
术语“可变”是指这样的事实，可变结构域的某些部分在抗体间的序列上广泛不同，并且用于各特定抗体对它的特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的整个可变结构域中均匀分布。在轻链可变结构域和重链可变结构域中，可变性集中在称为互补决定区(CDR)或高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含由三个CDR连接的四个FR区，所述FR区主要采用β-折叠构型，所述CDR形成连接-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区保持紧靠在一起，并且与来自另一条链的CDR促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,Md.(1991))。虽然恒定结构域并不直接参与抗体与抗原结合，但表现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
本发明的抗体可具有效应子功能增强的Fc序列，例如通过增加其与FcγRIIIA的结合能力以及增加ADCC活性。例如，在Fc的Asn-297处连接至N-连接的聚糖的岩藻糖在空间上阻碍Fc与FcγRIIIA的相互作用，并且通过糖基工程化除去岩藻糖可增加与FcγRIIIA的结合，这转换成与野生型IgG1对照相比高>50倍的ADCC活性。通过IgG1的Fc部分中的氨基酸突变进行的蛋白质工程化已生成增加Fc与FcγRIIIA的结合亲和力的多种变体。值得注意的是，三丙氨酸突变体S298A/E333A/K334A展现出与FcγRIIIA的结合的2倍增加和ADCC功能。S239D/I332E(2X)和S239D/I332E/A330L(3X)变体具有与FcγRIIIA的结合亲和力的显著增加以及ADCC能力的体外和体内扩增。由酵母展示鉴别的其他Fc变体也在小鼠异种移植物模型中显示改进的与FcγRIIIA的结合和增强的肿瘤细胞杀伤。参见，例如Liu等人(2014)JBC 289(6):3571-90，其以引用的方式具体地并入本文。
示例性抗CD81重链和轻链组合的CDR序列在序列表中列出，并且在图1中示出，其中示例性CDR区加下划线。在一些实施方案中，该组CDR序列对于重链提供在SEQ ID NO:1、2或3的可变区中；并且对于轻链，提供在SEQ ID NO:4、5或6的可变区中。在一些实施方案中，所述CDR序列维持在组合中，即人源化抗体将包含重链CDR序列和轻链CDR序列两者。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个称为“Fab”片段的相同抗原结合片段，所述片段各自具有单个抗原结合位点和残余“Fc”片段，其名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是含有完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv物质中，此区由处于紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在单链Fv物质(scFv)中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可通过柔性肽接头共价连接，以使得所述轻链和重链可以与双链Fv物质中的“二聚”结构类似的“二聚”结构缔合。在此构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，虽然亲和力比整个结合位点低，但即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的一半Fv)也能够识别并结合抗原。关于scFv的综述，参见Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编著Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
Fab片段也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基末端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab'-SH是本文对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初作为之间具有铰链半胱氨酸的成对的Fab'片段产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
存在五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。在本发明的一些实施方案中，选择重链恒定区以提供高ADCC活性，包括但不限于人IgG1。在其他实施方案中，可选择低ADCC活性，例如用人IgG4，或用“死亡”Fc，其中效应子功能不存在或减少。
其他Fc变体是可能的，包括但不限于其中缺失能够形成二硫键的区域的变体或其中在天然Fc形式的N-末端处消除某些氨基酸残基或将甲硫氨酸残基添加到其中的变体。因此，在本发明的一个实施方案中，scFc分子的一个或多个Fc部分可包含铰链区中的一个或多个突变以消除二硫键合。在另一个实施方案中，Fc的铰链区可整体除去。在另一个实施方案中，scFc分子可包含Fc变体。
另外，Fc变体可被构造为通过取代、缺失或添加氨基酸残基来除去或基本上减少效应子功能，以实现补体结合或Fc受体结合。例如但不限于，缺失可出现在补体结合位点，诸如C1q结合位点中。制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术公开于国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中。另外，Fc结构域可通过磷酸化、硫酸盐化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等来修饰。
如本文所用，“抗体片段”及其所有语法变型被定义为包含完整抗体的抗原结合位点或可变区的完整抗体的一部分，其中所述部分不含完整抗体的Fc区的恒定重链结构域(即CH2、CH3和CH4，取决于抗体同种型)。抗体片段的实例包括Fab,Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；为具有由一个不间断的连续氨基酸残基序列组成的一级结构的多肽的任何抗体片段(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子，(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽或其含有所述轻链可变结构域的三个CDR的片段而无相关的重链部分以及(3)仅含有一个重链可变区或其含有所述重链可变区的三个CDR的片段而无相关的轻链部分；以及由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中，所述一条或多条重链可含有在完整抗体的非Fc区中发现的任何恒定结构域序列(例如IgG同种型中的CH1)，和/或可含有在完整抗体中发现的任何铰链区序列，和/或可含有与所述铰链区序列或所述一条或多条重链的恒定结构域序列融合或位于其中的亮氨酸拉链序列。
除非具体相反地指出，否则如本文所述和要求保护的术语“缀合物”被定义为通过将一个或多个抗体片段共价连接至一个或多个聚合物分子而形成的异质分子，其中所述异质分子分子是水溶性的，即可溶于生理流体如血液中，并且其中所述异质分子不含任何结构化聚集体。目标缀合物是PEG。在前述定义的上下文中，术语“结构化聚集体”是指(1)水溶液中具有球状体或球状体壳结构的任何分子聚集体，以使得异质分子不呈胶束或其他乳液结构形式，并且不固定至脂质双层、囊泡或脂质体；以及(2)在与水相接触时不会将异质分子释放到溶液中的呈固体或不溶性形式的任何分子聚集体，如色谱珠粒基质。因此，如本文所定义的术语“缀合物”涵盖呈沉淀物、沉降物、生物可蚀解基质或能够在固体水合时将异质分子释放到水溶液中的其他固体形式的上述异质分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”(mAb)是指从基本上均质抗体的群体中获得的抗体，即除了可少量存在的可能天然发生的突变以外，构成所述群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是针对单个抗原位点高度特异性的。每种mAb针对抗原上的单一决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体还是有利地，在于它们可通过杂交瘤培养物合成，未被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，有待根据本发明使用的单克隆抗体可在永生化B细胞或其杂交瘤中制备，或者可通过重组DNA方法制备。
本文的单克隆抗体包括通过以下方式产生的杂合和重组抗体：将抗CD81抗体的可变(包括高变)结构域与恒定结构域(如“人源化”抗体)、或轻链与重链、或来自一种物种的链与来自另一种物种的链剪接在一起，或与异源蛋白融合，而不论来源的物种或免疫球蛋白类别或亚类名称；以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性。
本文的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述一条或多条链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及这类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性。在一些实施方案中，嵌合抗体包含与人恒定区序列融合的小鼠可变区，例如如在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4中所列出。
“分离的”抗体是已经鉴别并且与其天然环境的组分分离和/或从其天然环境的组分回收的抗体。其天然环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，所述抗体将被纯化至(1)如通过Lowry方法测定的大于抗体的75重量％，并且最优选大于80重量％、90重量％或99重量％，或(2)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色剂测定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体自然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
当在本文中使用时，术语“表位标记的”是指与“表位标签”融合的抗CD81抗体。标签多肽具有足够的残基以提供表位(抗体可针对所述表位而产生)，但也足够短以使得其不会干扰CD81抗体的活性。表位标签优选地是足够独特的，以使得对表位具有特异性的抗体基本上不与其他表位交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基并且通常介于约8-50个氨基酸残基之间(优选介于约9-30个参见之间)。实例包括c-myc标签和其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体(Evan等人,Mol.Cell.Biol.5(12):3610-3616(1985))；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等人,Protein Engineering 3(6):547-553(1990))。
词语“标记”当在本文使用时是指直接地或间接地与抗体缀合的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)或在酶促标记的情况下可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
“固相”是指本发明的抗体可粘附至其的非水性基质。本文涵盖的固相的实例包括部分或全部由玻璃(例如可控多孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅通形成的那些。在某些实施方案中，取决于上下文，固相可包括测定板的孔；在其他情况下，它是纯化柱(例如亲和色谱柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，如美国专利号4,275,149中所描述的那些。
多肽
在一方面，本发明涉及与CD81特异性反应的人源化或嵌合单克隆抗体，以及产生此类抗体的细胞系。提供了示例性抗体的可变区。目标抗体包括这些提供的组合，以及所述可变区与适当恒定区或恒定区片段的融合体，例如以产生F(ab)’抗体。目标可变区包含所提供的抗CD81抗体的至少一个CDR序列，其中CDR可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个氨基酸。或者，目标抗体包含如所提供的抗体中列出的可变区，或如本文阐述的可变区序列对。
目标可变区包含来自本文提供的可变区的至少一个CDR序列，通常至少2个CDR序列、更通常3个CDR序列。图1中示出示例性CDR名称，其对应于上文的下划线的残基，然而本领域技术人员将理解，CDR的许多定义通常在使用中，包括Kabat定义(参见“Zhao等人Agermline knowledge based computational approach for determining antibodycomplementarity determining regions.”Mol Immunol.2010；47:694–700)，其是基于序列变异性并且是最常用的。Chothia定义是基于结构环区域的位置(Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.”Nature.1989；342:877–883)。替代目标CDR定义包括但不限于由以下公开的那些：Honegger,“Yet anothernumbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modelingand analysis tool.”J Mol Biol.2001；309:657–670；Ofran等人“Automatedidentification of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiarcharacteristics of CDRs and B cell epitopes.”J Immunol.2008；181:6230–6235；Almagro“Identification of differences in the specificity-determining residuesof antibodies that recognize antigens of different size:implications for therational design of antibody repertoires.”J Mol Recognit.2004；17:132–143；以及Padlan等人“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”FasebJ.1995；9:133–139.，所述文献各自具体地以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，目标多肽具有至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸的连续序列，直至SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6中任一个中列出的完整提供的可变区。目标多肽还包含与本文列出的氨基酸序列相比相差至多1个、至多2个、至多3个、至多4个、至多5个、至多6个或更多个氨基酸的可变区序列。在其他实施方案中，目标多肽与本文列出的氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％相同。
除Fab以外，本发明还考虑了对CD81的至少一个表位具有结合特异性的较小抗体片段和表位结合肽，并且也可用于本发明的方法中。例如，单链抗体可根据Ladner等人的美国专利号4,946,778的方法来构建，所述专利以引用的方式整体并入本文。单链抗体包含通过柔性接头部分连接的轻链和重链的可变区。更小的是称为单结构域抗体的抗体片段，其包含分离的VH单结构域。用于获得具有它们所来源的完整抗体的至少一些结合特异性的单结构域抗体的技术是本领域已知的。例如，Ward,等人在"Binding Activities of aRepertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted fromEscherichia coli,"Nature 341:644-646中公开了一种用于筛选以获得抗体重链可变区(H单结构域抗体)的方法，所述抗体重链可变区对其靶表位具有足够的亲和力以呈分离形式与其结合。
本发明还提供了编码所述人源化或嵌合抗CD81抗体的分离的核酸，包含所述核酸的载体和宿主细胞，以及用于产生所述抗体的重组技术。目标核酸可与提供的核酸序列至少约80％相同，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或相同。在一些实施方案中，可以使用编码SEQ ID NO:1-6中任一个的多肽的至少约20nt、至少约25nt、至少约50nt、至少约75nt、至少约100nt并且直至所提供的完整序列的连续核苷酸序列。此类连续序列可编码CDR序列，或者可编码完整可变区。如本领域中所已知，可变区序列可与任何适当的恒定区序列融合。
为了重组产生抗体，将编码所述抗体的核酸***可复制载体中以用于进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
本发明的抗CD81抗体不仅可以直接重组产生，而且可以作为与异源或同源多肽的融合多肽产生，所述异源或同源多肽包括信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性裂解位点的其他多肽、免疫球蛋白恒定区序列等。优选选择的异源信号序列可以是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶裂解)的序列。对于不识别和加工天然抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列被选择的原核信号序列取代。
“分离的”核酸分子是被鉴别且与在抗体核酸的天然来源中通常与其缔合的至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子。分离的核酸分子呈不同于它在自然界中所存在的形式或配置的形式。因此，分离的核酸分子不同于当它存在于天然细胞中时的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括通常表达抗体的细胞中含有的核酸分子，在所述细胞中，例如核酸分子处于不同于天然细胞的位置的染色***置中。
用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核生物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或经亚克隆以用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham等人,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1.982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝细胞瘤系(HepG2)。将宿主细胞用用于抗CD81抗体产生的上述表达或克隆载体转化并且在经适当改良以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规培养基中培养。
可使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、深吸和亲和色谱法来纯化由细胞制备的抗体组合物，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于人γ3，推荐蛋白G(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附接的基质最通常为琼脂糖，但是其他基质也是可用的。在机械上稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可实现的更快的流速和更短的加工时间。在抗体包含CH3结构域的情况下，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。取决于待回收的抗体也可用其他用于蛋白质纯化的技术，如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上色谱、肝素上色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上SEPHAROSETM色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何一个或多个初步纯化步骤之后，包含目标抗体和污染物的混合物可经受低pH疏水性相互作用色谱，所述色谱使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液、优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
使用方法
本发明的人源化或嵌合单克隆抗体可用于治疗癌症，包括与另外免疫治疗剂的组合疗法，例如作为两种或多种抗体的组合；或者作为双特异性或其他多特异性形式。本发明提供多种单特异性和多特异性(包括但不限于双特异性)抗体构型，其包含本发明的CD81结合抗体。在一些此类实施方案中，包含第二抗原结合区。在一些实施方案中，所述第二抗原结合区特异性地结合至肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述第二抗原结合区特异性地结合至免疫检查点蛋白。
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效剂量的本发明的单特异性、双特异性等抗体。在抗体为双特异性的情况下，第二抗原结合位点可特异性地结合肿瘤抗原、检查点蛋白等。在各种实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组：卵巢癌、乳腺癌、胃肠癌、脑癌、头颈癌、***癌、结肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤、癌、神经细胞肿瘤、鳞状细胞癌、生殖细胞肿瘤、转移、未分化肿瘤、***瘤、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、混合细胞肿瘤以及由传染因子引起的瘤形成。
许多肿瘤细胞产生抗原，所述抗原可在血流中释放或保留在细胞表面上。已经在大多数人癌症中鉴别了抗原，所述癌症包括伯基特淋巴瘤、成神经细胞瘤、恶性黑素瘤、骨肉瘤、肾细胞癌、乳腺癌、***癌、肺癌和结肠癌。免疫***的关键作用是检测这些抗原以允许随后靶向用于根除。然而，尽管它们具有外来结构，但对肿瘤抗原的免疫应答变化并且通常不足以阻止肿瘤生长。
肿瘤相关抗原(TAA)相对局限于肿瘤细胞，而肿瘤特异性抗原(TSA)对肿瘤细胞是独特的。TSA和TAA通常是细胞表面上作为主要组织相容性复合物的一部分表达的细胞内分子的一部分。
组织特异性分化抗原是存在于肿瘤细胞及其正常细胞对应物上的分子。已知被治疗性mAb识别的肿瘤相关抗原分为若干不同的类别。造血分化抗原是通常与分化簇(CD)组群相关的糖蛋白并且包括CD20、CD30、CD33和CD52。细胞表面分化抗原是在正常细胞和肿瘤细胞表面上发现的一组不同的糖蛋白和碳水化合物。参与生长和分化信号传导的抗原通常是生长因子和生长因子受体。为用于癌症患者中的抗体的靶标的生长因子包括CEA、表皮生长因子受体(EGFR；也称为ERBB1)'ERBB2(也称为HER2)、ERBB3、MET(也称为HGFR)、***1受体(IGF1R)、肝配蛋白受体A3(EPHA3)、肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体受体1(TRAILR1；也称为TNFRSF10A)、TRAILR2(也称为TNFRSF10B)以及核因子-κB配体的受体活化剂(RANKL；也称为TNFSF11)。参与血管生成的抗原通常是支持新微血管***的形成的蛋白质或生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR)、整联蛋白αVβ3和整联蛋白α5β1。肿瘤间质和细胞外基质是肿瘤必不可少的支撑结构。为治疗靶标的间质和细胞外基质抗原包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)和腱生蛋白。
在临床癌症免疫疗法的背景下最积极研究的免疫检查点受体，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4；也称为CD152)和程序性细胞死亡蛋白1(PD1；也称为CD279)均是抑制性受体。阻断这些受体中的任一者的抗体的临床活性意味着可在多个水平下增强抗肿瘤免疫性，并且组合策略可智能地设计，通过机械考虑和临床前模型来引导。
PD1的两种配体是PD1配体1(PDL1；也称为B7-H1和CD274)和PDL2(也称为B7-DC和CD273)。PDL1在癌细胞上表达，并且通过与T细胞上的其受体PD1结合，它抑制T细胞活化/功能。
淋巴细胞活化基因3(LAG3；也称为CD223)、2B4(也称为CD244)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA；也称为CD272)、T细胞膜蛋白3(TIM3；也称为HAVcr2)、腺苷A2a受体(A2aR)和杀伤抑制性受体家族各自与淋巴细胞活性的抑制相关，并且在一些情况下与淋巴细胞无反应性的诱导有关。这些受体的抗体靶向可用于本发明方法中。
激动免疫共刺激分子的剂也可用于本发明的方法中。此类剂包括激动剂或CD40和OX40。CD40是在抗原呈递细胞(APC)上发现的共刺激蛋白，并且是其活化所必需的。这些APC包括吞噬细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和B细胞。CD40是TNF受体家族的一部分。CD40的主要活化信号传导分子是IFNγ和CD40配体(CD40L)。通过CD40刺激活化巨噬细胞。
目标抗CCR4(CD194)抗体包括针对C-C趋化因子受体4(CCR4)的人源化单克隆抗体，其具有潜在抗炎和抗肿瘤活性。CCR2在炎性巨噬细胞上表达，所述炎性巨噬细胞可在各种炎性病状中发现，例如类风湿性关节炎；并且还被鉴别为在促进肿瘤的巨噬细胞上表达。CCR2还在调控性T细胞上表达，并且CCR2配体CCL2介导调控性T细胞募集到肿瘤中。调控性T细胞抑制对抗肿瘤T细胞的反应并且因此需要它们的抑制或消减。
为方便起见，本发明的抗体或抗体的组合可提供在药盒，即预定量的试剂与治疗用途的说明书的包装组合中。此外，可包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲剂等。特别地，所述抗体可提供为包含赋形剂的干燥粉末，通常是冻干粉末，所述粉末在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
通过将具有所需纯度的抗体与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来以冻干制剂或水溶液形式制备包含本发明的一种或多种抗体的治疗制剂以供储存的(Remington's PharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编著(1980))。所述抗体组合物将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此情形下的考虑因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、各体患者的临床病状、病症的病因、剂的递送部位、施用方法、施用时程以及医学从业者已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑因素决定，并且是预防CD81相关疾病所需的最小量。
治疗剂量可以是至少约0.01μg/kg体重、至少约0.05μg/kg体重、至少约0.1μg/kg体重、至少约0.5μg/kg体重、至少约1μg/kg体重、至少约2.5μg/kg体重、至少约5μg/kg体重并且不超过约100μg/kg体重。本领域技术人员将理解，此类指南将例如在抗体片段的使用中或在抗体缀合物的使用中根据活性剂的分子量进行调整。对于局部施用(例如鼻内、吸入等)或对于全身施用(例如肌内、腹膜内、静脉内等)，剂量也可变化。
抗体不必、但任选地与一种或多种增强活性或者以其他方式增加治疗作用的剂一起配制。它们通常以与上文所用相同的剂量和施用途径使用，或者为迄今使用的剂量的约1％至99％。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟苯甲酸烷酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这易于通过无菌过滤膜过滤来实现。
所述活性成分也可截留在例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或粗乳液中。此类技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980)中。
抗CD81抗体通过任何合适的方式施用，所述方法包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，适合地通过脉冲输注，特别是以下降剂量的抗体来施用所述抗CD81抗体。
为预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将取决于如上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重性和病程、抗体是出于预防还是治疗的目的施用、先前疗法、患者的病史和对抗体的反应以及主治医师的判断。抗体适合地一次或经由一系列治疗对患者施用。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种含有适用于治疗以上所述的病症的材料的制品。所述制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。所述容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳对治疗病状有效的组合物并且可具有无菌入口(sterile access port)(例如，容器可为具有可经皮下注射用注射针刺破的塞子的静脉输液袋或小瓶)。所述组合物中的活性剂是抗CD81体。容器上或与容器相关的标签指示组合物用于治疗所选的病状。所述制品还可包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲剂如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。所述制品还可包括从商业和使用者观点来说所期望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器以及带有使用说明书的包装插页。
现在已经充分描述了本发明，将为本领域普通技术人员显而易见，可在不脱离本发明的精神或范围的情况下进行各种变化和修改。
实验
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，而不意图限制诸位发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。虽然已尽力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度并且压力是大气压或接近大气压。
在本说明书中引用的所有公布和专利申请均以引用的方式并入本文，如同特别地且单独地指示每一个单个的公布或专利申请以引用的方式并入。
已经根据本发明人发现或提出的特定实施方案描述了本发明，以包括用于实施本发明的优选模式。本领域普通技术人员将理解，鉴于本公开，在不脱离本发明的预期范围的情况下，可在举例说明的特定实施方案中进行各种修改和改变。例如，由于密码子冗余，可在基础DNA序列中进行改变而不影响蛋白质序列。此外，由于生物功能等效性考虑，可在蛋白质结构中进行改变而不影响种类或量的生物作用。所有此类修改意图包括在附随权利要求书的范围内。
实施例1
针对人CD81的单克隆抗体的克隆和产生
本发明的抗体包含小鼠可变区，例如可作为具有人恒定区的嵌合体产生的重链SEQ ID NO:1和轻链SEQ ID NO:4；例如，彼此配对，或与本发明的人源化可变区配对。人源化重链可变区包括SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3中所列出的那些，所述重链可变区可与本文提供的任何轻链可变区配对。人源化轻链可变区包括SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所列出的那些，所述轻链可变区可与本文提供的任何重链可变区配对。(示例性CDR序列加下划线)。
(SEQ ID NO：1)
(SEQ ID NO：2)
(SEQ ID NO：3)
(SEQ ID NO：4)
(SEQ ID NO:5)
(SEQ ID NQ:6)
功能分析
使用3D侵袭测定来确定抗CD81抗体在抑制人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)侵袭到细胞外基质(ECM)中的有效性。数据在图2A和图2B中示出。在指示的时间取得MDA-MB-231球状体的侵袭测定图像。小鼠抗人抗体(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID No：1/SEQ IDNO：4)抑制人乳腺癌细胞的侵袭。如图2B所示，所述作用对5A6抗体具有特异性，并且其他抗CD81抗体不抑制人乳腺癌细胞的侵袭。
体内异种移植物模型用于评估在小鼠效应细胞背景下的抗体有效性。小鼠抗人CD81单克隆抗体延长了用人B细胞淋巴瘤(Raji)激发的SCID小鼠的存活，如图3A中所示。将肿瘤用100μg的小鼠抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：4)、100μg的对照小鼠IgG1以及100μg利妥昔单抗每周一次处理x4。对于用抗CD81抗体和利妥昔单抗治疗，存活率相似。进一步显示(参见图3B)，在小鼠效应细胞的背景下，将恒定区从小鼠IgG1转换为小鼠IgG2a增强了5A6和嵌合抗人CD81抗体的治疗功效。
在用于转移的异种移植物模型中，小鼠抗人CD81单克隆抗体5A6在异种移植物模型中减少人乳腺癌转移(如图4A种所示)。将人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)在基质胶中注射到SCID小鼠的乳腺垫中(2.5x106/小鼠)。在肿瘤接种后第7天开始，用100μg的抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)或对照小鼠IgG1mAb每周一次处理小鼠持续4周。进一步显示(参见图4B)，在小鼠效应细胞的背景下，将恒定区从小鼠IgG1转换为小鼠IgG2a增强了5A6和嵌合抗人CD81抗体在减少肿瘤生长和转移的治疗功效。
小鼠抗人CD81抗体5A6比其他抗人CD81抗体更好地介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在直接杀伤Raji细胞方面5A6也比其他抗人CD81抗体和利妥昔单抗更好，如图5A中所示。抗人CD81(SEQID NO:1/SEQ ID NO:4)在其介导人B细胞淋巴瘤(Raji)的ADCC的能力方面在抗CD81抗体中是独特的。
在人效应细胞(纯化的人NK细胞)的背景下，将恒定区转换为人Fc序列改善ADCC，如图5B中所示。嵌合抗人CD81mAb(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:1/SEQID NO:4)比小鼠抗人CD81mAb(具有小鼠恒定区IgG1的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)更有效，它在NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)方面也比利妥昔单抗更有效。
在人效应细胞(纯化的人NK细胞)的背景下，人源化抗人CD81抗体比利妥昔单抗更好地介导ADCC和直接杀伤Raji细胞，如图5C中所示。人源化抗人CD81mAb(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的H1L1SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:5)和H2L1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:5)与嵌合抗人CD81抗体一样有效，并且比利妥昔单抗更有效。
通过使用小鼠IgG2a恒定区或人IgG1恒定区，抗体在介导补体依赖性细胞毒性中的活性大大增强，如图6A中所示。相比之下，小鼠IgG1和人IgG4较差地介导CDC。
如图6B中所示，由嵌合抗人CD81IgG1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQID NO:1/SEQ ID NO:4)和人源化抗人CD81IgG1(具有人重链恒定区IgG1和人轻链区κ的SEQID NO:3/SEQ ID NO:5)抗体介导的补体依赖性细胞毒性高度优于小鼠抗人CD81IgG1介导的补体依赖性细胞毒性。
肿瘤细胞(Raji)细胞在结合小鼠抗人CD81抗体5A6方面比PBMC(源自健康供体)更有效(特别是在较低的抗体浓度下)，并且即使以1:1000的比例存在时，对抗CD81介导的CDC也更敏感，如图7A中所示。源自患者的淋巴瘤B细胞也比同一活检标本中存在的正常T细胞对CD81介导的CDC更敏感，如图7B中所示。CD81在滤泡性淋巴瘤(FL)肿瘤B细胞以及FL样品的活检内的正常T细胞上表达。小鼠抗人CD81抗体(具有小鼠恒定区IgG2a的SEQ ID NO:1/SEQID NO:4)在同一FL患者的肿瘤B细胞和正常T细胞上的CDC介导的杀伤揭示肿瘤B细胞比正常T细胞对5A6介导的杀伤更敏感。使用嵌合抗人CD81抗体(具有人重链恒定区IgG1和人轻链恒定区κ的SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:4)获得相同的结果。
序列表
<110> 小利兰斯坦福大学理事会
S·利维
A·马拉贝利
R·拉贾帕克萨
F·文塞斯-卡塔兰
郭琼玑
刘劼
R·利维
<120> 针对CD81的人源化和嵌合单克隆抗体
<130> STAN-1342WO
<150> US 62/351,054
<151> 2016-06-16
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Val Val Val Ile Phe Ile Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Val Val Val Ile Phe Ile Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Asp
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Pro Val Val Val Ile Phe Ile Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Arg
100 105 110
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Tyr Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 414
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
atggcttggg tggggacctt gctattcctg ctggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60
atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120
tgcaaggctt ctggttatat cttcacagac gattcaatac actgggtgaa gcaggctccg 180
ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacactgaga ctggtgagcc aacatatgca 240
gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300
cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacgcg gctacatatt tctgtgctag actttccccc 360
gtcgtagtca tctttattta ctggggccaa gggacgctgg tcactgtctc tgca 414
<210> 8
<211> 408
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc ccaggtgcag 60
ctggtgcaat ctgggtctga gttgaagaag cctggggcct cagtgaaggt ttcctgcaag 120
gcttctggat acaccttcac tgacgattca atacactggg tgcgacaggc ccctggacaa 180
gggcttgagt ggatgggatg gataaacact gagactggtg agccaacata tgcagatgac 240
ttcaagggac ggtttgtctt ctccttggac acctctgtca gcacggcata tctgcagatc 300
agcagcctaa aggctgagga cactgccgtg tattactgtg cgagactttc ccccgtcgta 360
gtcatcttta tttactgggg ccaaggcacc ctcgttacag tctcctca 408
<210> 9
<211> 408
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc ccagatccag 60
ctggtgcaat ctgggtctga gttgaagaag cctggggcct cagtgaaggt ttcctgcaag 120
gcttctggat acatcttcac tgacgattca atacactggg tgaagcaggc ccctggacaa 180
gggcttaagt ggatgggatg gataaacact gagactggtg agccaacata tgcagatgac 240
ttcaagggac ggtttgcctt ctccttggac acctctgtca gcacggcata tctgcagatc 300
agcagcctaa aggctgagga cactgccgtg tattactgtg cgagactttc ccccgtcgta 360
gtcatcttta tttactgggg ccaaggcacc ctcgttacag tctcctca 408
<210> 10
<211> 396
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
atggattcac aggcccaggt tcttatattg ctgctgctat gggtatctgg ttcctgtggg 60
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagtaggaga gaaggtcact 120
atgagctgca aatccagtca gagtctgctc cacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 180
tggttccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 240
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 360
tacgcgttcg gaggggggac caagctggaa atgaga 396
<210> 11
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgatattgtg 60
atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccctggag agccggcctc catctcctgc 120
aaatccagtc agagtctgct ccacagtaga acccgaaaga actacttggc ttggtacctg 180
cagaagccag ggcagtctcc acagctcctg atctattggg catccactag ggaatctggg 240
gtccctgaca ggttcagtgg cagtggatca ggcacagatt ttacactgaa aatcagcaga 300
gtggaggctg aggatgttgg ggtttattac tgcaagcaat cttataatct gtacgcgttc 360
ggccaaggga caaagttgga aataaaa 387
<210> 12
<211> 387
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
atgagggctt ggatcttctt tctgctctgc ctggccgggc gcgccttggc cgatattgtg 60
atgactcagt ctccactctc cctgcccgtc acccctggag agccggcctc catgtcctgc 120
aaatccagtc agagtctgct ccacagtaga acccgaaaga actacttggc ttggttccag 180
cagaagccag ggcagtctcc aaaactcctg atctattggg catccactag ggaatctggg 240
gtccctgaca ggttcagtgg cagtggatca ggcacagatt ttacactgaa aatcagcaga 300
gtggaggctg aggatgttgg ggtttattac tgcaagcaat cttataatct gtacgcgttc 360
ggccaaggga caaagttgga aataaaa 387

Claims (18)

1.一种分离的嵌合或人源化抗体，其特异性地结合至人CD81并且包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的至少一个CDR序列。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:4的CDR序列中的每一个。
3.如权利要求1或权利要求2所述的抗体，其中重链包含SEQ ID NO:1的CDR序列中的每一个。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述重链包含SEQ ID NO:1、2或3中列出的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述重链包含人Fc多肽。
6.如权利要求5所述的抗体，其中所述人Fc多肽是IgG。
7.如权利要求6所述的抗体，其中所述IgG多肽提供高ADCC活性。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述轻链包含SEQ ID NO:4、5或6中列出的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的抗体，其中所述轻链包含人Fc多肽。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其包含经工程改造以获得增强的ADCC活性的Fc区。
11.如权利要求10所述的抗体，其中所述Fc区包含糖基-工程改造的碳水化合物侧链。
12.如权利要求10所述的抗体，其中所述Fc区包含氨基酸取代，所述氨基酸取代增强与FcγRIIIA的结合。
13.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，其包含通过可裂解接头连接的氨基末端氨基酸残基。
14.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-13中任一项所述的抗体。
15.一种细胞，其产生如权利要求1-13中任一项所述的抗体。
16.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体。
17.一种减少肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1-13中任一项所述的抗体的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者是人。
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