CN109402143A

CN109402143A - 水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及其应用

Info

Publication number: CN109402143A
Application number: CN201811273480.3A
Authority: CN
Inventors: 潘庆华; 王兴; 李成; 文健强; 张玉; 王玲
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-03-01
Anticipated expiration: 2038-10-30
Also published as: CN109402143B

Abstract

本发明公开一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii‑C及其应用，属于农业生物技术领域。本发明提供了一个稻瘟病菌(Magnaporthe orzae)新无毒基因AvrPii‑C的核苷酸序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸多肽序列SEQ ID NO.2。本发明还涉及了根据该基因的序列及结构设计开发基因特异性分子标记在监测田间稻瘟病菌群体的小种分布及其动态变化情况的应用；选择合适的品种在合理布局水稻抗病品种中的应用；以及选择合适的菌株在筛选稻种资源稻瘟病Pii抗病等位基因及其在育种计划中的应用。

Description

水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，特别涉及一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及其应用。

背景技术

由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一。水稻-稻瘟病菌互作***是一个典型的‘基因对基因’(gene-for-gene)模式***。其中，水稻抗病基因(resistance gene，R)与其所对应的稻瘟病菌无毒基因(avirulence gene，Avr)之间发生互作时，才会引发植株的抗病反应，而后者的毒性突变将导致含有特定抗病基因的品种感病化(Valent.1990,Phytopathology,1990,80:33-36；Jiaet al.2000,The EMBO Journal,19:4004-4014；Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642)。因此，无毒基因的克隆及其序列、结构、产物的分析，是了解病原菌致病专化性以及寄主品种抗病专化性的生化基础，对于植物病害的监测、预防及控制，以及抗病育种具有重要的指导意义。

迄今为止，已鉴定了约40个稻瘟病菌无毒基因(Liu et al.2010,MolecularPlant Pathology11:419-427)，有10个稻瘟病菌无毒基因被克隆。AvrPita(Orbachetal.2000,The Plant Cell 18:167-187)、ACE1( et al.2004,The Plant Cell 16:2499-2513)、AvrPiz-t(Li et al.2009,Molecular Plant-Microbe Interactions 22:411-420)、AvrPia、AvrPii、AvrPik/km/kp(Yoshidaet et al.2009,The Plant Cell 21:1573-1591)、AvrPiCO39(Ribot et al.2013,The Plant Journal,74:1-12)、AvrPi9(Wu etal.2015,New Phytologist,206:1463-1475)、AvrPib(Zhang et al.2015,ScientificReports 5:11642)以及AvrPi54(Ray et al.2016,Frontiers in Plant Science 7:1140)。有趣的是，所有已经克隆的无毒基因(包括其他病原菌)都不具有序列及结构的保守性，而且各个稻作区的群体遗传结构及变异机制也是不同的(Wu et al.2014,MolecularPlant-Microbe Interactions,27:759-769；Wu et al.2015,New Phytologist,206:1463-1475；Zhang et al.2015,Scientific Reports 5:11642；Ray et al.2016,Frontiers inPlant Science 7:1140)。下面举2个例子来说明。

Wu等(2014,Molecular Plant-Microbe Interactions,27:759-769)对采集自广东、湖南、辽宁及黑龙江稻作区各60个稻瘟病菌菌株进行了AvrPik等位基因的群体遗传结构分析，结果表明AvrPik等位基因的遗传多样性按照广东、湖南、辽宁及黑龙江的顺序逐步增大。进一步从4个群体中选择60个代表菌株进行了重测序分析，结果表明AvrPik等位基因所受的人为选择压力也是按照上述顺序逐步增大的。同时，AvrPik等位基因在编码区内存在18个单核苷酸多态性变异(single nucleotide polymorphism,SNP)，其中7个是同义SNP，11个是非同义SNP，包括4个主要的SNP。以上结果说明，AvrPik等位基因受到了寄主植物强烈的正向选择，编码区内的SNP是其主要的变异机制。

Zhang等(2015,Scientific Reports 5:11642)对采集自广东、湖南、辽宁、吉林及黑龙江稻作区各60个稻瘟病菌菌株进行了AvrPib等位基因的群体遗传结构分析，结果表明AvrPib等位基因的遗传多样性按照广东、湖南、辽宁、吉林及黑龙江的顺序逐步减少。进一步从6个群体中随机选择108个代表菌株进行了重测序分析，结果发现在AvrPib等位基因由无毒性向毒性的变异机制中，转座子***占绝大多数(81.7％)，其后分别为编码区的部分缺失(11.1％)，编码区的完全缺失(6.7％)，以及编码区的SNP变异(0.6％)。

综上所述，只有分离、克隆更多稻瘟病菌的无毒基因并对其进行深入的功能分析，才能更加全面、准确地把握其群体遗传结构及其动态变化规律。由此，才能为各个稻作区稻瘟病的监测、预防及控制，以及抗病育种提供具有可操作性的信息。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种新型的水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C。

本发明是分离克隆稻瘟病菌株CHL346中携带的一个稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C，而该基因根据日本实验室已经克隆的AvrPii-J序列，通过PCR是扩增不出来的。

本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病菌无毒基因所编码的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供含有上述无毒基因的载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因菌株。

本发明的进一步目的是提供上述基因在建立分子检测体系及监测稻瘟病发病情况中的应用。

本发明的另一个目的是提供利用上述基因筛选抗病基因的方法。

本发明的另一个目的是提供利用上述基因培育抗病品种的方法。

本发明在日本实验室克隆了AvrPii(基因序列编号：AB498874；Yoshidaet etal.2009,The Plant Cell 21:1573-1591)的基础上，分离、克隆了该基因的一个种内同源基因(paralog)，彼此之间具有相同的功能特异性，但是存在明显的序列差异性。在此，将能够根据日本实验室克隆的AvrPii序列PCR扩增出来的目的基因命名为AvrPii-J(J,Japan；日本菌株发现之意)；而不能PCR扩增出来的目的基因命名为AvrPii-C(C,China；中国菌株发现之意)。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明涉及分离和应用一种包含基因AvrPii-C的DNA片段，该片段赋予稻瘟病菌对水稻产生特异性(专化性)的非致病性反应。AvrPii-C基因组DNA长度为1480bp如序列表SEQ ID NO.1所示，含有一个213bp的CDS(664-876bp)。该基因编码的AvrPii-C蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。该基因编码的蛋白质N末端含有19个氨基酸组成的信号肽，结构如图5所示。

根据本发明提供的AvrPii-C基因序列信息(SEQ ID NO.1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与AvrPii-C等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以AvrPii-C基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据AvrPii-C基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在AvrPii-C基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明还提供一种含有所述基因AvrPii-C的载体。

本发明能够进一步提供利用上述稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C的DNA片段获得的无毒性的转基因菌株，以及利用本发明的基因或基于该基因的重组体转化菌株。也可以利用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它菌株中。

本发明根据AvrPii-C基因序列信息(SEQ ID NO.1)与已公开的AvrPii-J基因序列信息(基因序列编号：AB498874)比对情况(如图4所示)，设计、开发了能够准确鉴定出这2个种内同源基因的基因特异性分子标记，分别命名为AvrPii-C对应引物对(AvrPii-C-F/R：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4)，AvrPii-J对应引物对(AvrPii-J-F/R：SEQ ID NO.5/SEQ IDNO.6)。

本发明提供的稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C具有重要的应用价值：

应用之一是根据所述基因序列信息开发上述基因特异性分子标记，以监测各个稻作区稻瘟病菌群体的生理小种组成及其群体遗传结构的动态变化情况。

应用之二是根据上述开发的特异性分子标记，选择合适的菌株对水稻品种进行精准的抗病基因鉴定，为其推广提供精准的抗病基因组成信息。

应用之三是根据上述开发的特异性分子标记，选择合适的菌株进行稻种资源抗病基因的筛选及鉴定，为抗病育种计划提供有效的抗源基因。

应用之四是根据上述监测的各个稻作区田间稻瘟病菌群体生理小种及其遗传结构的动态变化情况，选择合适的抗病品种进行合理的布局及轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生、危害。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了一个稻瘟病菌新无毒基因AvrPii-C的核苷酸序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸多肽序列SEQ ID NO.2。本发明还涉及了根据该基因的序列及结构设计开发基因特异性分子标记在监测田间稻瘟病菌群体的小种分布及其动态变化情况的应用；选择合适的品种在合理布局水稻抗病品种中的应用；以及选择合适的菌株在筛选稻种资源稻瘟病Pii抗病等位基因及其在育种计划中的应用。

附图说明

图1.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C的发掘、鉴定及应用示意图。

图2.稻瘟病菌无毒基因AvrPii分化为AvrPii-J及AvrPii-C的分子证据。

图2a：AvrPii-J的基因结构以及分子鉴定引物设计示意图。

图2b：10个菌株对携带Pii的单基因鉴别品种IRBLi-F5皆为无毒性。泳道1-10：分别为CHL22，EHL0317，EHL0319，EHL0329，EHL0340，CHL346，CHL690，CHL742，EHL0321，EHL0314。

图2c：但是根据已公开的AvrPii(基因序列编号：AB498874)的全长序列设计的引物(AvrPii-FL-F/R)，只能对#1-5的无毒菌株进行PCR扩增，而对#6-10的无毒菌株却不能扩增出来。

图2d：而以CDS附近序列设计引物(AvrPii-CDS-F/R)则都能够扩增出来。

由此说明AvrPii存在功能相同但是上下游序列不同的种内同源基因(paralog)的遗传分化。在此，将根据已公开的AvrPii序列能够PCR扩增出来的目的基因命名为AvrPii-J(J,Japan；日本菌株发现之意)；而将后者命名为AvrPii-C(C,China；中国菌株发现之意)。

M：DNAladder(2000bp)。

图3.AvrPii-C(代表菌株CHL346)的5’及3’侧翼序列的TAIL-PCR分析。

图3a：5’侧翼序列TAIL-PCR扩增产物电泳图(II：第2轮PCR产物大小约900bp；第3轮PCR产物物大小约800bp)。

图3b：3’侧翼序列TAIL-PCR扩增产物电泳图(II：第2轮PCR产物大小约800bp；第3轮PCR产物物大小约700bp)。

M：DNAladder(15000bp)。

根据AvrPii-J(基因序列编号：AB498874)CDS序列设计特异引物，配合AD简并引物对CHL346中的AvrPii-C 5’和3’侧翼序列进行TAIL-PCR扩增，获得特异扩增产物(箭头所示)。经测序、拼接获得AvrPii-C完整的DNA序列。

图4.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C与AvrPii-J的全长基因DNA序列比对。阴影区域#673-885为编码区。

图5.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C与AvrPii-J的比较。

图5a：基因结构示意图，包括编码区，以及5’及3’区域。基因特异性标记引物AvrPii-J-F/R，AvrPii-C-F/R，以及基因克隆转化载体引物AvrPii-J-GT-F/R，AvrPii-C-GT-F/AvrPii-C22-GT-R，AvrPii-C-GT-F/AvrPii-C346-GT-R标示其中。

图5b：蛋白质序列。信号肽(signal peptide)在基因结构中以空框表示，在蛋白质序列中以下划线表示。

图6.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及AvrPii-J的遗传转化以及转化子菌株的表现型/基因型的一致性分析。

图6a：遗传转化事件表，其中供体菌株CHL346含有AvrPii-C，而CHL22同时含有AvrPii-C及AvrPii-J；A，avirulent(无毒性)；MA，moderatelyavirulent(中度无毒性)；V，virulent(毒性)。

图6b：供体菌株(CHL346，CHL22)，受体菌株(CHL357)，以及转化子菌株在水稻单基因系IRBLi-F5(Pii)的表现型。

图6c-e：分别为基于潮霉素基因选择标记，AvrPii-C特异性标记(AvrPii-C)，AvrPii-J特异性标记(AvrPii-J)的基因型，M：DNAladder(2000bp)。

图7.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及AvrPii-J的上下游序列及结构特异性的功能验证。

CHL357：AvrPii缺失，作遗传转化的受体；

AvrPii-J22：从菌株CHL22分离、克隆的野生型AvrPii-J；

AvrPii-C22：从菌株CHL22分离、克隆的野生型AvrPii-C；

AvrPii-C346：从菌株CHL346分离、克隆的野生型AvrPii-C；

Mai1(AvrPii-J_pro/C_CDS+3’)：J_pro，J型上游区域；C_CDS+3’，C型编码区域+下游区域；二者进行基因区段融合交换而成的突变体；

Mai2(AvrPii-C_pro/J_CDS+3’)：C_pro，C型上游区域；J_CDS+3’，J型编码区域+下游区域；二者进行基因区段融合交换而成的突变体；

Mai3(AvrPii-J/C1)：以C1编码区段替入J型模板而构建的突变体；

Mai4(AvrPii-J/C2)：以C2编码区段替入J型模板而构建的突变体；

Mai5(AvrPii-J/C3)：以C3编码区段替入J型模板而构建的突变体；

Mai6(AvrPii-J_pro+CDS/C_3’)：J_pro+CDS，J型上游区域+编码区域；C_3’，C型下游区域；二者进行基因区段融合交换而成的突变体；

Mai7(AvrPii-C_pro+CDS/J_3’)：C_pro+CDS，C型上游区域+编码区域；J_3’，J型下游区域；二者进行基因区段融合交换而成的突变体；

目的基因缺失，虚线表示；表现型鉴定除了目的基因对应的抗病基因Pii(IRBLi-F5)之外，分别加入Pi2(IRBLz5-CA)及Pib(IRBLb-B)作为阳性及阴性对照；A，avirulent(无毒性)；V，virulent(毒性)；MA：moderately avirulent(中间无毒性)；MV：moderatelyvirulent(中间毒性)。该图未按照比例绘制。

图8.利用AvrPii-C及AvrPii-J的特异性序列开发的分子标记对田间稻瘟病菌株进行表现型/基因型的一致性分析。

图8a：为AvrPii-C特异性分子标记(AvrPii-C)。

图8b：为AvrPii-J特异性分子标记(AvrPii-J)。

泳道#1-9：对携带Pii的单基因鉴别品种IRBLi-F5表现为无毒性的菌株，分别为CHL346，CHL690，EHL0314，EHL0317，EHL0329，EHL0340，CHL22，EHL0319，EHL0327。

泳道#10-12：对携带Pii的单基因鉴别品种IRBLi-F5表现为有毒性的菌株，分别为EHL0312，EHL0313，EHL0339。

其中，#1-3，含有AvrPii-C；#4-6，含有AvrPii-J；#7-9，同时含有AvrPii-C及AvrPii-J；#10-12，为毒性的菌株，不含有任何AvrPii基因。

M：DNAladder(2000bp)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，在实施例中所用的技术手段皆为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，阐述了AvrPii-C基因的分离克隆、功能特征、分子鉴定以及应用；分离的AvrPii-C基因能够与适当的载体连接，转入菌株中，使该菌株对含有特异性互作的抗病基因Pii的植物产生无毒性。本发明采用的技术路线如图1所示。

实施例中所用的菌株：CHL346、CHL22、CHL357(Hua et al.2012,Theoretical andApplied Genetics,125:1047-1055)、CHL690、CHL742、EHL0312、EHL0313、EHL0314、EHL0317、EHL0319、EHL0321、EHL0327、EHL0329、EHL0339、EHL0340(Table S2in Zhang etal.2015,Scientific Reports,5:11642；附件图表可在杂志网站获得，下同)；以及所用的水稻品种：IRBLi-F5，IRBLz5-CA，IRBLb-B(Table S3inZhai et al.2011,NewPhytologist,189:321-334)皆为本研究领域常用且已在上述文献中公开。

实施例1：利用目的基因全长PCR产物获得稻瘟病菌无毒基因AvrPii分化为AvrPii-J及AvrPii-C的分子证据(图2)

申请人选择对携带Pii的单基因鉴别品种IRBLi-F5为无毒的菌株(图2b)，编号#1-10分别为CHL22，EHL0317，EHL0319，EHL0329，EHL0340，CHL346，CHL690，CHL742，EHL0321，EHL0314，根据已公开的AvrPii(基因序列编号：AB498874；Yoshida et al.2009,The PlantCell21:1573-1591)的序列设计如下引物(图2a)进行了基于PCR产物的基因型鉴定。

基因全长引物(AvrPii-FL-F/R)：

SEQ ID NO.7(AvrPii-FL-F；5’-3’)：TTTGGTAGATATCCGCTGAC；

SEQ ID NO.8(AvrPii-FL-R；5’-3’)：AAACAGATTTGGAACTTTGGT；

基因编码区(coding sequence，CDS)引物(AvrPii-CDS-F/R)：

SEQ ID NO.9(AvrPii-CDS-F；5’-3’)：ATGCAACTTTCCAAAATTAC；

SEQ ID NO.10(AvrPii-CDS-R；5’-3’)：TTAGTTGCATTTATGATTA；

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸2min)，最后72℃延伸5min，10℃产物保存备用。

电泳结果显示，利用上述基因全长引物AvrPii-FL-F/R，对#1-5无毒菌株能够扩增出目标片段，而对#6-10无毒菌株则不能扩增出目标片段(图2c)。但是，利用CDS引物AvrPii-CDS-F/R则都能够扩增出来(图2d)。由此说明AvrPii存在功能相同但是上下游序列不同的遗传分化。在此，将能够根据日本实验室克隆的AvrPii序列PCR扩增出来的目的基因命名为AvrPii-J(J,Japan；日本菌株发现之意)；而将后者命名为AvrPii-C(C,China；中国菌株发现之意)。

实施例2：利用TAIL-PCR技术获得AvrPii-C的全长序列(图2、3)

为了获得完整的AvrPii-C序列，申请人根据AvrPii-J(基因序列编号：AB498874)的CDS序列设计3’和5’特异性引物(如图2a所示)：

SEQ ID NO.11(SP1；5’-3’)：ATGCAACTTTCCAAAATTACTTTCGCTAT；

SEQ ID NO.12(SP2；5’-3’)：GGCAACACTGAGGTCGCAACCATCT；

SEQ ID NO.13(SP3；5’-3’)：GGCAGCGATGATTCCGACGCGTATT；

SEQ ID NO.14(SP4；5’-3’)：AATACGCGTCGGAATCATCGCTGCC；

SEQ ID NO.15(SP5；5’-3’)：AGATGGTTGCGACCTCAGTGTTGCC；

SEQ ID NO.16(SP6；5’-3’)：ATAGCGAAAGTAATTTTGGAAAGTTGCAT；

简并引物SEQ ID NO.17(AD；5’-3’)：STTGNTASTNCTNTGC。

选择代表菌株CHL346，对其3’和5’侧翼序列进行交错式热不对称PCR(thermalasymmetric interlaced PCR；TAIL-PCR)分析。PCR扩增体系如下：

每一轮反应使用不同的特异性引物，3’端依次使用SP1-SP2-SP3；5’端依次使用SP4-SP5-SP6。

第一轮反应模板为CHL346基因组DNA(30ng/μL)，第2、3轮反应DNA模板为上一轮反应液稀释50倍。

PCR程序如下：

对扩增获得的特异产物(如图3)进行测序，分别获得AvrPii-C-5’侧翼序列SEQ IDNO.20以及AvrPii-C-3’侧翼序列SEQ ID NO.21，再以AvrPii-J-5’CDS-F(SEQ ID NO.18)和AvrPii-J-3’CDS-R(SEQ ID NO.19)对CHL346扩增获得AvrPii-C346-CDS(SEQ ID NO.22)，对以上序列片段进行拼接获得AvrPii-C的完整DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3：水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C基因结构及序列分析(图4、5)

申请人将AvrPii-C和AvrPii-J的序列进行比对，发现二者在CDS区有20个SNP，上下游调控区核苷酸序列存在更显著的差异(如图4)，这说明AvrPii在进化中分化为2种功能相同但是序列及结构不同的种内同源基因(paralog)，AvrPii-C及AvrPii-J。上述2个基因都有213bp的编码区，编码由70个氨基酸残基组成的蛋白质，编码的AvrPii-C蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其N端19个氨基酸残基的肽链为信号肽(如图5)。

实施例4：水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及AvrPii-J的克隆、遗传转化以及转化子菌株表现型/基因型的一致性分析(图5、6)

分别利用上述AvrPii-C及AvrPii-J的全长序列，分别设计克隆引物(如图5a所示)：

SEQ ID NO.23(AvrPii-C-GT-F；5’-3’)：TCAGCGGATATTCACC；

SEQ ID NO.24(AvrPii-C346-GT-R；5’-3’)：TAGATTTTCAGGGTGC；

SEQ ID NO.25(AvrPii-C22-GT-R；5’-3’)：GTCACGGCCAGGCATACAT；

SEQ ID NO.26(AvrPii-J-GT-F；5’-3’)：TGGTAGATATCCGCTGAC；

SEQ ID NO.27(AvrPii-J-GT-R；5’-3’)：CAGATTTGGAACTTTGGT。

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：98℃预变性3sec，随后进行35个循环的PCR扩增(98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40sec)，最后72℃延伸2min，10℃产物保存备用。

通过基于PCR产物的常规基因克隆方法(Zhang et al.2015,Scientific Reports5:11642)，分别利用引物对AvrPii-C-GT-F及AvrPii-C346-GT-R，AvrPii-C-GT-F及AvrPii-C22-GT-R，以及AvrPii-J-GT-F及AvrPii-J-GT-R从稻瘟病菌代表菌株CHL346和CHL22中克隆得到3个AvrPii基因：AvrPii-C346(AvrPii-C；SEQ ID NO.1)、AvrPii-C22(SEQ IDNO.42)及AvrPii-J22(AvrPii-J；SEQ ID NO.43)；通过常规的遗传转化技术导入受体菌株CHL357(不含AvrPii)中。对转化子菌株进行致病性鉴定，结果表明成功的转化子菌株表现为在毒性受体菌株中恢复了对目的抗病基因Pii的无毒性(与无毒基因供体菌株CHL346和CHL22的表现型相似)(图6a,b)。

对实现了功能互补的转化菌株进行了选择标记(潮霉素基因)以及基因特异性标记(AvrPii-C及AvrPii-J)的PCR鉴定。结果表明，目的基因已经导入这些转化子菌株中，并且表现型与基因型具有一致性(部分个体如图6b-e所示)。以上结果说明，无毒基因AvrPii-C和AvrPii-J已经被成功地克隆并进行了功能验证。

实施例5：水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及AvrPii-J的上下游序列及结构特异性的功能验证(图7)

为进一步了解AvrPii-C及AvrPii-J上下游调控序列的功能，以及二者遗传分化的分子机制，申请人以野生型的AvrPii-C346及AvrPii-J22基因的TA克隆为模板，通过重叠PCR(overlap-PCR)技术构建了Mai1(SEQ ID NO.44)、Mai2(SEQ ID NO.45)、Mai6(SEQ IDNO.49)及Mai7(SEQ ID NO.50)，如图7。

详细地，设计overlap-PCR引物：

SEQ ID NO.28(J5’/C-F；5’-3’)：TTCCAATTTACCAAAATGCAACTCTCCAAAATT；

SEQ ID NO.29(J5’/C-R；5’-3’)：AATTTTGGAGAGTTGCATTTTGGTAAATTGGAA；

SEQ ID NO.30(C5’/J-F；5’-3’)：TTCCAACTTACCAAAATGCAACTTTCCAAAATT；

SEQ ID NO.31(C5’/J-R；5’-3’)：AATTTTGGAAAGTTGCATTTTGGTAAGTTGGAA；

SEQ ID NO.32(J/C3’-F；5’-3’)：TCATAAATGCAACTAATGTAAGTTGATATCT；

SEQ ID NO.33(J/C3’-R；5’-3’)：AGATATCAACTTACATTAGTTGCATTTATGA；

SEQ ID NO.34(C/J3’-F；5’-3’)：CAAGTGCAAGTAATGTAAGTTAAAATCTG；

SEQ ID NO.35(C/J3’-R；5’-3’)：CAGATTTTAACTTACATTACTTGCACTTG。

利用上述引物对AvrPii-J-GT-F及J5’/C-R，以TA-AvrPii-J22为模板；引物对J5’/C-F及AvrPii-C346-GT-R，以TA-AvrPii-C346为模板，分别扩增出AvrPii-J22的5’UTR和AvrPii-C346的CDS+3’UTR，然后用引物对AvrPii-J-GT-F和AvrPii-C346-GT-R，以上一步PCR产物为模板扩增得到Mai1。

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：98℃预变性30sce，随后进行35个循环的PCR扩增(98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸40sec)，最后72℃延伸2min，10℃产物保存备用。

根据同样的原理，构建了人工突变体Mai2、Mai6及Mai7。

利用基于PCR的定点突变技术(将突变点设计于引物上)构建了Mai3～5(SEQ IDNO.46～48，图7)。

详细地，设计定点突变引物：

SEQ ID NO.36(J/C1-F；5’-3’)：CATTATATGCAGTCGGAATCGCAGCACTT；

SEQ ID NO.37(J/C1-R；5’-3’)：CAATAGCGAAAGTAATTTTGGAGAGTTGCAT；

SEQ ID NO.38(J/C2-F；5’-3’)：CATCTCCGACGTTAAACTTGGACCCCGCA；

SEQ ID NO.39(J/C2-R；5’-3’)：GTTGCGACCTCAGTGTTGCCATTTAGGCAGGC；

SEQ ID NO.40(J/C3-F；5’-3’)：ATGCGGCTTCGGCAGCGATGATTCC；

SEQ ID NO.41(J/C3-R；5’-3’)：TTGGAGCAATAATAATAAGTCTTGTCGC。

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：98℃预变性30sce，随后进行35个循环的PCR扩增(98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸2sec)，最后72℃延伸2min，10℃产物保存备用。

利用上述引物对J/C1-F及J/C1-R，以TA-AvrPii-J22为模板按照TaKaRaMutanBESTKit试剂盒说明书进行操作，获得TA-Mai3突变体；然后再用引物对J/C2-F及J/C2-R，以TA-Mai3为模板，获得TA-Mai4；再用引物对J/C3-F及J/C3-R，以TA-Mai4为模板，获得TA-Mai5。

将7个突变体通过常规的遗传转化技术导入受体菌株CHL357中。表型鉴定结果说明，AvrPii-C和AvrPii-J上下游调控区的完整性对二者行使正常功能都是必需的，且3’UTR较5’UTR的作用似乎更重要。另外，Mai3、Mai4及Mai5等3个突变体都失去了其无毒性，说明AvrPii-C及AvrPii-J的功能都需要其完整的氨基酸序列，任一段突变都会使其丧失功能。由此进一步说明，二者是具有基因结构及产物完整性及特异性的种内同源基因，彼此之间不具有拷贝性关系(duplication)。

实施例6：AvrPii-C及AvrPii-J特异性分子标记的开发及应用(图5、8)

(1)AvrPii-C及AvrPii-J特异性分子标记的设计：利用实施例2获得的AvrPii-C序列(SEQ ID NO.1)，以及实施例3获得的AvrPii-C与AvrPii-J序列的比对结果，根据二者核苷酸序列的特异性，分别设计基因特异性分子标记引物(图5)：

SEQ ID NO.3(AvrPii-C-F；5’-3’)：TCGTTATATTTCCATTGCTATTCAT；

SEQ ID NO.4(AvrPii-C-R；5’-3’)：TAAAAATGAGTTAAATTATGCGTT；

SEQ ID NO.5(AvrPii-J-F；5’-3’)：GTATAATTCCTTTTCTTCCCTCCTT；

SEQ ID NO.6(AvrPii-J-R；5’-3’)：CTAATTTAAATCGTGCGCTTTCAGA。

(2)AvrPii-C及AvrPii-J特异性分子标记在田间稻瘟病菌群体监测中的应用：利用上述引物对田间水稻稻瘟病菌株进行表现型/基因型的一致性分析。

PCR扩增的体系如下：

部分菌株基因型如图8所示，这2个基因特异性分子标记可以全面、准确地鉴定出在田间菌株中是否含有AvrPii-C或AvrPii-J。

采用本发明方法可以对任何来源的菌株(包括稻瘟病菌，但不限于稻瘟病菌)进行基因型鉴定，建立分子检测体系，本发明为基于无毒基因特异性标记的稻瘟病菌群体遗传学研究提供重要的技术基础；为从基因水平上监测田间稻瘟病群体小种变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局提供具有可操作性的技术方案；也为选择合适的菌株进行稻种资源稻瘟病抗病基因Pii及其等位基因的筛选及利用提供技术保障。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C及其应用

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> AvrPii-C

<211> 1480

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(663)

<220>

<221> CDS

<222> (664)..(876)

<220>

<221> 3’UTR

<222> (877)..(1480)

<400> 1

tcagcggata ttcaccaaaa taagtaaata tttaattaaa aaagcaaagc gcaaatttat 60

aaaaaaaaca ttaacatttc aagtgaagat aattaaagaa aaggtaaatt aaaaggcata 120

ataatttcgt aaaaagcggt ctaataaaat ctttttttac aagattgcgt ctttatataa 180

atagtaaatt atgcatttga gtttttttgt ttctattaac agtggtacgg agtggcgtgg 240

ctaggcgact gccaaccgtg actccacccc acgtggtaag gtgctagggt tcgttgttgt 300

gtattcgttt aggcgcgtgc acgcgattgg cattgcgtgc ctttcttctt tttttagact 360

tagctttaga tcttcgaata gaatcgcccc tatattgcaa ccttgtctct ttggtatcgc 420

tttcgtgaca aacagaactg tttttaaaca aggtaattaa tttgaatttt gcacctttac 480

gcggacttat gcaaaccgaa atccctagga aatgctatta atcatataat ataaaaacct 540

caacttcttg tacactactt cgttatattt ccattgctat tcatcctttt tattataaag 600

ccaacgaatt gaattcagtt ttagtatact aagatcccct tgtatttttt ccaacttacc 660

aaaatgcaac tctccaaaat tactttcgct attgcattat atgcagtcgg aatcgcagca 720

cttcccactc cggcctgcct aaatggcaac actgaggtcg caaccatctc cgacgttaaa 780

cttggacccc gcagcgacaa gacttattat tattgctcca aatgcggctt cggcagcaat 840

gattccgaca cgtattttaa tcacaagtgc aagtaatgta agttgatatc taaacgcata 900

atttaactca tttttaaaaa aataaattat tctaacgttt aattataatg catacgaatt 960

aaacagcatt tttcaagcgc gtgacggaca gttatggatt ctgcaaattt taaatacccg 1020

gtgtcacggc caggcatata tcggaatgtg aggatcaggt ccccacacct accctcagaa 1080

ttacgactcg gctccacgtc gagccaggga taggacaaag ggtccactca ccccggattt 1140

aaaacgcgtc tttccaacgc gccgtcaatt gtaatttctc tcttctcttc aatttagaat 1200

ttttggtcca tagcgcccaa tatactgggg ttctacaatg taggcctggc cgtaacatca 1260

gccaattttg ctgtttaacg attattggaa aaaagaattt tcttttttat aaaaacgcca 1320

aatcgaaaat atttacaaca aaaattattt aatttgggtg gcgtataacg gggttattgt 1380

cacggccagg catacattgg agaacctcag tgtattaggc gctattaacg ttgcgtaccc 1440

cctgttcggc accccccctg ttcggcaccc tgaaaatcta 1480

<210> AvrPii-C

<211> 70

<212> PRT

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<400> 2

Met Gln Leu Ser Lys Ile Thr Phe Ala Ile Ala Leu Tyr Ala Val Gly

1 5 10 15

Ile Ala Ala Leu Pro Thr Pro Ala Cys Leu Asn Gly Asn Thr Glu Val

20 25 30

Ala Thr Ile Ser Asp Val Lys Leu Gly Pro Arg Ser Asp Lys Thr Tyr

35 40 45

Tyr Tyr Cys Ser Lys Cys Gly Phe Gly Ser Asn Asp Ser Asp Thr Tyr

50 55 60

Phe Asn His Lys Cys Lys

65 70

<210> AvrPii-C-F

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcgttatatt tccattgcta ttcat 25

<210> AvrPii-C-R

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

taaaaatgag ttaaattatg cgtt 24

<210> AvrPii-J-F

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtataattcc ttttcttccc tcctt 25

<210> AvrPii-J-R

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctaatttaaa tcgtgcgctt tcaga 25

<210> AvrPii-FL-F

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tttggtagat atccgctgac 20

<210> AvrPii-FL-R

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaacagattt ggaactttgg t 21

<210> AvrPii-CDS-F

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgcaacttt ccaaaattac 20

<210> AvrPii-CDS-R

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttagttgcat ttatgatta 19

<210> SP1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgcaacttt ccaaaattac tttcgctat 29

<210> SP2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ggcaacactg aggtcgcaac catct 25

<210> SP3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ggcagcgatg attccgacgc gtatt 25

<210> SP4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aatacgcgtc ggaatcatcg ctgcc 25

<210> SP5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

agatggttgc gacctcagtg ttgcc 25

<210> SP6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

atagcgaaag taattttgga aagttgcat 29

<210> AD

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

sttgntastn ctntgc 16

<210> AvrPii-5’CDS-F

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ccaaaatccc cttttattcc ttccaattta 30

<210> AvrPii-3’CDS-R

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

gtatgcgcta taattaaacg ttaagataat t 31

<210> AvrPii-C-5'

<211> 692

<212> DNA

<213>稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<400> 20

atagcgaaag taattttgga aagttgcatt ttggtaagtt ggaaaaaata caaggggatc 60

ttagtatact aaaactgaat tcaattcgtt ggctttataa taaaaaggat gaatagcaat 120

ggaaatataa cgaagtagtg tacaagaagt tgaggttttt atattatatg attaatagca 180

tttcctaggg atttcggttt gcataagtcc gcgtaaaggt gcaaaattca aattaattac 240

cttgtttaaa aacagttctg tttgtcacga aagcgatacc aaagagacaa ggttgcaata 300

taggggcgat tctattcgaa gatctaaagc taagtctaaa aaaagaagaa aggcacgcaa 360

tgccaatcgc gtgcacgcgc ctaaacgaat acacaacaac gaaccctagc accttaccac 420

gtggggtgga gtcacggttg gcagtcgcct agccacgcca ctccgtacca ctgttaatag 480

aaacaaaaaa actcaaatgc ataatttact atttatataa agacgcaatc ttgtaaaaaa 540

agattttatt agaccgcttt ttacgaaatt attatgcctt ttaatttacc ttttctttaa 600

ttatcttcac ttgaaatgtt aatgtttttt ttataaattt gcgctttgct tttttaatta 660

aatatttact tattttggtg aatatccgct ga 692

<210> AvrPii-C-3'

<211> 649

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<400> 21

ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cacaagtgca agtaatgtaa gttgatatct 60

aaacgcataa tttaactcat ttttaaaaaa ataaattatt ctaacgttta attataatgc 120

atacgaatta aacagcattt ttcaagcgcg tgacggacag ttatggattc tgcaaatttt 180

aaatacccgg tgtcacggcc aggcatatat cggaatgtga ggatcaggtc cccacaccta 240

ccctcagaat tacgactcgg ctccacgtcg agccagggat aggacaaagg gtccactcac 300

cccggattta aaacgcgtct ttccaacgcg ccgtcaattg taatttctct cttctcttca 360

atttagaatt tttggtccat agcgcccaat atactggggt tctacaatgt aggcctggcc 420

gtaacatcag ccaattttgc tgtttaacga ttattggaaa aaagaatttt cttttttata 480

aaaacgccaa atcgaaaata tttacaacaa aaattattta atttgggtgg cgtataacgg 540

ggttattgtc acggccaggc atacattgga gaacctcagt gtattaggcg ctattaacgt 600

tgcgtacccc ctgttcggca ccccccctgt tcggcaccct gaaaatcta 649

<210> AvrPii-C346-CDS

<211> 213

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<400> 22

atgcaactct ccaaaattac tttcgctatt gcattatatg cagtcggaat cgcagcactt 60

cccactccgg cctgcctaaa tggcaacact gaggtcgcaa ccatctccga cgttaaactt 120

ggaccccgca gcgacaagac ttattattat tgctccaaat gcggcttcgg cagcaatgat 180

tccgacacgt attttaatca caagtgcaag taa 213

<210> AvrPii-C-GT-F

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tcagcggata ttcacc 16

<210> AvrPii-C346-GT-R

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tagattttca gggtgc 16

<210> AvrPii-C22-GT-R

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gtcacggcca ggcatacat 19

<210> AvrPii-J-GT-F

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

tggtagatat ccgctgac 18

<210> AvrPii-J-GT-R

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

cagatttgga actttggt 18

<210> J5'/C-F

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

ttccaattta ccaaaatgca actctccaaa att 33

<210> J5'/C-R

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

aattttggag agttgcattt tggtaaattg gaa 33

<210> C5'/J-F

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ttccaactta ccaaaatgca actttccaaa att 33

<210> C5'/J-R

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

aattttggaa agttgcattt tggtaagttg gaa 33

<210> J/C3'-F

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

tcataaatgc aactaatgta agttgatatc t 31

<210> J/C3'-R

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

agatatcaac ttacattagt tgcatttatg a 31

<210> C/J3'-F

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

caagtgcaag taatgtaagt taaaatctg 29

<210> C/J3'-R

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

cagattttaa cttacattac ttgcacttg 29

<210> J/C1-F

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

cattatatgc agtcggaatc gcagcactt 29

<210> J/C1-R

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

caatagcgaa agtaattttg gagagttgca t 31

<210> J/C2-F

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

catctccgac gttaaacttg gaccccgca 29

<210> J/C2-R

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

gttgcgacct cagtgttgcc atttaggcag gc 32

<210> J/C3-F

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

atgcggcttc ggcagcgatg attcc 25

<210> J/C3-R

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

ttggagcaat aataataagt cttgtcgc 28

<210> AvrPii-C22

<211> 1489

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<220>

<221> 5’UTR

<222> (1)..(663)

<220>

<221> CDS

<222> (664)..(876)

<220>

<221> 3’UTR

<222> (877)..(1489)

<400> 42

tcagcggata ttcaccaaaa taagtaaata tttaattaaa aaagcaaagc gcaaatttat 60

aaaaaaaaca ttaacatttc aagtgaagat aattaaagaa aaggtaaatt aaaaggcata 120

ataatttcgt aaaaagcggt ctaataaaat ctttttttac aagattgcgt ctttatataa 180

atagtaaatt atgcatttga gtttttttgt ttctattaac agtggtacgg agtggcgtgg 240

ctaggcgact gccaaccgtg actccacccc acgtggtaag gtgctagggt tcgttgttgt 300

gtattcgttt aggcgcgtgc acgcgattgg tattgcgtgc ctttcttctt tttttagact 360

tagctttaga tcttcgaata gaatcgcccc tatattgcaa ccttgtctct ttggtatcgc 420

tttcgtgaca aacagaactg tttttaaaca aggtaattaa tttgaatttt gcacctttac 480

gcggacttat gcaaaccgaa atccctagga aatgctatta atcatataat ataaaaacct 540

caacttcttg tacactactt cgttatattt ccattgctat tcatcctttt tattataaag 600

ccaacgaatt gaattcagtt ttagtatact aagatcccct tgtatttttt ccaacttacc 660

aaaatgcaac tctccaaaat tactttcgct attgcattat atgcagtcgg aatcgcagca 720

cttcccactc cggcctgcct aaatggcaac actgaggtcg caaccatctc cgacgttaaa 780

cttggacccc gcagcgacaa gacttatcat tattgctcca aatgcggctt cggcagcaat 840

gattccgaca cgtattttaa tcacaagtgc aagtaatgta agtttatcta aacgcataat 900

ttaactcatt tttaaaaaaa taaattattc taacgtttta taatgcatac gaattaaaca 960

gcatttttca agcgcgtgac ggacagttat ggattctgca aattttaaat acccggtgtc 1020

acggccaggc atatatcgga atgtgaggat caggtcccca cacctaccct cagaattacg 1080

actcggctcc acgtcgagcc agggatagga caaagggtcc actcaccccg gatttaaaac 1140

gcgtctttcc aacgcgccgt caattgtaat ttctctcttt tcaatttaga atttttggtc 1200

catagcgccc aatatactgg ggttctacaa tgtaggcctg gccgtaacat cagccaattt 1260

tgctgtttaa cgattattgg aaaaaagaat tttctttttt ataaaaacgc caaatcgaaa 1320

atatttacaa caaaaattat ttaatttggg tggcgtataa cggggttatg gccggtaaat 1380

ttggttaaac gacttttaaa ccctttttta ttaaaaaata gcaacgccaa cgttataaaa 1440

aataaaaaca acggtttaca aagggttatt gtcacggcca ggcatacat 1489

<210> AvrPii-J22

<211> 1348

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）

<400> 43

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ttccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcaatcgga atcgcagcac ttcccactcc ggccagcctg aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttgaggcccg cagcgacacc acttatcata 660

aatgctccaa atgcggttat ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cataaatgca 720

actaatgtaa gttaaaatct gaaagcgcac gatttaaatt agtttcaaat ataaattatc 780

ttaacgttta attatagcgc atacaaagta agctggattt ttccaaacga acggcggaca 840

gttatggact attgcgggaa tttcaaggat aggaaaagcc aatttgaaat atccggaata 900

ctttttccaa gcttaaccat taaataacat gtcttaaatc aatctacctt tcgcgtttaa 960

attttttcaa acataatgaa ctgatatcaa aaccgaggat gctgcgagct gcgttatgtt 1020

aatttgtcgt tttctacacg atagcgactg ataatagcaa caacacacat gtacatacac 1080

acatatacac atatatacca ttattccaaa cacgttaaga actgtgaaaa aataggtggt 1140

ttttattttg gcatgttggt aaagcgtgag agcagagtgg agcaaccctt ggataatggc 1200

tactaaggat atccatctgt gcattatata ataacgtgga tgtacaccga gtcgcgcatg 1260

acaccgagcg cgcacccttt atacatagta aatccgttcg tgtgcttcgc ccaattcaag 1320

tctagttttc accaaagttc caaatctg 1348

<210> Mai1

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 44

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ctccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcagtcgga atcgcagcac ttcccactcc ggcctgccta aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttggaccccg cagcgacaag acttattatt 660

attgctccaa atgcggcttc ggcagcaatg attccgacac gtattttaat cacaagtgca 720

agtaatgtaa gttgatatct aaacgcataa tttaactcat ttttaaaaaa ataaattatt 780

ctaacgttta attataatgc atacgaatta aacagcattt ttcaagcgcg tgacggacag 840

ttatggattc tgcaaatttt aaatacccgg tgtcacggcc aggcatatat cggaatgtga 900

ggatcaggtc cccacaccta ccctcagaat tacgactcgg ctccacgtcg agccagggat 960

aggacaaagg gtccactcac cccggattta aaacgcgtct ttccaacgcg ccgtcaattg 1020

taatttctct cttctcttca atttagaatt tttggtccat agcgcccaat atactggggt 1080

tctacaatgt aggcctggcc gtaacatcag ccaattttgc tgtttaacga ttattggaaa 1140

aaagaatttt cttttttata aaaacgccaa atcgaaaata tttacaacaa aaattattta 1200

atttgggtgg cgtataacgg ggttattgtc acggccaggc atacattgga gaacctcagt 1260

gtattaggcg ctattaacgt tgcgtacccc ctgttcggca ccccccctgt tcggcaccct 1320

gaaaatcta 1329

<210> Mai2

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 45

tcagcggata ttcaccaaaa taagtaaata tttaattaaa aaagcaaagc gcaaatttat 60

aaaaaaaaca ttaacatttc aagtgaagat aattaaagaa aaggtaaatt aaaaggcata 120

ataatttcgt aaaaagcggt ctaataaaat ctttttttac aagattgcgt ctttatataa 180

atagtaaatt atgcatttga gtttttttgt ttctattaac agtggtacgg agtggcgtgg 240

ctaggcgact gccaaccgtg actccacccc acgtggtaag gtgctagggt tcgttgttgt 300

gtattcgttt aggcgcgtgc acgcgattgg cattgcgtgc ctttcttctt tttttagact 360

tagctttaga tcttcgaata gaatcgcccc tatattgcaa ccttgtctct ttggtatcgc 420

tttcgtgaca aacagaactg tttttaaaca aggtaattaa tttgaatttt gcacctttac 480

gcggacttat gcaaaccgaa atccctagga aatgctatta atcatataat ataaaaacct 540

caacttcttg tacactactt cgttatattt ccattgctat tcatcctttt tattataaag 600

ccaacgaatt gaattcagtt ttagtatact aagatcccct tgtatttttt ccaacttacc 660

aaaatgcaac tttccaaaat tactttcgct attgcattat atgcaatcgg aatcgcagca 720

cttcccactc cggccagcct gaatggcaac actgaggtcg caaccatctc cgacgttaaa 780

cttgaggccc gcagcgacac cacttatcat aaatgctcca aatgcggtta tggcagcgat 840

gattccgacg cgtattttaa tcataaatgc aactaatgta agttaaaatc tgaaagcgca 900

cgatttaaat tagtttcaaa tataaattat cttaacgttt aattatagcg catacaaagt 960

aagctggatt tttccaaacg aacggcggac agttatggac tattgcggga atttcaagga 1020

taggaaaagc caatttgaaa tatccggaat actttttcca agcttaacca ttaaataaca 1080

tgtcttaaat caatctacct ttcgcgttta aattttttca aacataatga actgatatca 1140

aaaccgagga tgctgcgagc tgcgttatgt taatttgtcg ttttctacac gatagcgact 1200

gataatagca acaacacaca tgtacataca cacatataca catatatacc attattccaa 1260

acacgttaag aactgtgaaa aaataggtgg tttttatttt ggcatgttgg taaagcgtga 1320

gagcagagtg gagcaaccct tggataatgg ctactaagga tatccatctg tgcattatat 1380

aataacgtgg atgtacaccg agtcgcgcat gacaccgagc gcgcaccctt tatacatagt 1440

aaatccgttc gtgtgcttcg cccaattcaa gtctagtttt caccaaagtt ccaaatctgt 1500

<210> Mai3

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 46

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ctccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcagtcgga atcgcagcac ttcccactcc ggccagcctg aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttgaggcccg cagcgacacc acttatcata 660

aatgctccaa atgcggttat ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cataaatgca 720

actaatgtaa gttaaaatct gaaagcgcac gatttaaatt agtttcaaat ataaattatc 780

ttaacgttta attatagcgc atacaaagta agctggattt ttccaaacga acggcggaca 840

gttatggact attgcgggaa tttcaaggat aggaaaagcc aatttgaaat atccggaata 900

ctttttccaa gcttaaccat taaataacat gtcttaaatc aatctacctt tcgcgtttaa 960

attttttcaa acataatgaa ctgatatcaa aaccgaggat gctgcgagct gcgttatgtt 1020

aatttgtcgt tttctacacg atagcgactg ataatagcaa caacacacat gtacatacac 1080

acatatacac atatatacca ttattccaaa cacgttaaga actgtgaaaa aataggtggt 1140

ttttattttg gcatgttggt aaagcgtgag agcagagtgg agcaaccctt ggataatggc 1200

tactaaggat atccatctgt gcattatata ataacgtgga tgtacaccga gtcgcgcatg 1260

acaccgagcg cgcacccttt atacatagta aatccgttcg tgtgcttcgc ccaattcaag 1320

tctagttttc accaaagttc caaatctg 1348

<210> Mai4

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 47

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ctccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcagtcgga atcgcagcac ttcccactcc ggcctgccta aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttggaccccg cagcgacacc acttatcata 660

aatgctccaa atgcggttat ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cataaatgca 720

actaatgtaa gttaaaatct gaaagcgcac gatttaaatt agtttcaaat ataaattatc 780

ttaacgttta attatagcgc atacaaagta agctggattt ttccaaacga acggcggaca 840

gttatggact attgcgggaa tttcaaggat aggaaaagcc aatttgaaat atccggaata 900

ctttttccaa gcttaaccat taaataacat gtcttaaatc aatctacctt tcgcgtttaa 960

attttttcaa acataatgaa ctgatatcaa aaccgaggat gctgcgagct gcgttatgtt 1020

aatttgtcgt tttctacacg atagcgactg ataatagcaa caacacacat gtacatacac 1080

acatatacac atatatacca ttattccaaa cacgttaaga actgtgaaaa aataggtggt 1140

ttttattttg gcatgttggt aaagcgtgag agcagagtgg agcaaccctt ggataatggc 1200

tactaaggat atccatctgt gcattatata ataacgtgga tgtacaccga gtcgcgcatg 1260

acaccgagcg cgcacccttt atacatagta aatccgttcg tgtgcttcgc ccaattcaag 1320

tctagttttc accaaagttc caaatctg 1348

<210> Mai5

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 48

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ctccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcagtcgga atcgcagcac ttcccactcc ggcctgccta aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttggaccccg cagcgacaag acttattatt 660

attgctccaa atgcggcttc ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cataaatgca 720

actaatgtaa gttaaaatct gaaagcgcac gatttaaatt agtttcaaat ataaattatc 780

ttaacgttta attatagcgc atacaaagta agctggattt ttccaaacga acggcggaca 840

gttatggact attgcgggaa tttcaaggat aggaaaagcc aatttgaaat atccggaata 900

ctttttccaa gcttaaccat taaataacat gtcttaaatc aatctacctt tcgcgtttaa 960

attttttcaa acataatgaa ctgatatcaa aaccgaggat gctgcgagct gcgttatgtt 1020

aatttgtcgt tttctacacg atagcgactg ataatagcaa caacacacat gtacatacac 1080

acatatacac atatatacca ttattccaaa cacgttaaga actgtgaaaa aataggtggt 1140

ttttattttg gcatgttggt aaagcgtgag agcagagtgg agcaaccctt ggataatggc 1200

tactaaggat atccatctgt gcattatata ataacgtgga tgtacaccga gtcgcgcatg 1260

acaccgagcg cgcacccttt atacatagta aatccgttcg tgtgcttcgc ccaattcaag 1320

tctagttttc accaaagttc caaatctg 1348

<210> Mai6

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 49

tggtagatat ccgctgactg ggggcaacat tggttggatt ttaaagtaca tatatagaaa 60

cgaaaataag tggaaaaaga agaacaagag taagggttat taattacacg actaaatgtg 120

gtaatttagc tatgttataa ccaggcaagc actacaaata gcccatggca atcaggaaga 180

ggccgatatg ttacgattga ataataaaat attttataaa cttgcatttg gatgtaaatt 240

gtaaattatg catttgagct cctctgtttc tattaacaga aatgttttta aacaaggtac 300

ctaaatgcaa ttctatattt tttatgcgga tttatgcagg cccaaatccg taggaaatac 360

tattagttat aataatataa aaacctcggc ttcttgtata ttactgtata attccttttc 420

ttccctcctt atatttttca tcttaaaact aaacatttaa attcagcttc aaatatacca 480

aaatcccctt ttattccttc caatttacca aaatgcaact ttccaaaatt actttcgcta 540

ttgcattata tgcaatcgga atcgcagcac ttcccactcc ggccagcctg aatggcaaca 600

ctgaggtcgc aaccatctcc gacgttaaac ttgaggcccg cagcgacacc acttatcata 660

aatgctccaa atgcggttat ggcagcgatg attccgacgc gtattttaat cataaatgca 720

actaatgtaa gttgatatct aaacgcataa tttaactcat ttttaaaaaa ataaattatt 780

ctaacgttta attataatgc atacgaatta aacagcattt ttcaagcgcg tgacggacag 840

ttatggattc tgcaaatttt aaatacccgg tgtcacggcc aggcatatat cggaatgtga 900

ggatcaggtc cccacaccta ccctcagaat tacgactcgg ctccacgtcg agccagggat 960

aggacaaagg gtccactcac cccggattta aaacgcgtct ttccaacgcg ccgtcaattg 1020

taatttctct cttctcttca atttagaatt tttggtccat agcgcccaat atactggggt 1080

tctacaatgt aggcctggcc gtaacatcag ccaattttgc tgtttaacga ttattggaaa 1140

aaagaatttt cttttttata aaaacgccaa atcgaaaata tttacaacaa aaattattta 1200

atttgggtgg cgtataacgg ggttattgtc acggccaggc atacattgga gaacctcagt 1260

gtattaggcg ctattaacgt tgcgtacccc ctgttcggca ccccccctgt tcggcaccct 1320

gaaaatcta 1329

<210> Mai7

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工重组

<400> 50

tcagcggata ttcaccaaaa taagtaaata tttaattaaa aaagcaaagc gcaaatttat 60

aaaaaaaaca ttaacatttc aagtgaagat aattaaagaa aaggtaaatt aaaaggcata 120

ataatttcgt aaaaagcggt ctaataaaat ctttttttac aagattgcgt ctttatataa 180

atagtaaatt atgcatttga gtttttttgt ttctattaac agtggtacgg agtggcgtgg 240

ctaggcgact gccaaccgtg actccacccc acgtggtaag gtgctagggt tcgttgttgt 300

gtattcgttt aggcgcgtgc acgcgattgg cattgcgtgc ctttcttctt tttttagact 360

tagctttaga tcttcgaata gaatcgcccc tatattgcaa ccttgtctct ttggtatcgc 420

tttcgtgaca aacagaactg tttttaaaca aggtaattaa tttgaatttt gcacctttac 480

gcggacttat gcaaaccgaa atccctagga aatgctatta atcatataat ataaaaacct 540

caacttcttg tacactactt cgttatattt ccattgctat tcatcctttt tattataaag 600

ccaacgaatt gaattcagtt ttagtatact aagatcccct tgtatttttt ccaacttacc 660

aaaatgcaac tctccaaaat tactttcgct attgcattat atgcagtcgg aatcgcagca 720

cttcccactc cggcctgcct aaatggcaac actgaggtcg caaccatctc cgacgttaaa 780

cttggacccc gcagcgacaa gacttattat tattgctcca aatgcggctt cggcagcaat 840

gattccgaca cgtattttaa tcacaagtgc aagtaatgta agttaaaatc tgaaagcgca 900

cgatttaaat tagtttcaaa tataaattat cttaacgttt aattatagcg catacaaagt 960

aagctggatt tttccaaacg aacggcggac agttatggac tattgcggga atttcaagga 1020

taggaaaagc caatttgaaa tatccggaat actttttcca agcttaacca ttaaataaca 1080

tgtcttaaat caatctacct ttcgcgttta aattttttca aacataatga actgatatca 1140

aaaccgagga tgctgcgagc tgcgttatgt taatttgtcg ttttctacac gatagcgact 1200

gataatagca acaacacaca tgtacataca cacatataca catatatacc attattccaa 1260

acacgttaag aactgtgaaa aaataggtgg tttttatttt ggcatgttgg taaagcgtga 1320

gagcagagtg gagcaaccct tggataatgg ctactaagga tatccatctg tgcattatat 1380

aataacgtgg atgtacaccg agtcgcgcat gacaccgagc gcgcaccctt tatacatagt 1440

aaatccgttc gtgtgcttcg cccaattcaa gtctagtttt caccaaagtt ccaaatctg 1499

Claims

1.水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；7个重组突变体Mai1～7核苷酸序列分别如SEQ ID NO.44～50所示。

2.权利要求1所述的水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPii-C编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。

3.含有权利要求1所述基因的载体。

4.含有权利要求3所述载体转化的转基因菌株。

5.利用权利要求1所述基因在设计特异性分子标记中的应用。

6.稻瘟病菌无毒基因AvrPii的特异性分子标记，其特征在于：该特异性分子标记包括AvrPii-C和AvrPii-J；分别通过引物对AvrPii-C-F/R：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4和AvrPii-J-F/R：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6扩增得到。

7.权利要求1所述基因、权利要求6所述的特异性分子标记的应用，其特征在于：所述的基因或特异性分子标记在进行稻种资源抗病基因的筛选及鉴定，或对水稻品种进行精准的抗病基因鉴定中的应用。

8.权利要求1所述基因、权利要求6所述的特异性分子标记的应用，其特征在于：所述的基因或特异性分子标记在建立分子检测体系，监测田间稻瘟病菌群体的生理小种组成及其群体遗传结构的动态变化情况，进行合理的布局及轮换，或者，进行稻种资源稻瘟病抗病基因Pii及其等位基因的筛选与其在育种计划中的应用。