CN109402046A - 一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后剪去白膜，清洗干净剪成小块；(2)消化：将剪碎后的睾丸转移至培养皿中，加入一级消化液消化至呈单个精细小管后，离心弃去上清液；(3)一级重悬：用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；(4)细胞分离：进行二级消化后，放置于显微镜观察用移液器吹成单个细胞,中和后收集至离心管离心，去除上清液得到初级细胞悬浮液；(5)二级重悬：使用培养液进行重悬，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。本发明提供了一种分离速度快，效果好的水牛精原干细胞悬浮液的制备方法，且该方法操作简便可行，易于实现。

Description

一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞与组织技术领域，特别涉及一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法。
背景技术
精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是形成***的前体细胞，在雄性哺乳动物体内，精原干细胞的增殖、分化为***的发生提供着源源不断的动力，同时也保证了遗传物质在亲子代之间的有效传递([1]Kanatsu-Shinohara et al.,2013)。自1994年成功开展精原干细胞移植技术以来([2]Brinster et al.,1994)，精原干细胞的研究成为了一个热点，且近年来又成功建立了精原干细胞的体外培养方法([3]Shinohara et al.,2003)。2011年，Shinohara等人又在体外成功开展了小鼠的无血清无饲养层的培养体系([4]Shinohara et al.,2011)，使小鼠的精原干细胞的体外培养迈上新台阶。水牛作为华南地区的特有物种，以传统役用为主，其产奶、产肉等生产性能较低，已难以满足当前人们对畜牧产品的需求。因此，若能将水牛SSCs在体外分离纯化并成功进行的体外培养，再结合移植技术和相应的遗传育种技术，将能够得到大规模的优良水牛品系。由于确定某种细胞是否为起始于干细胞十分困难，因此将这种具有水牛精原干细胞属性的细胞称为水牛精原干细胞样细胞。
水牛睾丸中有生精小管、***、***和***，要进行精原干细胞的体外培养首先要将精原干细胞样细胞分离出来，因此，需要寻找一个高效可行的分离制备精原干细胞样细胞悬液的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种分离速度快，效果好的水牛精原干细胞悬浮液的制备方法，且该方法操作简便可行，易于实现。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后在超净台中剪去白膜，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入一级消化液置于培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2～5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液；
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。
优选的，在步骤(1)中，所述水牛睾丸为3～7个月龄水牛睾丸，所述消毒为通过75％的酒精进行浸泡消毒5～15min，所述清洗是使用含双抗的PBS重复清洗三次。
优选的，在步骤(2)中，所述一级消化液为质量比1～3％的胶原酶和质量比0.001～0.005％的DNase I酶，所述消化时间为5～15min，所述培养箱为二氧化碳培养箱，培养箱的培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度。
优选的，所述离心为在50ml离心管中以1500～2500rpm的转速水平离心5～10min。
优选的，在步骤(3)中，所述PBS的添加量为10～16ml。
优选的，在步骤(4)中，所述二级消化液为0.1～0.4％的trypsin-EDTA和0.003～0.007％的DNase I酶，所述血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
优选的，在步骤(5)中，所述培养液包括以下体积份数的原料：78～88份IMDM基础培养液、6～13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.01～0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.01～0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01～0.05ng/ml GDNF、0.05～0.2ug/ml GFRα1、0.01～0.07ng/ml bFGF、0.01～0.07U/ml Lif和10-5～10-3nM/Lβ-ME。
优选的，在步骤(5)中，所述过滤为选用若干个不同孔径的细胞网，依次使用孔径由大到小的细胞网进行过滤。
优选的，所述细胞网有两种孔径，分别为70μm和40μm。
综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
本发明中先是使用含双抗的PBS清洗可以避免样本中混入其他杂物，使用EP管便于将样本充分剪碎，再转移至培养皿中消化使样本与消化液的接触面积增加，置于二氧化碳培养箱中可以实时观察消化情况，进行两步酶消化法可以将睾丸组织中的***、***等完全消解释放出精细小管内部精原干细胞，在使用移液器吹成单个细胞使细胞完全分离且有利于降低细胞的酶损害，通过两种细胞网过滤可以依次将不同不小的组织块或杂质等过滤掉。整个发明操作步骤容易操作，完全按照本发明的步骤操作细胞分离效果好，对精原干细胞样细胞后续的提纯及培养工作极其重要。
附图说明
图1为本发明中剪碎后的睾丸组织的显微镜放大图；
图2为本发明中使用胶原蛋白酶酶解后组织的显微镜放大图；
图3为本发明中使用trypsin-EDTA酶解后组织的显微镜放大图；
图4为本发明中最终获得的水牛睾丸单细胞悬液的显微镜放大图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
实施例1
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取3个月龄水牛睾丸通过75％的酒精进行浸泡消毒5min消毒后在超净台中剪去白膜，使用含双抗的PBS重复清洗三次，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入质量比1％的胶原酶和质量比0.001％的DNase I酶消化5min后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液，PBS的添加量为10ml；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含胎牛血清FBS的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液，二级消化液为0.1％的trypsin-EDTA和0.003％的DNase I酶，血清的添加量为IMDM的10％。
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用70μm和40μm的细胞网依次过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。培养液包括以下体积份数的原料：78份IMDM基础培养液、6份血清替代物KSR、0.1份胎球蛋白Fetuin、0.01份非必需氨基酸NEAA、0.01份脂质混合物Lipidmixture 1,Chemically Defined、0.01份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01ng/ml GDNF、0.05ug/ml GFRα1、0.01ng/ml bFGF、0.01U/mlLif和10-5nM/Lβ-ME。
实施例2
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取7个月龄水牛睾丸通过75％的酒精进行浸泡消毒15min消毒后在超净台中剪去白膜，使用含双抗的PBS重复清洗三次，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入质量比3％的胶原酶和质量比0.005％的DNase I酶消化5～15min后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液，PBS的添加量为16ml；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含胎牛血清FBS的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液，二级消化液为0.4％的trypsin-EDTA和0.007％的DNase I酶，血清的添加量为IMDM的10％。
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用70μm和40μm的细胞网依次过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。培养液包括以下体积份数的原料：88份IMDM基础培养液、13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.05ng/ml GDNF、0.2ug/ml GFRα1、0.07ng/ml bFGF、0.07U/mlLif和10-3nM/Lβ-ME。
实施例3
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取5个月龄水牛睾丸通过75％的酒精进行浸泡消毒5～15min消毒后在超净台中剪去白膜，使用含双抗的PBS重复清洗三次，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入质量比1～3％的胶原酶和质量比0.003％的DNase I酶消化10min后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液，PBS的添加量为13ml；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化3min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含胎牛血清FBS的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液，二级消化液为0.3％的trypsin-EDTA和0.005％的DNase I酶，血清的添加量为IMDM的10％。
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用70μm和40μm的细胞网依次过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。培养液包括以下体积份数的原料：82份IMDM基础培养液、10份血清替代物KSR、0.2份胎球蛋白Fetuin、0.02份非必需氨基酸NEAA、0.02份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.04份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.03ng/ml GDNF、0.1ug/ml GFRα1、0.04ng/ml bFGF、0.05U/mlLif和10-4nM/Lβ-ME。
实施例4
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取4个月龄水牛睾丸通过75％的酒精进行浸泡消毒8min消毒后在超净台中剪去白膜，使用含双抗的PBS重复清洗三次，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入质量比2％的胶原酶和质量比0.002％的DNase I酶消化8min后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液，PBS的添加量为12ml；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化3min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含胎牛血清FBS的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液，二级消化液为0.2％的trypsin-EDTA和0.004％的DNase I酶，血清的添加量为IMDM的10％。
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用70μm和40μm的细胞网依次过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。培养液包括以下体积份数的原料：80份IMDM基础培养液、8份血清替代物KSR、0.2份胎球蛋白Fetuin、0.02份非必需氨基酸NEAA、0.02份脂质混合物Lipidmixture 1,Chemically Defined、0.02份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.02ng/ml GDNF、0.08ug/ml GFRα1、0.02ng/ml bFGF、0.02U/mlLif和10-4nM/Lβ-ME。
实施例5
一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取6个月龄水牛睾丸通过75％的酒精进行浸泡消毒12min消毒后在超净台中剪去白膜，使用含双抗的PBS重复清洗三次，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入质量比2％的胶原酶和质量比0.004％的DNase I酶消化12min后，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液，PBS的添加量为15ml；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化4min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含胎牛血清FBS的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液，二级消化液为0.3％的trypsin-EDTA和0.006％的DNase I酶，血清的添加量为IMDM的10％。
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用70μm和40μm的细胞网依次过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。培养液包括以下体积份数的原料：85份IMDM基础培养液、12份血清替代物KSR、0.2份胎球蛋白Fetuin、0.02份非必需氨基酸NEAA、0.02份脂质混合物Lipidmixture 1,Chemically Defined、0.05份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.04ng/ml GDNF、0.15ug/ml GFRα1、0.06ng/mlbFGF、0.06U/mlLif和10-3nM/Lβ-ME。
在实施例1～实施例5中制备的水牛睾丸单细胞悬液中，分别使用显微镜观察剪碎后、胶原酶消化后、trypsin-EDTA消化后和最终获得的水牛睾丸单细胞悬液的细胞分散情况，不同实施例中同一个阶段的细胞分散情况基本一致，其中实施例5的各阶段细胞分散情况如图1、图2、图3和图4所示，其中图1中是睾丸组织剪碎后显微镜放大图，该图中精细小管与***连成一片，精细小管显示不清晰，杂质较多，容易将大部分细胞遮挡住，图2中经过胶原酶酶解后将组织分解成单个的精细小管，图中精细小管显示图像清晰，杂质较少，精细小管之间单个分离，易于分辨；图3是经过胰酶trypsin-EDTA消化后的显微镜放大图，图中精细小管被消化分解成碎片，将精细小管中的精原干细胞样细胞释放出来，碎片较多，但已将精原干细胞样细胞分离出来，再通过细胞滤网过滤即可得到水牛睾丸单细胞悬液，如图4所示，为最终获得的水牛睾丸单细胞悬液的显微镜放大图，图中细胞单个分离，且显像清晰，无杂质干扰，得到比较纯净的单细胞悬液。
本发明提供的水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法操作简单，细胞分离效果好，可在干细胞与组织技术领域中广泛应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后在超净台中剪去白膜，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至EP管中剪碎；
(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入一级消化液置于培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；
(3)一级重悬：步骤(2)中得到的下层浊液用PBS重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；
(4)细胞分离：将步骤(3)中的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2～5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞,使用含血清的IMDM将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液；
(5)二级重悬：将步骤(4)中的初级细胞悬浮液使用培养液进行重悬后，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述水牛睾丸为3～7个月龄水牛睾丸，所述消毒为通过75％的酒精进行浸泡消毒5～15min，所述清洗是使用含双抗的PBS重复清洗三次。
3.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述一级消化液为质量比1～3％的胶原酶和质量比0.001～0.005％的DNase I酶，所述消化时间为5～15min，所述培养箱为二氧化碳培养箱，培养箱的培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度。
4.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：所述离心为在50ml离心管中以1500～2500rpm的转速水平离心5～10min。
5.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述PBS的添加量为10～16ml。
6.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述二级消化液为0.1～0.4％的trypsin-EDTA和0.003～0.007％的DNase I酶，所述血清为胎牛血清FBS和血清替代物KSR中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为IMDM的10％。
7.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述培养液包括以下体积份数的原料：78～88份IMDM基础培养液、6～13份血清替代物KSR、0.1～0.3份胎球蛋白Fetuin、0.01～0.03份非必需氨基酸NEAA、0.01～0.03份脂质混合物Lipid mixture 1,Chemically Defined、0.01～0.06份B-27，该培养液该包括以下浓度比的原料：0.01～0.05ng/ml GDNF、0.05～0.2ug/ml GFRα1、0.01～0.07ng/ml bFGF、0.01～0.07U/ml Lif和10-5～10-3nM/Lβ-ME。
8.根据权利要求1所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：在步骤(5)中，所述过滤为选用若干个不同孔径的细胞网，依次使用孔径由大到小的细胞网进行过滤。
9.根据权利要求8所述的一种水牛睾丸单细胞悬浮液的制备方法，其特征在于：所述细胞网有两种孔径，分别为70μm和40μm。
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