CN109395788B - 一种管内液滴制备芯片装置 - Google Patents
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Abstract
一种管内液滴制备芯片装置，包括反应管和液滴生成芯片，液滴生成芯片包含试剂入口和与试剂入口相连的多个尺寸结构一致的分支微通道，分支微通道与液滴生成芯片底部平行并由芯片中心向外发散分布，分支微通道的出口位于液滴生成芯片侧壁外缘，并形成喷口结构用于液滴制备，反应管在液滴制备时中加载有连续相试剂，且整个液滴制备过程中连续相试剂充分淹没并浸润液滴生成芯片的分支微通道和喷口结构，分散相试剂通过试剂入口加载，在压力作用下经分支微通道到达喷口结构处断裂形成液滴；本发明提高装置集成性能，简化液滴生成过程，降低外部压力驱动控制***的成本与复杂程度，最大限度提高液滴制备频率，满足不同应用场合的分析需求。
Description
技术领域
本发明属于生化微流控技术领域，具体涉及一种管内液滴制备芯片装置。
背景技术
在针对酶合成及其活性分析、液滴数字PCR和细胞高通量筛选等生化微流控分析领域，液滴微流控技术经历了快速的发展，微液滴常常用作纳升或皮升甚至飞升级别的离散生化反应容器，在分析检测的精度、灵敏度与可重复性上具有极大的优势。另外，微流控技术自动化、易集成、通量高的优势，也可极大地提高生化分析的灵敏度与效率。液滴通常由互不相溶的连续相与分散相试剂构成，利用两相流体之间流动剪切力与界面张力等相互作用将分散相分隔成离散的纳升级及以下体积的微液滴单元。
随着微流控技术的发展，基于微流体的液滴制备方法得到快速应用与发展，常用的结构包括T型、流动聚焦(US9500664B2)、共轴流(CN105771826B)以及阶梯乳化(stepemulsification)等形式。其中，阶梯乳化的方法通常仅需要分散相的控制即可实现液滴制备，装置的并行化与集成化更容易实现。然而，该方法中制备完成的液滴往往容易在液滴制备单元附近聚集，影响后续液滴的稳定制备，在文献Macromolecular Chemistry&Physics，第218卷，2017年，第1600472页，Alessandro Ofner等人的“High-Throughput StepEmulsification for the Production of Functional Materials Using a GlassMicrofluidic Device”中描述了一种玻璃基材的高通量阶梯乳化芯片装置，通过控制连续相试剂的流动冲洗带动液滴脱离液滴制备单元，解决液滴在液滴制备单元聚集的问题，但这又增加了芯片装置的复杂程度，液滴制备后仍需转移至反应管内进行后续反应。中国专利(公开号为CN105413772B)提供了一种基于集成微通道的单/多组分液滴制备装置，包括离散相输入***和液滴生成***，但该专利中描述的液滴制备装置需要多个组件连接，难以实现装置小型化，液滴制备单元由微通道塑料薄膜配合夹板和垫板组成的离散相出口接头构成，形成一系列平行排布且出口向下的集成微通道，液滴尺寸受其结构限制难以降低，且仅适用于离散相密度大于连续相密度的液滴制备。
因此，常规阶梯乳化的液滴制备方法在装置小型化与集成化方面还存在缺陷，需要复杂的流体装置及芯片设计以实现小液滴的大规模制备。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提出一种管内液滴制备芯片装置，在提高装置集成性能的同时，简化液滴生成过程，降低外部压力驱动控制***的成本与复杂程度，最大限度提高液滴制备频率，减少液滴转移步骤并可直接在管内完成后续反应分析，试剂体系(尤其是分散相)体积在较大范围内可调节，能够满足不同应用场合的分析需求，促进液滴微流控技术在生化分析领域的发展与应用。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种管内液滴制备芯片装置，包括反应管1和与之装配的液滴生成芯片2，液滴生成芯片2包含试剂入口3和与试剂入口3相连的多个尺寸结构一致的分支微通道4，分支微通道4与液滴生成芯片2底部平行并由芯片中心向外发散分布，分支微通道4的出口位于液滴生成芯片2侧壁外缘，并形成喷口结构5用于液滴制备；
所述的喷口结构5与反应管内壁7之间存在间隙；
所述的反应管1在液滴制备时加载有连续相试剂8，且整个液滴制备过程中连续相试剂8充分淹没并浸润液滴生成芯片2的分支微通道4和喷口结构5，分散相试剂9通过试剂入口3加载，在压力作用下经分支微通道4到达喷口结构5处断裂形成液滴6，液滴6形成后因连续相试剂8和分散相试剂9的密度差异快速脱离喷口结构5。
所述的液滴生成芯片2的试剂入口3预留储液腔结构302，液滴制备时先将试剂转移到储液腔结构302内，然后对试剂入口3施加持续控制的正向压力完成流体驱动和液滴制备。
所述的分支微通道4的封合由平板结构10完成，平板结构10位于液滴生成芯片2底部，平板结构10通过键合的方式与液滴生成芯片2加工成一体，分支微通道4加工在键合面的任意一侧结构上，或者在两侧结构上加工并通过对准完成微通道封合。
所述的分支微通道4为直流道或者曲线形流道，微通道横截面为圆形、半圆形、矩形或者其它多边形，分支微通道4长度为0.5～15mm。
所述的喷口结构5为圆形、矩形或者其它多边形；矩形的尺寸为宽5～500um，高2～50um。
所述的管内液滴制备芯片装置全部或仅分支微通道4与喷口结构5经过亲疏水的表面处理；表面处理的方法包括直接涂覆、化学沉积和化学反应修饰。
所述的液滴生成芯片2与反应管1通过一对一的方式装配组合使用，即液滴生成芯片2以单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个的组合形式与相应的通过连接板结构连接的反应管1装配使用，能够并行完成单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个以及更多个分散相试剂的液滴制备。
一种管内液滴制备芯片装置的操作方法，包括以下步骤：
第一步，准备好用于液滴制备的连续相试剂8与分散相试剂9，取出反应管1和液滴生成芯片2以及用于密封液滴生成芯片2的橡胶垫12；
第二步，固定反应管1，用移液器配合一次性吸头在反应管1中加入连续相试剂8；
第三步，将液滴生成芯片2放入反应管1中进行装配，静置后连续相试剂8将在毛细力作用下充分淹没并浸润液滴生成芯片2的分支微流道4和喷口结构5；
第四步，用移液器配合一次性吸头吸取分散相试剂9加载到液滴生成芯片2的储液腔结构302中；如同时进行多个样本的液滴制备，更换一次性吸头并重复进行上述加样；
第五步，在液滴生成芯片2上表面盖上橡胶垫12，固定橡胶垫12并使得橡胶垫12上的通气孔对准储液腔结构302的中心；
第六步，对试剂入口3加载持续恒定的正向压力，通过固定时间或监测液滴制备完成后的压力突变结束液滴制备过程；分散相试剂9在压力作用下经分支微通道4到达喷口结构5处，在流体动力、两相界面张力、重力与浮力的共同作用下断裂形成液滴6；由于分散相试剂9与连续相试剂8的密度差异，液滴6将脱离喷口结构5。
移去橡胶垫12和液滴生成芯片2，得到反应管1中制备的乳液，能够直接在反应管1内进行后续反应与分析。
相比于现有液滴制备方法与装置，本发明具有以下优点：
(1)本发明管内液滴制备芯片装置中实现液滴生成的喷口结构5位于液滴生成芯片2的侧壁外缘，结合连续相试剂8与分散相试剂9密度差异，液滴6能够迅速脱离喷口结构5，液滴6的转移不依赖于连续相试剂8的流动，降低了控制***的复杂程度并减少连续相试剂8的消耗。相比于现有技术，连续相密度大于或小于分散相试剂密度时都可完成液滴制备，对连续相试剂8与分散相试剂9的限制更少，扩大了液滴制备芯片装置的应用范围。
(2)本发明管内液滴制备芯片装置中，液滴6直径主要依赖于分支微流道4和喷口结构5的微观尺寸，因此液滴6的尺寸更加可控。同时，通过调整分支微流道4和喷口结构5的微观尺寸即可实现液滴直径的改变，反应管1与试剂入口3等宏观结构以及***驱动控制组件基本都无需调整，因此可根据实验需求定制“一套***，多种规格”的液滴微流控***，这将有效降低分析检测的成本并拓展其适用范围。
(3)本发明管内液滴制备芯片装置在使用中只需一次性加载适量的连续相试剂8有效浸润喷口结构5即可进行后续的液滴制备，且随着液滴制备的进行，管内试剂量增加，喷口结构5始终浸润在连续相试剂8中，可持续进行大规模液滴制备。因此，对于同一种规格的芯片装置，无需增加连续相试剂8的消耗即可在较大范围内调整分散相试剂9的体积和液滴数量，能够提高乳液体系中分散相试剂体系的占比，满足不同生化分析领域的乳液制备需求，具有良好的兼容性与可扩展性。
(4)相较于现有技术，本发明管内液滴制备芯片装置直接在反应管内完成液滴的制备，无试剂残留和死体积，几乎所有分散相试剂9都可以生成尺寸均一的液滴6，可直接进行下一步的反应与分析过程，减少液滴6的转移步骤，避免液滴6融合与损失，提高***的集成度和工作效率。
(5)本发明管内液滴制备芯片装置结构简单可靠，可采用精密注塑或硅微加工工艺批量加工，反应管1也可由实验室常用离心管替代，能够有效降低芯片装置成本，也保证了后续分析平台的通用性。
附图说明
图1是本发明实施例1中基于离心管的管内液滴制备芯片装置的三维结构示意图。
图2-1是本发明实施例1中基于离心管的管内液滴制备芯片装置的俯视图；图2-2是图2-1的A-A向剖视图。
图3是本发明实施例1中液滴生成芯片的三维结构示意图以及芯片底部分支微通道的局部放大图。
图4-1是本发明实施例1中芯片装置液滴制备过程的示意图，此时分散相试剂密度小于离散相试剂密度；图4-2是本发明实施例1中芯片装置液滴制备过程的示意图，此时分散相试剂密度大于离散相试剂密度。
图5是实施例2中八联管形式的管内液滴制备芯片装置的三维结构示意图。
图6-1本发明实施例2中八联管形式的管内液滴制备芯片装置的俯视图；图6-2是图6-1的B-B向剖视图。
图7是本发明管内液滴制备芯片装置的操作流程。
图8是不同尺寸结构的芯片装置制备的液滴直径与毛细管数(Ca)关系图。
图9-1是分散相密度小于连续相试剂密度时，本发明管内液滴制备的实验示意图；图9-2是分散相密度大于连续相试剂密度时，本发明管内液滴制备的实验示意图。
图10是本发明管内液滴制备芯片装置的实验观测效果，其中，图(a)为管内液滴生成芯片装置实验前的明视场成像；图(b)、(c)、(d)为芯片装置管内液滴制备过程的显微观测图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作详细说明。
实施例1，参照图1、图2-1、图2-2、图3、图4-1、图4-2，一种管内液滴制备芯片装置，包括反应管1和与之装配的液滴生成芯片2，反应管1采用实验室常用离心管或者PCR管，既配合液滴生成芯片2完成液滴生成，也充当液滴收集与反应的容器，以下以0.5mL的离心管为例；所述的液滴生成芯片2为阶梯状圆柱形结构，与反应管1装配后用于液滴制备；所述的液滴生成芯片2具有试剂入口3与试剂入口3相连的多个尺寸结构一致的分支微通道4，分支微通道4与液滴生成芯片2底部平行并由芯片中心向外径向分布，分支微通道4的出口位于液滴生成芯片2侧壁外缘并形成喷口结构5，用于液滴制备；所述的液滴生成芯片2依靠芯片外部的凸台结构202与反应管1形成同轴的间隙配合，保证液滴生成芯片2的定位，同时确保喷口结构5与反应管内壁7之间保持间距。
参照图4-1和图4-2，所述的液滴生成芯片2与反应管1通过一对一的方式装配组合使用。装配后，液滴生成芯片2深入反应管1内，与反应管内壁7保持0.5～1mm间隙，保证了在最多加入100μl试剂时，液滴6和连续相试剂8不会溢出反应管1。
参照图3，所述的试剂入口3包含用于试剂存储的储液腔结构302，储液腔体结构302为一圆锥形空腔，可用于存放不超过100μL的试剂。
参照图3，所述的液滴生成芯片2的底部为一平板结构10，通过热压键合或者介质键合等方式与液滴生成芯片2加工成一体，用于封装液滴生成芯片底部的分支微流道4，保证微流道的尺寸并形成用于液滴生成的喷口结构5。
所述的喷口结构5为宽15～150μm，高5～25μm的矩形，与反应管内壁7之间存在间隙以满足液滴6生成和脱离喷口结构5的要求；喷口结构5与芯片底部平行，在液滴制备过程中始终浸润在连续相试剂8中，能够保证液滴6形成以后因密度差异迅速脱离喷口结构5，通过喷口结构5制备出直径在15μm～150μm范围内的单分散微液滴。
所述的液滴生成芯片2的材料采用热固性或热塑性高分子聚合物，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，聚碳酸酯(PC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚丙烯(PP)，环烯烃类共聚物(COC)等；或无机材料，如硅(Si)，玻璃等。
所述的管内液滴制备芯片装置全部或仅分支微通道4与喷口结构5经过亲疏水的表面处理，使得分散相试剂9在喷口结构5的表面接触角大于90°，避免分散相试剂9的粘附与残留，促进液滴6生成并迅速脱离喷口结构5；表面处理的方法包括直接涂覆、化学沉积和化学反应修饰。
本实施例的工作原理为：
参照图4-1与图4-2，反应管1在液滴制备时中加载有连续相试剂8，且连续相试剂8充分淹没并浸润液滴生成芯片2的分支微通道4和喷口结构5；分散相试剂9通过试剂入口3加载到储液腔结构302内，在持续控制的正向压力作用下经分支微通道4到达喷口结构5处断裂形成液滴6；连续相试剂8与分散相试剂9为互不相溶的两种试剂，且两种试剂的密度存在差异，密度差异为0.1～1.0g/cm3；根据连续相试剂8与分散相试剂9的密度关系，液滴6将在连续相试剂8中呈现上浮到液面或下沉到反应管1管底的现象；如图4-1所示，当分散相试剂9的密度小于连续相试剂8的密度时，液滴6生成以后上浮至连续相液面位置；如图4-2所示，当分散相试剂9的密度大于连续相试剂8的密度时，液滴6生成以后下沉至管底，不影响后续液滴生成。
实施例2，参照图5、图6-1与图6-2，一种管内液滴制备芯片装置，包括反应管1和液滴生成芯片2；为实现规模化液滴制备和芯片装置批量化生产，所述的反应管1通过第一连接板结构101以八联管的形式进行加工，反应管1采用平底的圆台形管，以减少连续相试剂的消耗；同时，液滴生成芯片2也通过第二连接板结构201以八联排的形式制作，并与反应管1进行装配，能够同时进行8组分散相试剂9的液滴制备，液滴生成芯片2底部与反应管1管底之间存在距离用于液滴6或者连续相试剂8的存储。
所述的反应管1和液滴生成芯片2不局限于八联管形式，液滴生成芯片2可以以单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个的组合形式与8联管或96孔板等形式的反应管1装配使用，并行完成单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个以及更多个分散相试剂9的液滴制备。
参照图4-1、图4-2、图5、图7，一种管内液滴制备芯片装置的操作方法，包括以下步骤：
第一步，准备好用于液滴制备的连续相试剂8与分散相试剂9，取出反应管1和液滴生成芯片2以及用于密封液滴生成芯片2的橡胶垫12；
第二步，固定反应管1，用移液器配合一次性吸头在反应管1中加入连续相试剂8；
第三步，将液滴生成芯片2放入反应管1中进行装配，静置后连续相试剂8将在毛细作用力作用下充分淹没并浸润液滴生成芯片2的分支微流道4和喷口结构5；
第四步，用移液器配合一次性吸头吸取分散相试剂9加载到液滴生成芯片2的储液腔结构302中；如同时进行多个样本的液滴制备，更换一次性吸头并重复进行上述加样；
第五步，在液滴生成芯片2上表面盖上橡胶垫12，固定橡胶垫12并使得橡胶垫12上的通气孔对准储液腔结构302的中心，以便后续气压驱动装置的气密连接；
第六步，对试剂入口3加载持续恒定的正向压力，通过固定时间或监测液滴制备完成后的压力突变结束液滴制备过程；分散相试剂9在压力作用下经分支微通道4到达喷口结构5处，在流体动力、两相界面张力、重力与浮力的共同作用下断裂形成液滴6；由于分散相试剂9与连续相试剂8的密度差异，液滴6将脱离喷口结构5，并在连续相试剂8中呈现上浮到液面或下沉到反应管1管底的现象，喷口结构5始终浸润在连续相试剂8中，不影响后续液滴6制备。
在第六步完成后，可通过对液滴生成芯片2的试剂入口3施加负压，将部分过剩的连续相试剂8通过液滴生成芯片2转移出反应管1，在不影响乳液体系的前提下降低整体反应体系的体积，有利于提高后续反应进程的效率。
移去橡胶垫12和液滴生成芯片2，得到反应管1中制备的乳液，能够直接在反应管1内进行后续反应与分析。
参照图8，图8为8组不同尺寸的分支微通道4制备的液滴直径与毛细管数(Ca)关系图，分支微通道4的尺寸(宽×高)分别为26.6um×10.5um、47.4um×10.5um、56.0um×10.5um、69.4um×10.5um、42.8um×14.3um、62.4um×14.3um、77.7um×14.3um、100.7um×14.3um，液滴直径D随分支微通道4的尺寸增大而增加；对于固定尺寸的分支微通道4，在图示毛细管数(Ca)范围内液滴的直径变化相对较小；通过上述8组尺寸的微通道可以制备出直径在35um～70um范围内的液滴。通过进一步调整分支微通道4的尺寸，本发明所述的芯片装置可以形成直径在5um至500um范围的单分散液滴，体积范围为约65fL至65nL，满足不同应用场合的液滴制备需求。
参照图9-1、图9-2，利用本发明所述芯片装置制备液滴时，分散相试剂9在压力作用下进入分支微通道4并在喷口结构5处发生阶梯乳化作用，其原理如下：在低毛细管数的流体流动条件下，分散相试剂9在喷口结构5处与连续相试剂8接触并在界面张力作用下逐渐膨胀形成球形凸起，流体内外压力平衡，界面轮廓在准静态下演化；根据杨-拉普拉斯方程，随着球形凸起生长，其内部的Laplace压力ΔP＝2γ/R逐渐减小。然而，受分支微通道4的结构尺寸限制，分散相试剂8在分支微通道4中的曲率具有最小值k*＝1/r*；当球形凸起尺寸增大至r*以上时，分支微通道4中分散相试剂8与喷口结构5处球形凸起的内部压力不再保持平衡；在Laplace压力作用下，额外的分散相试剂8被驱动到球形凸起中并引发分支微通道4中分散相试剂8流体形成颈缩，在界面张力作用下缩颈处断裂，球形凸起分离形成液滴6；由于分散相试剂9与连续相试剂8的密度差异，液滴6将脱离芯片侧壁的喷口结构5，并在连续相试剂8中呈现上浮到液面或下沉到反应管1管底的现象，避免液滴在喷口结构5处的聚集，不影响后续液滴制备。
参照图10，图10为管内液滴制备芯片装置的实验测试效果，实验中采用软光刻工艺制作PDMS材料的液滴生成芯片2，连续相试剂8为含表面活性剂的氟化油，分散相试剂9为PCR缓冲液；其中，图(a)展示了实验前的管内液滴生成芯片装置；图(b)、(c)、(d)展示了芯片装置的管内液滴制备过程；图(c)为芯片装置局部放大观测结果，可见分散相试剂9经分支微流道在喷口结构5处快速形成液滴6，液滴6上浮脱离喷口结构5，不影响后续液滴的制备，液滴制备速度快，尺寸均一；图(d)展示了液滴制备实验进行一段时间后，由于密度关系，油包水(W/O)型液滴6在油相液面上层聚集，可实现大规模管内液滴的制备，效果良好。
Claims (5)
1.一种管内液滴制备芯片装置，其特征在于：包括反应管（1）和与之装配的液滴生成芯片（2），液滴生成芯片（2）与反应管（1）一对一形成同轴间隙配合并深入反应管（1）内，液滴生成芯片（2）包含试剂入口（3）和与试剂入口（3）相连的多个尺寸结构一致的分支微通道（4），分支微通道（4）与液滴生成芯片（2）底部平行并由芯片中心向外发散分布，分支微通道（4）的出口位于液滴生成芯片(2)侧壁外缘，并形成喷口结构（5）用于液滴制备；
所述的喷口结构（5）为宽10~500μm，高2~50μm的矩形，喷口结构（5）与反应管内壁（7）之间存在间隙以满足液滴（6）生成和脱离喷口结构（5）的要求；
所述的反应管（1）在液滴制备时中加载有连续相试剂（8），且整个液滴制备过程中连续相试剂（8）充分淹没并浸润液滴生成芯片（2）的分支微通道（4）和喷口结构（5），分散相试剂（9）通过试剂入口（3）加载，在压力作用下经分支微通道（4）到达喷口结构（5）处断裂形成液滴（6），液滴（6）形成后因连续相试剂（8）和分散相试剂（9）的密度差异快速脱离喷口结构（5）；
所述的液滴生成芯片（2）的试剂入口（3）预留储液腔结构（302），液滴制备时先将试剂转移到储液腔结构（302）内，然后对试剂入口（3）施加持续控制的正向压力完成流体驱动和液滴制备；
所述的分支微通道（4）的封合由平板结构（10）完成，平板结构（10）位于液滴生成芯片（2）底部，平板结构（10）通过键合的方式与液滴生成芯片（2）加工成一体，分支微通道（4）加工在键合面的任意一侧结构上，或者在两侧结构上加工并通过对准完成微通道封合；
所述的分支微通道（4）为直流道或者曲线形流道，微通道横截面为矩形，分支微通道（4）长度为0.5~15mm。
2.根据权利要求1所述的一种管内液滴制备芯片装置，其特征在于：所述的管内液滴制备芯片装置全部或仅分支微通道（4）与喷口结构（5）经过亲疏水的表面处理；表面处理的方法包括直接涂覆、化学沉积和化学反应修饰。
3.根据权利要求1所述的一种管内液滴制备芯片装置，其特征在于：所述的液滴生成芯片（2）与反应管（1）通过一对一的方式装配组合使用，即液滴生成芯片（2）以单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个的组合形式与相应的通过连接板结构连接的反应管（1）装配使用，能够并行完成单个、2个、4个、8个、24个、48个或96个以及更多个分散相试剂的液滴制备。
4.利用权利要求1所述的一种管内液滴制备芯片装置的操作方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，准备好用于液滴制备的连续相试剂（8）与分散相试剂（9），取出反应管（1）和液滴生成芯片（2）以及用于密封液滴生成芯片（2）的橡胶垫（12）；
第二步，固定反应管（1），用移液器配合一次性吸头在反应管（1）中加入连续相试剂（8）；
第三步，将液滴生成芯片（2）放入反应管（1）中进行装配，静置后连续相试剂（8）将在毛细作用力作用下充分淹没并浸润液滴生成芯片（2）的分支微通道（4）和喷口结构（5）；
第四步，用移液器配合一次性吸头吸取分散相试剂（9）加载到液滴生成芯片（2）的储液腔结构（302）中；如同时进行多个样本的液滴制备，更换一次性吸头并重复进行上述加样；
第五步，在液滴生成芯片（2）上表面盖上橡胶垫（12），固定橡胶垫（12）并使得橡胶垫（12）上的通气孔对准储液腔结构（302）的中心；
第六步，对试剂入口（3）加载持续恒定的正向压力，通过固定时间或监测液滴制备完成后的压力突变结束液滴制备过程；分散相试剂（9）在压力作用下经分支微通道（4）到达喷口结构（5）处，在流体动力、两相界面张力、重力与浮力的共同作用下断裂形成液滴（6）；由于分散相试剂（9）与连续相试剂（8）的密度差异，液滴（6）将脱离喷口结构（5）。
5.根据权利要求4所述的一种管内液滴制备芯片装置的操作方法，其特征在于：移去橡胶垫（12）和液滴生成芯片（2），得到反应管（1）中制备的乳液，能够直接在反应管（1）内进行后续反应与分析。
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