CN109385385A - 一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用 - Google Patents

一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明的禽支原体培养基由基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，辅助成份为明胶、吐温80和氯化钙；生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，经菌液接种、培养、收获，生产禽支原体菌液，制得禽支原体疫苗。本发明制备方法提高了禽支原体菌液的抗原含量，简化生产工艺，降低了生产成本，减少疫苗免疫副反应发生几率，提升疫苗免疫效果。

Description

一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用。
背景技术
禽支原体病(Avian Mycoplasmosis，AM)是由禽支原体引起的家禽的一种传染病，临床上常见的病原为鸡毒支原体(Mycoplasma Galliscepticum，MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma Synoviae，MS)。鸡毒支原体感染可引起禽的慢性呼吸道病(Chronicrespiratory Disease，CRD)，气囊炎和窦炎；鸡滑液囊支原体感染可引起关节肿大、滑液囊及肌腱发炎和实质器官肿大等症状；有效的疫苗免疫是防控该病的主要手段。
目前禽支原体疫苗生产主要应用改良Frey氏培养基、CM2培养基等进行培养，这些培养基血清浓度较高(一般在10％以上)，培养菌液的浓度不高(一般108-10CCU/ml)，每次生产需重新繁殖菌种，生产操作繁琐，成本偏高，疫苗产品质量不稳定(抗原含量和纯度不高)，容易出现副反应。因此，亟需开发一种高效、低成本、便捷的禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷，提供了一种高效便捷、低成本的禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用。
为了解决上述技术方案，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种禽支原体培养基，所述的禽支原体培养基由禽支原体基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，所述的辅助成份由明胶、吐温80和氯化钙组成。
进一步地，所述的基础培养基为常规的CM2液体培养基、CM培养基或改良Frey氏培养基中的任意一种。
进一步地，所述的辅助成份用量为成品培养基质量体积比(m:V)的如下组分组成：
明胶 0.2-0.4％，
吐温80 0.5-1％，
氯化钙 0.2-0.4％。
本发明的一种禽支原体菌液的制备方法，生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，菌液包括如下步骤：
(1)将合格的禽支原体生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基中，充分混匀后36-37℃静置培养，培养6-8小时；
(2)培养温度提高至38-39℃，50-100r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置2-4小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3-1/2；
(3)向上述剩余培养液中，补加2-3倍浓缩的禽支原体培养基，重复步骤(2)继续传代培养，收获总体积1/3-1/2的下层培养液；依照此法连续流加培养4-6代，制得禽支原体菌液。
本发明所述的禽支原体培养基在制备禽支原体疫苗中的应用。
本发明所述的禽支原体菌液在制备禽支原体疫苗中的应用。
有益效果：本发明制备方法提高了禽支原体菌液的抗原含量，简化生产工艺，降低了生产成本，减少疫苗免疫副反应发生几率，提升疫苗免疫效果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明采用新型培养基、并在培养过程中调节培养温度，显著提高了禽支原体菌液的抗原含量，其菌液滴度高达1013-14CCU/ml，高于现有疫苗半成品菌液的质量标准。
(2)本发明采用流加培养方式，仅在首次培养前制备一次禽支原体生产用种子，省略后期各代生产用种子制备，简化生产工艺、节省人力，缩短生产周期20天以上。
(3)本发明禽支原体菌液可稀释后制备疫苗，降低了生产成本；且成品疫苗抗原纯度高，血清蛋白及代谢产物等杂质大幅降低，减少免疫副反应发生几率，提升疫苗免疫效果。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
本发明的一种禽支原体培养基，所述的禽支原体培养基由禽支原体基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，所述的辅助成份由明胶、吐温80和氯化钙组成。
所述的基础培养基为改良Frey氏培养基。
所述的辅助成份用量为成品培养基质量体积比(m:V)的如下组分组成：
明胶 0.2-0.4％，
吐温80 0.5-1％，
氯化钙 0.2-0.4％。
本发明的一种禽支原体菌液的制备方法，生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，菌液包括如下步骤：
(1)将合格的禽支原体生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基中，充分混匀后36℃静置培养，培养8小时；
(2)培养温度提高至39℃，100r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置4小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/2；
(3)向上述剩余培养液中，补加2倍浓缩的禽支原体培养基，重复步骤(2)继续传代培养，收获总体积1/2的下层培养液；依照此法连续流加培养4代，制得禽支原体菌液。
本发明所述的禽支原体培养基在制备禽支原体疫苗中的应用。
本发明所述的禽支原体菌液在制备禽支原体疫苗中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明的一种禽支原体培养基，所述的禽支原体培养基由禽支原体基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，所述的辅助成份由明胶、吐温80和氯化钙组成。
所述的基础培养基为CM培养基。
所述的辅助成份用量为成品培养基质量体积比(m:V)的如下组分组成：
明胶 0.2-0.4％，
吐温80 0.5-1％，
氯化钙 0.2-0.4％。
本发明的一种禽支原体菌液的制备方法，生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，菌液包括如下步骤：
(1)将合格的禽支原体生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基中，充分混匀后36.5℃静置培养，培养6小时；
(2)培养温度提高至38.5℃，50r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置2小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3；
(3)向上述剩余培养液中，补加3倍浓缩的禽支原体培养基，重复步骤(2)继续传代培养，收获总体积1/3的下层培养液；依照此法连续流加培养6代，制得禽支原体菌液。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明的一种禽支原体培养基，所述的禽支原体培养基由禽支原体基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，所述的辅助成份由明胶、吐温80和氯化钙组成。
所述的基础培养基为常规的CM2液体培养基。
所述的辅助成份用量为成品培养基质量体积比(m:V)的如下组分组成：
明胶 0.2-0.4％，
吐温80 0.5-1％，
氯化钙 0.2-0.4％。
本发明的一种禽支原体菌液的制备方法，生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，菌液包括如下步骤：
(1)将合格的禽支原体生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基中，充分混匀后37℃静置培养，培养7小时；
(2)培养温度提高至38℃，80r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置3小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3；
(3)向上述剩余培养液中，补加3倍浓缩的禽支原体培养基，重复步骤(2)继续传代培养，收获总体积1/3的下层培养液；依照此法连续流加培养5代，制得禽支原体菌液。
试验1
1.禽支原体培养基配制
配制培养基的原材料市场有售；菌种：鸡毒支原体F36株、鸡毒支原体CR株、滑液支原体(CVCC385株)和鸡毒支原体R株均购自中国兽医药品监察所，鸡滑液囊支原体MS-H株从市场疫苗株中获得，仅用于实验验证本发明方法。
(1)配制禽支原体培养基1
基础培养基为CM2液体培养基，依据“农牧函(1998)38号”制备培养基；在配制CM2液体培养基的基础成分时，同时添加辅助成份，按照成品培养基质量体积比(m:V)明胶0.2-0.4％、吐温80 0.5-1％和氯化钙0.2-0.4％添加，115℃高压20min，冷却后无菌加入猪血清、无菌25％酵母浸出液和青霉素，用1.0mol/L NaOH调pH值至7.6-8.0，配制成禽支原体培养基1。无菌检验合格后备用。
(2)配制禽支原体培养基2
基础培养基为CM液体培养基，依据“农业部公告297号”制备培养基；在配制CM液体培养基的基础成分时，同时添加辅助成份，按照成品培养基质量体积比(m:V)明胶0.2-0.4％、吐温80 0.5-1％和氯化钙0.2-0.4％添加，115℃高压20min，冷却后无菌加入猪血清、25％酵母浸出液、青霉素，用氢氧化钠调PH至7.6-8.0，配制成禽支原体培养基2。无菌检验合格后备用。
(3)配制禽支原体培养基3
基础培养基为改良Frey液体培养基，依据中华人民共和国兽药典(2015版)附录制备培养基；在配制改良Frey液体培养基的基础成分时，同时添加辅助成份，按照成品培养基质量体积比(m:V)明胶0.2-0.4％、吐温80 0.5-1％和氯化钙0.2-0.4％添加，115℃高压20min，冷却后无菌加入猪血清、2％辅酶Ⅰ、1％L-半胱氨酸溶液、青霉素，用氢氧化钠调pH至7.6-8.0，配制成禽支原体培养基3。无菌检验合格后备用。
2.鸡毒支原体(F36株)菌液培养
(1)将鸡毒支原体(F36株)生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基1中，充分混匀后37℃静置培养，培养7小时，然后将培养温度提高至39℃，80r/min搅拌培养10.5小时培养基的pH下降到7.2，停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置3小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/2，并进行菌液浓度CCU测定。同时设立对照组，按现有培养工艺生产(农牧函(1998)38号)。
(2)向上述剩余培养液中，补加2倍浓缩的禽支原体培养基1至原体积，然后39℃，80r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置3小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/2，并进行菌液浓度CCU测定；依照此法连续流加培养5代，收获菌液作为制备疫苗用半成品。
(3)将上述1、2、4、6代和对照组菌液分别进行活菌数测定，浓度分别为4.0×1014CCU/ml、3.0×1014CCU/ml、6.0×1013CCU/ml、8.0×1014CCU/ml和4.0×109CCU/ml。
3.鸡毒支原体(CR株)菌液培养
按照实施例2方法用禽支原体培养基2培养鸡毒支原体CR株，并设立对照组(按现有工艺生产，农业部公告297号)，1、2、4、6代和对照组菌液分别进行活菌数测定，浓度分别为1.0×1013CCU/ml、6.0×1013CCU/ml、5.0×1014CCU/ml、7.0×1014CCU/ml和3.0×109CCU/ml。
4.鸡毒支原体疫苗制备
活疫苗制备：将实施例1中1、2、4、6代鸡毒支原体F36株半成品菌液用0.1MpH7.2PBS分别稀释至4.0×109CCU/ml，和对照组菌液，均按照鸡毒支原体活疫苗制造及检验试行规程草案(农牧函(1998)38号)制备鸡毒支原体活疫苗。将制备的5组疫苗，分别喷雾20日龄SPF鸡，10只/组，1羽份/只，并设立空白对照，免疫后观察14天，并于免疫后28日用鸡毒支原体强毒R株进行攻毒，攻毒后观察14日，剖解观察病变情况，不同培养工艺鸡毒支原体活疫苗安全性和效力比较结果详见表1。
表1
从表1可以看出，原有生产工艺制备的鸡毒支原体活疫苗制品进行喷雾免疫有轻微免疫副反应，攻毒后免疫保护率在9/10，采用本发明工艺制备的疫苗喷雾免疫未见免疫副反应，免疫组鸡只均得到良好保护。
灭活疫苗的制备：将实施例1中1、2、4、6代鸡毒支原体CR株半成品菌液用0.1MpH7.2PBS分别稀释至3.0×109CCU/ml，和对照组菌液，均按照鸡毒支原体灭活疫苗制造及检验试行规程草案(农业部公告297号)制备鸡毒支原体灭活疫苗。将制备的5组疫苗，分别肌注免疫40日龄SPF鸡，10只/组，1羽份/只，并设立空白对照，免疫后观察14天，并于免疫后28日用鸡毒支原体强毒R株进行攻毒，攻毒后观察14日，剖解观察病变情况，不同培养工艺鸡毒支原体灭活疫苗安全性和效力比较结果详见表2。
表2
从表2可以看出，原有生产工艺制备的鸡毒支原体灭活疫苗制品有轻微免疫副反应，攻毒后免疫保护率在9/10，采用本发明工艺制备的疫苗未见免疫副反应，免疫组鸡只均得到良好保护。
5.鸡滑液囊支原体菌液培养及疫苗制备
(1)将鸡滑液囊支原体(MS-H株)生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基3中，充分混匀后36℃静置培养，培养8小时，然后将培养温度提高至38℃，100r/min搅拌培养9小时培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置4小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3，并进行菌液浓度CCU测定。
(2)向上述剩余培养液中，补加3倍浓缩的禽支原体培养基3至原体积，然后38℃，100r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置4小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3，并进行菌液浓度CCU测定；依照此法连续流加培养5代，收获菌液作为制备疫苗用半成品。
(3)将上述1、2、4和6代收获菌液均进行活菌数测定，浓度分别为3.0×1014CCU/ml、5.0×1014CCU/ml、7.0×1013CCU/ml和8.0×1014CCU/ml。
(4)将上述1、2、4、6代鸡滑液囊支原体F36株半成品菌液用0.1M pH7.2PBS分别稀释至4.0×109CCU/ml，均参照农牧函(1998)38号制备鸡滑液囊支原体活疫苗。将制备的4组疫苗分别喷雾免疫40日龄SPF鸡，10只/组，1羽份/只，并设立进口疫苗对照组和空白对照组，免疫后观察14天，并于免疫后28日用鸡滑液囊支原体进行攻毒，攻毒后观察14日，剖解观察病变情况，不同培养工艺鸡毒支原体灭活活疫苗安全性和效力比较结果详见表3。
表3
从表3可以看出，进口对照鸡滑液囊支原体活疫苗进行喷雾免疫有轻微免疫副反应，攻毒后免疫保护率在9/10，采用本发明工艺制备的疫苗喷雾免疫未见免疫副反应，免疫组鸡只均得到良好保护。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种禽支原体培养基，其特征在于：所述的禽支原体培养基由禽支原体基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，所述的辅助成份由明胶、吐温80和氯化钙组成。
2.根据权利要求1所述的禽支原体培养基，其特征在于：所述的基础培养基为常规的CM2液体培养基、CM培养基或改良Frey氏培养基中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的禽支原体培养基，其特征在于：所述的辅助成份用量为成品培养基质量体积比(m:V)的如下组分组成：
明胶 0.2-0.4％，
吐温80 0.5-1％，
氯化钙 0.2-0.4％。
4.一种禽支原体菌液的制备方法，其特征在于：生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，菌液包括如下步骤：
(1)将合格的禽支原体生产用种子按体积比(V:V)10％接种于禽支原体培养基中，充分混匀后36-37℃静置培养，培养6-8小时；
(2)培养温度提高至38-39℃，50-100r/min搅拌培养8-12小时，待培养基的pH下降到7.2停止搅拌，降低培养温度至22℃，再静置2-4小时，收获下层培养液，收获量为培养液总体积的1/3-1/2；
(3)向上述剩余培养液中，补加2-3倍浓缩的禽支原体培养基，重复步骤(2)继续传代培养，收获总体积1/3-1/2的下层培养液；依照此法连续流加培养4-6代，制得禽支原体菌液。
5.一种权利要求1至3任一项所述的禽支原体培养基在制备禽支原体疫苗中的应用。
6.一种权利要求4所述的禽支原体菌液在制备禽支原体疫苗中的应用。
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