CN109384839A - 胰高血糖素样肽-1类似物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种胰高血糖素样肽‑1类似物的前体多肽或其药学上可接受的盐，所述前体多肽具有以下通式Ⅰ所示的氨基酸序列；通式ⅠHX1X2GTFTSDVSSYLEEX3AAX4EFIX5WLVKX6X7X8X9；其中，所述X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9表示任意的氨基酸。本发明还提供一种胰高血糖素样肽‑1类似物或其药学上可接受的盐。本发明的胰高血糖素样肽‑1类似物由基于内源性GLP‑1(7‑36/37)序列优化后的多肽和特定结构的聚乙二醇缀合而得，具有更强的降血糖活性，可减少用药剂量，而且体内半衰期显著延长，有望提高临床依从性，并且本发明提供的前体多肽序列与内源性GLP‑1(7‑36/37)高度同源，可以降低免疫原性，因此具有更好的作为药物开发应用的潜力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种胰高血糖素样肽-1类似物及其医药用途。
背景技术
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种肠源性激素，主要在末端空场、回肠和结肠的L细胞合成，进餐反应中释放到循环。GLP-1(7-36，7-37)是体循环中GLP-1的主要活性形式，通过复杂的机制控制血糖，包括胰岛素和胰高血糖素的分泌，胃的排空以及外周胰岛素的调节。GLP-1(7-36，7-37)降血糖作用是葡萄糖依赖性的，可避免低血糖发生，而且具有抑制胰岛β-细胞的凋亡，促进胰岛β-细胞增生的作用，可逆转病情发展。但天然GLP-1的血浆半衰期仅为1-2分钟，代谢不稳定性限制其作为药物的应用。
酶降解和肾清除是多肽类物质体内代谢的主要途径。研究表明，体内的二肽激肽酶(DPPIV)特异性识别并降解GLP-1结构中受体结合活性部位N端His-Ala片段而使其快速失活，同时其他蛋白水解酶如内肽酶等也参与多肽体内降解过程。肾脏在消除肽、蛋白等物质中起重要作用，血浆中分子量小于5KD并且有效半径小于的游离部分分子易被肾小球滤过，而且在肾循环中肽类激素(如降钙素、GLP-1)被肾皮质中的代谢酶降解，进一步***到尿中。研究报道肾脏负责清除至少80％的Exendin-4(CN1372570)。
提高代谢稳定性，延长血浆半衰期，从而提高临床用药依从性是基于GLP-1的药物开发领域的技术目标。现有的专利技术中针对人源GLP-1序列的酶降解关键位点的结构改造(CN00806548.9、CN99814187.9、CN200410017667.9等)只考虑了酶降解一个消除因素，达不到理想的长效；而通过在母体肽链结构中引入脂肪酰基团，提高与血浆蛋白结合力以避免多肽在体内快速清除(CN201210513145.2、CN200810124641.2、CN20118000352.1等)的技术虽可一定程度上延长半衰期(如已上市的利拉鲁肽每日给药一次)，其用药依从性仍有待提高，而且由于其中的血浆蛋白结合率高，导致药效延迟，还因为在肽链中引入脂肪链导致其溶解性降低，制剂中需使用有机溶剂。
聚乙二醇(PEG)化技术是当前蛋白质/多肽类给药领域一项较适用的长效化技术。通常采用线性直链或分枝状的聚乙二醇对蛋白质/多肽进行修饰，可以提高蛋白质/多肽的理化性质稳定性，降低免疫原性，提高抗蛋白酶降解能力，降低肾清除作用对药物的代谢，使药物的体内半衰期显著延长，同时提高药物溶解度以及增强细胞膜的穿透力。一般而言，高分子量(≥20KD)PEG修饰更有利于延长多肽或蛋白类药物的体内半衰期，但通常每个PEG分子只有1个活性端基与前体活性分子偶联，分子载药量受限，而且高分子修饰后的多肽与受体的结合作用通常减弱,影响药效,因此,前体多肽的活性强度是决定最终修饰产物成药性的重要因素。此外，前体多肽的理化性质对修饰反应的效率、终产物的收率以及质量的影响较大，因此，选择合适的GLP-1类似物分子作为高分子修饰的前体多肽，是实现目标分子的长效化药效的重要因素。
发明内容
针对现有技术的局限性，本发明的目的是提供一种胰高血糖素样肽-1类似物，其为内源性GLP-1(7-36/37)经序列优化后的多肽前体的高分子聚合物，更具体地为所述类似物的聚乙二醇缀合物。
本发明意外地发现一类经过结构变换得到的GLP-1类似物，其对GLP-1受体的激动活性显著增强，而且溶解性和稳定性得到了明显改善，将其用作高分子修饰的前体多肽，不仅提高了目标产物的生物活性,而且还提高了高分子修饰的反应效率、终产物的收率以及质量。
本发明的胰高血糖素样肽-1类似物具有更强的降血糖活性，可减少用药剂量，而且体内半衰期显著延长，有望提高临床依从性，并且本发明提供的胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽序列与内源性GLP-1(7-36/37)高度同源，可以降低免疫原性，因此具有更好的作为药物开发应用的潜力。
一方面，本发明提供一种胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽或其药学上可接受的盐，所述前体多肽具有以下通式Ⅰ所示的氨基酸序列；
通式ⅠHX1X2GTFTSDVSSYLEEX3AAX4EFIX5WLVKX6X7X8X9；
其中，所述X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9表示任意的氨基酸。
优选地，所述胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽序列如SEQ ID NO:1-56中任一条所示；
另一方面，本发明提供一种胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其为上述前体多肽或其药学上可接受的盐的聚乙二醇缀合物；
优选地，所述聚乙二醇的平均分子量范围为5-50KDa，更优选地为20-50KDa；进一步优选地为40-50KDa；
优选地，所述聚乙二醇是直链型、分支型聚乙二醇；
优选地，所述聚乙二醇选自平均分子量范围为40-50KDa的分支型聚乙二醇，再优选地为40-50KDa的二分支型聚乙二醇。
优选地，所述聚乙二醇通过分子端基上的活化基团缀合于胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，所述活化基团选自马来酰亚胺基、巯基、琥珀酰亚胺基、醛基、卤素等活性官能团，优选马来酰亚胺基；
优选地，所述聚乙二醇通过活化基团缀合于SEQ ID NO:1-56任一条的赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链；更优选地，所述聚乙二醇通过活化基团缀合于SEQ ID NO:9-12、17-20中任一条。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述任一项所述的前体多肽或其药学上可接受的盐，或胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；更优选地，所述载体和/或辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂中的一种或多种；
优选地，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖等中的一种或多种；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐中的一种或多种；所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
本发明再一个目的是提供所述胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽或其药学上可接受的盐，所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的药物组合物中的用途，以及所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的药物中的用途。
发明内容的详细说明
多肽序列
本发明所述的胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽是GLP-1(7-36/37)的人工修饰形式。GLP-1(7-36/37)的天然序列为：
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNH2/G。血液中的二肽激肽酶(DPPIV)将N端的His-Ala二肽片段水解切除，剩余的GLP-1(9-36/37)序列失去或减弱生物活性，本发明的实施方案中对内源性序列中X8或X9进行适当的氨基酸替换，本发明实施例3的实验结果表明本发明所采取的措施可以有效避免多肽的酶降解失活。
一般的，作用于B型GCGR受体的多肽类配体是以α-螺旋二级结构与受体结合，因此，利于形成α-螺旋的结构变换有助于提高多肽与受体的结合力，增强多肽的生物活性。
在本发明实施方案中，对人源GLP-1(7-36/37)序列中的适当位点进行了氨基酸替换，如G22/E、G35/Aib，以增强前体多肽的生物活性。本发明实施例中将本发明提供的前体多肽与Gly2、Cys37GLP-1(7-37)(序列SEQ IDNO:57
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC)以及Gly2、Aib35、Ala38、Cys39GLP-1(7-37)(序列SEQ ID NO:58
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGAC)进行对比试验，结果表明，经过这些变换而得的多肽序列在体外对GLP-1受体的激动活性显著增强，在体内动物试验中显示了更强的降血糖活性和更好的体内稳定性。
同时，为便于定点缀合修饰聚乙二醇基团，对序列的适当位点引入或替换半胱氨酸残基(A30/C、C37、C38)，或经过适当替换,序列中只保留了一个赖氨酸残基(K34/R、K26/R)。本发明实施例的研究结果表明这些结构变化未对多肽的活性产生影响。本发明实施例5中显示的实验结果表明，本发明提供的优选多肽的聚乙二醇修饰体，其对GLP-1受体的激动活性明显强于其他活性相对弱的前体多肽修饰物，而且实施例8中的降血糖药效研究结果也提示优选多肽的聚乙二醇缀合物具有更好的药效和长效性，剂量减少，因此更具成药性潜力。
通常，用于高分子修饰的前体多肽的理化性质对修饰反应的效率、终产物的收率以及质量的影响比较大。前体多肽在修饰反应体系中(一般是适当pH值的缓冲溶液)溶解性差，多肽聚集物析出，将导致反应效率降低，后处理中需要增加去除残留多肽的步骤，如离心、分子筛色谱分离等，甚至直接以有机溶剂如DMSO等作为反应溶剂，增加后处理难度和延长制备周期。本发明实施方案中意外的发现经过前述结构变换所提供的多肽，溶解性和稳定性明显改善，更适合作为高分子修饰的前体多肽。如实施例4，在所采用的反应体系中前体多肽均较好的溶解，反应效率高，终产物中无残留多肽或其他杂质，后续纯化处理简便，目标产物的收率(平均75-80％)和质量(纯度≥98％)均达到预期水平。
聚乙二醇化
多肽类激素在机体内主要通过酶降解和肾清除途径代谢，其中肾清除占主导，是影响多肽类药物体内半衰期的主要因素。多肽序列中一些氨基酸残基侧链上的结构修饰特别是烷基化或聚乙二醇等大分子基团的缀合可以延缓肾清除，有效延长生物半衰期。
本发明的特定实施方案中，所提供多肽序列中至少包含一个位点为Cys，或Lys，以便在Cys的侧链巯基或Lys侧链的ε-NH2上定点共价缀合聚乙二醇(PEG)基团。所述聚乙二醇的平均分子量为5-50KD；更优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为20-50KDa；进一步优选地，所述聚乙二醇的平均分子量为40-45KDa；
用于修饰的聚乙二醇通常是包含有一个活化基团的直链或分支型的结构，其中分支型聚乙二醇包括二分支和四分支型，所述活化基团是指能够与多肽结构中的游离巯基或氨基共价结合的基团，例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基。
本发明的实施方案中优选二分支型聚乙二醇，而且优选包含有1个或2个活化官能团，所述活性官能团优选马来酰亚胺基。
本发明所述的聚乙二醇是通过多种途径可以得到，包括商业途径获得或者根据本领域中已知的方法自行制备。本发明实施方案中用于修饰的聚乙二醇优选但不限于选自如下结构：
本发明所述PEG修饰可以通过本领域公知的任何方法实现，包括经由酰化、还原性烷化、Michael加成、硫醇烷化或通过PEG部分的活性基团(例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤代乙酰基、马来酰亚胺基或肼基)的其他化学选择性缀合方法。在本发明的特定实施方案中，通过Michael加成反应，即用马来酰亚胺活化的PEG修饰Cys的巯基侧链，通过硫醚键连接的聚乙二醇化多肽。
用途
针对目前治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征等现有药物治疗的局限性，本发明提供一种新型治疗方法，所述方法涉及给予包含本发明的前体多肽或其药学上可接受的盐，或胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐的药物组合物。包含本发明的前体多肽或其药学上可接受的盐，或胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐的药物组合物在有效地降低血糖的同时具有长效性，可以提高用药依从性，更具临床应用潜力。
药物组合物
再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述前体多肽或其药学上可接受的盐，或胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。
更优选地，所述载体和/或辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂中的一种或多种。
优选地，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖等中的一种或多种；所述pH调节剂包括但不限于枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐中的一种或多种；所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
再另一方面，本发明提供了上述前体多肽或其药学上可接受的盐，或胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的药物组合物中的用途。
优选地，本发明所述的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂的形式或口服、直肠、鼻腔给药。剂量范围可以为5μg-10mg/次，这取决于治疗对象、给药方式、适应症以及其他因素等。
合成
在本发明提供的具有通式Ⅰ结构的前体多肽的基本肽链是通过本领域公知的方法制备得到：
1)通过常规固相或液相方法逐步或通过片段组装合成；
2)在宿主细胞中表达编码多肽的核酸构建体，并从宿主细胞培养物回收表达产物；
3)影响编码多肽的核酸构建体的无细胞体外表达，并回收表达产物；
或通过方法1)、2)或3)的任意组合来获得肽片段，随后连接这些片段以获得目标肽。
优选地，使用Fmoc固相合成方法制备得到目标肽。
优选地，通过以下方法完成目标多肽的聚乙二醇化修饰：将经过活化的PEG与本发明的多肽pH5.0-7.0反应，其中PEG与肽的摩尔比值为1-10，反应时间为0.5-12小时，反应温度为4-37℃。
缀合反应之后，可以通过本领域公知的合适方法将目标产物分离。适用的方法包括但不限于超滤法、透析法或色谱法等。
活性评价
本发明的实施方案中采用正常小鼠糖负荷试验，以利拉鲁肽为阳性对照药，评价了本发明提供前体多肽的降血糖活性和长效性。
本发明的另一个实施方案中采用ob/ob糖尿病模型小鼠评价了所述胰高血糖素样肽-1类似物的降血糖作用和对体重的影响，结果表明本发明提供的胰高血糖素样肽-1类似物具有显著的降血糖作用，而且给药频率减少，具有明显的应用优势。
附图说明
图1为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽、胰高血糖素样肽-1类似物以及该类似物修饰基团的HPLC色谱图，其中图A为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽SEQ ID NO:9、图B为胰高血糖素样肽-1类似物SEQ ID NO:9-Ⅱ、图C为结构Ⅱ(mPEG)2-Mal(40KDa)的HPLC色谱图；
图2为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物SEQ ID NO:9-Ⅱ的MALDI-TOF图；
图3为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物SEQ ID NO:9-Ⅱ与SEQ ID NO:58-Ⅱ(见实施例2)的降血糖作用和长效性比较。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本实施例仅为解释本发明，不意味以任何方式限制本发明内容。
氨基酸缩写的说明：
Gly：甘氨酸(G)
Ala：丙氨酸(A)
Val：缬氨酸(V)
Leu：亮氨酸(L)
Phe：苯丙氨酸(F)
Trp：色氨酸(W)
Ser：丝氨酸(S)
Thr：苏氨酸(T)
Glu：谷氨酸(E)
Gln：谷氨酰胺(Q)
Asp：天冬氨酸(D)
Asn：天冬酰胺(N)
Tyr：苯丙氨酸(Y)
Arg：精氨酸(R)
Lys：赖氨酸(K)
His：组氨酸(H)
Aib：α-氨基异丁酸
试剂缩写的说明
Boc:叔丁氧基羰基
Tert-Bu:叔丁基
DCM:二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
Fmoc:9-芴甲氧基羰基
HoBt:1-羟基苯并***
HBTU:2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
HATU:O-(7-氮杂苯并***-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基-脲鎓六氟磷酸酯
Mtt:4-甲基三苯甲基
NMP:N-甲基吡咯烷酮
DMF:二甲基甲酰胺
Pbf:2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃
Trt:三苯基甲基
EDT:乙二硫醇
TFA:三氟乙酸
TIS:三异丙基硅烷
FBS:胎牛血清
实施例1制备胰高血糖素样肽-1类似物前体多肽
通过以下的步骤制备通式Ⅰ所示的前体多肽
1)合成：采用Fmoc策略，用CS 336型多肽合成仪(CS Bio)，按照如下步骤逐步合成：
a)在活化剂***存在下由树脂固相载体和Fmoc保护的C-端氨基酸偶联得到Fmoc-氨基酸-树脂；其中，合成C-端酰胺化多肽采用氨基树脂，如Rink Amide AM，Rink Amide，Rink MBHA等。
b)肽链的延长：通过固相合成法按照肽序列氨基酸顺序连接氨基酸，得到N-端和侧链保护的肽-树脂偶联物；带侧链氨基酸采取如下保护措施：色氨酸用Boc，谷氨酸用OtBu，赖氨酸用Boc，谷氨酰胺用Trt，酪氨酸用tBu，丝氨酸用Trt或tBu，天冬氨酸用OtBu，苏氨酸用tBu，半胱氨酸用Trt，组氨酸用Trt或Boc，精氨酸用Pbf保护。使用的偶联活化剂为HOBT/HBTU/DIEA和HOBT/HATU/DIEA，茚三酮法检测反应效率。
c)树脂上多肽的裂解：TFA/EDT/TIS/H2O(92.5:2.5:2.5:2.5v/v)溶液，置室温下反应90min，脱保护和脱树脂。抽滤得滤液，用过量***沉淀粗多肽，离心，收集沉淀，再用少量***洗涤沉淀，真空下干燥，得粗品多肽。同时脱除保护基和树脂，得到粗品胰高血糖素样肽-1和胰高血糖素片段类似物嵌合多肽；
2)纯化：将粗品多肽溶解于水或10-15％乙腈(10-50mg/ml)，加入50-100mM的二硫基苏糖醇DTT或β-巯基乙醇进行变性，采用制备型HPLC法，C18色谱柱，乙腈－水－三氟乙酸***分离纯化，浓缩，冻干，得巯基游离的纯品多肽。
以上述方法制备得到以下SEQ ID NO:1-56所示的前体多肽。
SEQ ID NO:1HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:2HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:3HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:4HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:5HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:6HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:7HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKGC-NH2
SEQ ID NO:8HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:9HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:10 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:11 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:12 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:13HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:14HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:15 HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:16 HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFICWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:17 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:18 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFICWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:19 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:20 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:21 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRGC-NH2
SEQ ID NO:22 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVKAibRC-NH2
SEQ ID NO:23 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEERAAKEFICWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:24 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEERAAKEFICWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:25 HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibRG-NH2
SEQ ID NO:26 HAPGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibR-NH2
SEQ ID NO:27 HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVRAibRG-NH2
SEQ ID NO:28 HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVRAibR-NH2
SEQ ID NO:29 HAPGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVRG-NH2
SEQ ID NO:30 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibRG-NH2
SEQ ID NO:31 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibG-NH2
SEQ ID NO:32 HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVRAibRG-NH2
SEQ ID NO:33 HGEGTFTSDVSSYLEERAAKEFIAWLVRAibG-NH2
SEQ ID NO:34 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibRG-NH2
SEQ ID NO:35 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVRAibG-NH2
SEQ ID NO:36 HAPGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:37 HAPGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:38 HAPGTFTSDVSSYLEERAAREFIAWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:39 HAPGTFTSDVSSYLEERAAREFIAWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:40 HAPGTFTSDVSSYLEERAAREFIAWLVKG-NH2
SEQ ID NO:41 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKAibRG-NH2
SEQ ID NO:42 HGEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKAibR-NH2
SEQ ID NO:43 H(d-A)EGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKAibRG-NH2
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实施例2胰高血糖素样肽-1类似物前体多肽的溶解性、稳定性实验
对本发明提供的优选多肽进行了溶解性和溶液稳定性的评价试验，同时与对GLP-1原序列仅做简单变换的多肽序列(Gly2，Cys37GLP-1(7-37)：SEQ ID NO:57HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRC)以及在专利(CN201610211144.0)中涉及到的序列(Gly2，Aib35，Ala38，Cys39GLP-1(7-37):SEQ ID NO:58
HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKAibRGAC)进行了比较，发现本发明技术方案中的结构变换有效解决了前体多肽的溶解性和溶液稳定性。
样品：
SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、
SEQ ID NO:1、9、11、15、17、24，自制，纯度≥98％。
溶解性：
配制目标浓度为2mg/ml的上述样品溶液，pH 6.0、7.4的20mMPBS于室温溶解适量样品，4000r离心，取上清液检测。配制适当浓度的多肽样品的乙腈-水(30％)溶液做为测试用对照品溶液。
HPLC-UV测定：
色谱柱：Aeriswidepore XB-C18 3.6μm，4.6×150mm；
流动相：A:0.05％TFA/H2O；B:0.05％TFA/乙腈
检测波长：214nm
溶液稳定性：
称取适量上述样品，用pH4.2的20mM醋酸钠缓冲液、pH 6.0、7.4的20mMPBS于室温溶解，配制成2mg/ml于25℃放置8hr，按上述方法测定溶液中多肽量，与初始量比较计算残留量百分比。结果见表1。
表1多肽样品溶解性、稳定性检测结果
实施例3胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽的降血糖作用评价
采用正常小鼠糖负荷模型评价了本发明提供的部分多肽的降血糖作用。
受试样品：
SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:4、9、11、15、17、19自制，纯度≥98％
方法：
动物(n＝8)于实验前禁食过夜，皮下注射生理盐水(10mL/kg)作为对照组；皮下单次注射利拉鲁肽(200μg/kg)作为阳性对照药组；给药前测定血糖，给予阳性药和受试样品(200μg/kg)，给药同时和2、4小时后腹腔注射葡萄糖(4.5g/kg)，尾尖取血测定给糖后30min的血糖值，计算相对于阳性对照药的血糖抑制率(％)。结果见表2。
表2多肽对正常小鼠糖负荷模型降血糖作用
注:表中血糖抑制率为相对于阳性对照药的百分比.
结论：由上表2中相对于阳性药的血糖抑制率数据可以看出，本发明设计的前体裸肽在给药2-4小时后仍显示较强的降血糖作用，而未经优化的序列Gly2，Cys37GLP-1(7-37)仅在给药即刻显示活性。说明经过本发明优化的前体多肽体内活性和稳定性显著优于未经优化的序列。
实施例4胰高血糖素样肽-1类似物的制备
1)连接：
马来酰基功能化：将如SEQ ID NO:3所示多肽溶解于含有5mM EDTA的pH6的50mM磷酸钠缓冲溶液中，浓度为2mg/mL。加入1.2-1.5倍摩尔量的固态的PEG-马来酰亚胺，搅拌溶解，于室温反应0.5-2hr。反应以HPLC监控，以5mMβ-巯基乙醇终止反应，置室温30min后纯化。
碘乙酰基功能化：通过肽前体和碘乙酰基功能化的mPEG(1:1)在7M脲/50mM Tris缓冲液(pH7.5-8.5)中室温搅拌反应45分钟完成聚乙二醇修饰，以在PEG和肽链上的Cys间形成共价硫醚键。
2)纯化:采用制备型离子交换柱层析，以SP SepharoseHP填料，以0-500mM氯化钠pH6磷酸盐缓冲液溶液线性梯度洗脱。流出液以HPLC和SDS-电泳检测，收集PEG-多肽流分，超滤浓缩，冷冻干燥而得。结果见图1，其中图A为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽SEQ ID NO:9、图B为胰高血糖素样肽-1类似物SEQ ID NO:9-Ⅱ、图C为结构Ⅱ(mPEG)2-Mal(40KDa)的HPLC色谱图。
3)纯品多肽经MALDI-TOF进行全分子量扫描，确定平均分子量。结果见图2，图2为本发明的胰高血糖素样肽-1类似物SEQ ID NO:9-Ⅱ的MALDI-TOF图。
采用上述方法制备了下表所示的多肽聚乙二醇修饰物。
表3多肽聚乙二醇修饰物
实施例5胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽以及胰高血糖素样肽-1类似物对
GLP-1受体的激动作用
受试样品：
GLP-1、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19以及SEQ ID NO:9-Ⅱ、SEQ ID NO:11-Ⅱ、SEQID NO:57-Ⅱ、SEQ ID NO:58-Ⅱ自制，纯度≥98％
方法：将待测化合物用无血清培液(含0.1％BSA,0.5mM IBMX)配成工作浓度的2倍。消化细胞(HEK293)，将细胞用无血清培液悬浮(含0.1％BSA,0.5mM IBMX)，并且进行计数，按照2000c细胞/5μl/孔加入384孔板，然后加入5μl待测化合物，室温避光反应30min。反应结束后，加入cAMP检测底物，室温避光反应60min。反应结束后，在Envision2104多功能微孔板酶标仪检测。计算得到各样品各浓度条件下的激活率(％Response)。通过％Response对样品浓度的对数值X，进行非线性拟和计算得到EC50值。
结果见下表4。
表4GLP-1类似物多肽以及PEG修饰体对GLP-1受体的激动活性
由上表可以看出,经本发明技术方案改进结构的多肽,其对受体的激动活性显著高于内源性GLP-1和其他仅做简单改变的GLP-1类似物；PEG修饰后对受体的活性强度均下降至前体多肽的约10分之1，因此，前体多肽活性越强对目标修饰产物的活性发挥越有利。
实施例6直链型PEG修饰多肽的降血糖作用以及长效性评价
采用正常小鼠葡萄糖负荷试验评价了本发明多肽的降血糖作用以及长效性。
动物(n＝8)于实验前禁食过夜，皮下注射生理盐水(10mL/kg)作为对照组；皮下注射利拉鲁肽(100nmol/kg，每日1次)作为阳性对照药组；其余受试组分别为SEQ ID NO:1(mPEG20、40KD)、SEQ ID NO:9-mal-mPEG20KD、SEQ ID NO:11-mal-mPEG20KD，给药剂量100nmol/kg。给药剂量100nmol/kg。
给药前测定血糖，给予受试样品，分别于给药后不同时间段腹腔注射葡萄糖(4.5g/kg)后，尾尖取血测定给糖后30min的血糖值，计算血糖抑制率。
结果见表5。
结论：所试4个样品均显示了不同程度的降血糖活性和长效性，而且均优于阳性对照药，同时表明增加分子量有助于延长药效。SEQ ID NO:9和11的修饰物降血糖作用无明显差异，说明在序列中30位和C-末端的修饰均可实现保持活性和长效化。
表5.直链型PEG修饰多肽的降血糖作用(n＝8)
实施例7分支型PEG修饰多肽降血糖作用和长效性
受试样品：实施例4中制备的SEQ ID NO:1-Ⅰ、SEQ ID NO:9-Ⅱ、SEQ ID NO:11-Ⅱ、SEQ ID NO:15-Ⅱ、SEQ ID NO:17-Ⅱ、评价方法：同实施例6。结果见下表6。
表6分支型PEG修饰多肽降血糖作用和长效性
结论：从表6结果可以看出阳性药利拉鲁肽药效仅持续至28小时，而受试组样品药效持续至148小时，考虑到小鼠和人体代谢的种属间差异，可以判断达到预期的长效化。
实施例8不同多肽前体对PEG修饰产物药效的影响
比较了SEQ ID NO:9-Ⅱ与SEQ ID NO:58-Ⅱ的降血糖作用和长效性。
受试样品均为自制，纯度≥98％。
阳性对照药为利拉鲁肽。
受试样品SEQ ID NO:9-Ⅱ设250、25、2.5nmol/kg(图中分别标示为样品b-1、b-2、b-3)剂量组，阳性药和Gly2，Aib35，Ala38，Cys39GLP-1(7-37)-Ⅱ(图中标示为样品a)均只设25nmol/kg剂量。
方法同实施例6，结果见图3。从图中可以看出受试样品SEQ ID NO:9-Ⅱ在本实验所设高剂量下药效可平稳持续至120hr以上，药效和长效性均呈剂量相关性。阳性药利拉鲁肽在25nmol/kg剂量下在12hr显示药效，而24小时药效衰减。在25nmol/kg剂量下SEQ IDNO:9-Ⅱ药效仍可维持到76hr，而SEQ ID NO:58-Ⅱ在52hr血糖抑制率已大幅减弱，说明对前体多肽序列的优化有助于提高终产物的药效。
实施例9 PEG修饰物对ob/ob小鼠的血糖调节作用
ob/ob模型小鼠，雄性，6周龄，北京华埠康生物科技股份有限公司购买，许可证号：SCXK(京)2014-0004。
动物检疫饲养两周后，禁食测定空腹血糖，按照空腹血糖随机分组，分为5组，每组8只，分别为SEQ ID NO:9-Ⅱ、SEQ ID NO:11-Ⅱ、SEQ ID NO:17-Ⅱ组，阳性对照药利拉鲁肽组及模型对照组，皮下给药，药物剂量均为100nmol/kg，阳性对照药利拉鲁肽每天给药2次，其他三个样品每4天给药1次，连续给药21天，每周监测空腹血糖，21天后禁食腹腔给予葡萄糖2.5g/kg，于给糖前及给糖后0.5h、3和6h测定血糖值，计算血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)。结果见表7和8。
表7 PEG修饰多肽连续给药21天，每周测定空腹血糖值
＊(n＝8，100nmol/kg)
表8 PEG修饰多肽连续给药21天后血糖浓度-时间表(n＝8)
与模型对照组比较：*P<0.05，**P<0.01.
从上表可以看出，受试样品即本发明提供的长效化多肽缀合物在糖尿病动物模型显示了与阳性药利拉鲁肽相当的血糖调节作用，但给药频率减少(每天2次vs 4天1次)，具有明显的应用优势。考虑到小鼠和人的代谢差异，根据本发明试验数据推测，在临床可以满足每周1次的给药频率，可显著提高用药依从性。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 天津药物研究院有限公司
<120> 胰高血糖素样肽-1类似物及其用途
<130> DIC17110002
<160> 58
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
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His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 20
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Cys
20 25 30
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 21
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly Cys
20 25 30
<210> 22
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Cys的C端连接NH2
<400> 22
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Cys
20 25 30
<210> 23
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 23
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
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<400> 24
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Xaa Arg
20 25 30
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
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<400> 25
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
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<400> 26
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg
20 25 30
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<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
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20 25 30
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 28
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg
20 25 30
<210> 29
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 29
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly
20 25
<210> 30
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
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<400> 30
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 31
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Gly
20 25 30
<210> 32
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 32
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 33
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 33
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Gly
20 25 30
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 34
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 35
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 35
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Gly
20 25 30
<210> 36
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 36
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 37
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 37
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
20 25 30
<210> 38
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 38
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 39
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 39
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
20 25 30
<210> 40
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 40
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
20 25
<210> 41
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 41
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 42
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 42
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
20 25 30
<210> 43
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 43
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly
20 25 30
<210> 44
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Arg的C端连接NH2
<400> 44
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg
20 25 30
<210> 45
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 45
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 46
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 47
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 47
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 48
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 48
His Ala Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 49
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 50
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 51
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 51
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 52
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 52
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 53
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 53
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 54
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 54
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 55
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> Gly的C端连接NH2
<400> 55
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys Gly
20 25 30
<210> 56
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前体多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> D型氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa表示Aib, α-氨基异丁酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Lys的C端连接NH2
<400> 56
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Ala Ala Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Xaa Lys
20 25 30
<210> 57
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 57
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Cys
20 25 30
<210> 58
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 58
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Xaa Arg Gly Ala
20 25 30
Cys
Claims (10)
1.一种胰高血糖素样肽-1类似物的前体多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述前体多肽具有以下通式Ⅰ所示的氨基酸序列；
通式Ⅰ
HX1X2GTFTSDVSSYLEEX3AAX4EFIX5WLVKX6X7X8X9；
其中，所述X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和X9表示任意的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的前体多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述前体多肽的序列如SEQ ID NO:1-56中任一条所示。
3.一种胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐为权利要求1或2所述的前体多肽或其药学上可接受的盐的聚乙二醇缀合物。
4.根据权利要求3所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述聚乙二醇的平均分子量范围为5-50KDa，更优选地为20-50KDa；进一步优选地为40-50Kda。
5.根据权利要求3或4所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述聚乙二醇是直链型、分支型聚乙二醇；
优选地，所述聚乙二醇选自平均分子量范围40-50KDa的分支型聚乙二醇，再优选40-50KDa的二分支型聚乙二醇。
6.根据权利要求5所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述聚乙二醇通过分子端基上的活化基团缀合于胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐；
优选地，所述活化基团选自马来酰亚胺基、巯基、琥珀酰亚胺基、醛基、卤素；更优选地为马来酰亚胺基。
7.根据权利要求6所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述聚乙二醇通过活化基团缀合于SEQ ID NO:1-56任一条的赖氨酸侧链或半胱氨酸侧链；更优选地，所述聚乙二醇通过活化基团缀合于SEQ ID NO:9-12、17-20中任一条。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1或2所述的前体多肽或其药学上可接受的盐，或所述药物组合物包含如权利要求3-7中任一项所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；更优选地，所述载体和/或辅料选自水溶性填充剂、pH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂中的一种或多种；
优选地，所述水溶性填充剂选自甘露醇、低分子右旋糖酐、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖等中的一种或多种；所述pH调节剂选自枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等有机或无机酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钾、碳酸氢钠或碳酸氢铵盐等生理上可接受的无机碱或盐中的一种或多种；所述稳定剂选自EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物如HPC、HPC-SL、HPC-L或HPMC、环糊精、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等中的一种或多种；所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
9.根据权利要求1或2所述的前体多肽或其药学上可接受的盐，或如权利要求3-7中任一项所述的胰高血糖素样肽-1类似物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的药物组合物中的用途。
10.根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病、肥胖、代谢综合征的药物中的用途。
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