CN109371079A - 一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法 - Google Patents

一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法。本发明以可溶淀粉为主要初始原料，将高温α‑葡聚糖磷酸化酶和高温糖‑1‑磷酸核苷酸化酶分别在大肠杆菌中重组表达，利用表达后的菌体高温全细胞催化合成尿苷二磷酸葡萄糖。在此基础上，将高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中重组表达，偶联上述尿苷二磷酸葡萄糖的合成体系高温全细胞催化合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，同时在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的合成体系中引入高温NADH氧化酶的全细胞催化体系，构成高温NAD+/NADH循环***，以减少辅酶NAD+的使用。本发明利用高温全细胞催化的方式，成功避免合成过程中菌体各种代谢通路的干扰，减少纯化难度。

Description

一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成 方法
技术领域
本发明涉及了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法，属于生物合成技术领域。
背景技术
在碳水化合物的研究中，结构均一寡糖与糖缀复合物是生物体内重要的信息分子，在生命活动中起着重要的作用。现如今，它们越来越多的被用作生物研究的探针或是药物及疫苗发现的先导化合物，对其合成的研究亦越来越引发人们的关注。化学酶法作为近年来的研究热点，具有高效性和高度的专一性，在合成结构均一寡糖及糖缀复合物中具有巨大的应用潜力。而在这一合成过程中，高能的核苷酸糖类作为单糖的供体底物是不可或缺的。
核苷酸糖类作为自然界中单糖活化的高能形式，在Leloir型糖基转移、生物合成、糖基化修饰等多个方面具有重要的应用，其中尤以尿苷二磷酸化的糖类应用较为广泛。尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)作为尿苷二磷酸糖类中最为基础的一员，可以作为多种糖基转移酶的单糖供体底物，可以作为其他尿苷二磷酸糖类例如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸木糖、尿苷二磷酸鼠李糖等等的前体，在生物信号通路、靶点研究等各个方面也发挥着重要的作用。其脱氢而得到的衍生产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)可以用做糖胺聚糖糖链延长的单糖供体，对不同分子量大小的糖胺聚糖的研究具有重要意义。
传统的核苷酸糖获取方法耗时长、造价昂贵、操作繁琐，其中，直接提取法来源有限、得率极低，化学合成法因糖类的不均一性限制因素较多，且合成过程中易造成环境污染，酶法合成相对而言专一性高，合成过程高效快速，但酶分子需经纯化，且易失活，对大量制备产物具有一定的局限性。中国专利文献CN104561195A公开了一种尿苷二磷酸葡萄糖的制备方法，该方法是在一个体外(细胞外)反应***中，以尿苷三磷酸(UTP)或其盐(如钠盐)、麦芽糊精为底物，加入无机离子、dTT和Tris，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶粗酶液和麦芽糊精磷酸化酶粗酶液作为催化剂，通过生物转化生产尿苷二磷酸葡萄糖。该制备方法以麦芽糊精作为原料之一，原料成本较高，且需要提取尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶的粗酶液，制备步骤较为复杂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法，是在传统酶法合成的基础上，利用淀粉作为原料，以酶在大肠杆菌重组表达后的菌体作为催化剂进行高温全细胞催化反应，是一种简便、高效、环保经济的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)及其脱氢衍生物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的生物合成方法。
本发明的技术方案如下：
一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，步骤如下：
(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)；
(2)取步骤(1)得到的1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)，加入无机离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸(UTP)，以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述可溶性淀粉在反应液中的终浓度为45～55g/L。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述磷酸盐为KH2PO4和K2HPO4，进一步优选的，将KH2PO4和K2HPO4溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO4 3-的总浓度为1M，pH为6～7，所述KP溶液中PO4 3-在反应液中的终浓度为0.2～0.9M；最优选的，所述KP溶液的pH为7，所述KP溶液中PO4 3-在反应液中的终浓度为0.7M。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌加量为6～7g菌体干重/L反应液。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述生物合成的反应温度为70℃，反应时间大于180min；进一步优选的，反应时间为360min。
根据本发明优选的，步骤(2)中1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)在反应体系中终浓度为0.4～0.6g/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述无机离子为镁离子，进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO4 0.2M，NaOH调节pH 6～11；进一步优选的，所述磷酸二氢钠缓冲液的pH为9。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述尿苷三磷酸的终浓度为0.05～3.0mM；进一步优选的，终浓度为2mM。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌的加量为3.0～5.5g菌体干重/L反应液，进一步优选的，加量为4.17g菌体干重/L反应液。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述生物合成的反应温度为70～90℃，反应时间大于60min；进一步优选的，所述生物合成的反应温度为80℃，反应时间为180min。
根据本发明优选的，所述诱导表达的步骤包括：
将含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌或含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌。
进一步优选的，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌和含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌由南京金斯瑞公司合成，其中，含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET20b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。
进一步优选的，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.1～2.3；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.4～2.6。
一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的生物合成方法，包括本发明上述的尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法的步骤，还包括以下步骤：
在反应液中，以上述生物合成方法得到的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)为底物，加入磷酸二氢钠缓冲液，以含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)；同时利用含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌构建高温NAD+/NADH循环***，消耗氧气推动循环过程，从而使合成体系不需额外加入辅酶NAD+。
根据本发明优选的，所述尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)在反应液中的终浓度为1.2～1.4g/L。
根据本发明优选的，所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO4 0.5M，NaOH调节pH 8～11，进一步优选的，所述磷酸二氢钠缓冲液的pH为10。
根据本发明优选的，所述含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的重组大肠杆菌的加量为7～8g菌体干重/L反应液，进一步优选的，加量为7.28g菌体干重/L反应液。
根据本发明优选的，所述含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌的加量为4～5g菌体干重/L反应液。
根据本发明优选的，所述生物合成的反应温度为65℃，反应时间大于10min；进一步优选的，所述反应时间为30min。
根据本发明优选的，所述诱导表达的步骤包括：
将含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌或含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌。
进一步优选的，所述含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌和含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌由南京金斯瑞公司合成，其中，含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET15b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。
进一步优选的，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.2～2.5；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.2～2.5。
本发明的技术特点：
本发明所述的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的高温全细胞催化合成方法流程如图1所示。在反应液中，首先以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的重组大肠杆菌为催化剂，催化可溶性淀粉和高浓度磷酸盐反应得到葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)；再以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的重组大肠杆菌为催化剂，催化第一步所得到的Glc-1-P反应液和尿苷三磷酸(UTP)反应得到UDP-Glc。
本发明所述的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的高温全细胞催化合成方法流程如图2所示。在反应液中，以含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的重组大肠杆菌菌体为催化剂，催化上述方法中合成的UDP-Glc反应液转变为UDP-GlcA，同时加入含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌，构建高温NAD+/NADH循环***，消耗氧气推动循环过程，从而可以使合成体系不需额外加入辅酶NAD+。
有益效果：
本发明中的生物合成方法利用高温全细胞催化的方法，省去了酶纯化提取的步骤，同时，利用含有诱导表达好高温NADH氧化酶(TkNOX)的重组大肠杆菌构建高温NAD+/NADH循环***后，菌体自身水平的NAD+即可使UDP-GlcA的产率达到95％以上，无需额外添加辅酶NAD+，大大节约了时间与成本，简化了操作步骤，并且其催化载体大肠杆菌易于改造，成本低廉，容易大量获得。同时高温反应的条件下，菌体内多余的杂质沉淀析出，干扰产物合成、促进产物分解的酶和信号通路失去活性，有利于目的糖类的合成，高效合成目的糖类的同时也使之后纯化的步骤变得更为简便。另外，本发明以可溶性淀粉为反应底物，降低了生产成本。
附图说明
图1：尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的高温全细胞催化合成方法流程图；
图2：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的高温全细胞催化合成方法流程图；
图3：高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)在重组大肠杆菌中可溶性表达的SDS-PAGE检测结果图；
图4：高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)在重组大肠杆菌中可溶性表达的SDS-PAGE检测结果图；
图5：高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)高温全细胞催化反应活性的TLC检测结果图；
图6：高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)高温全细胞催化反应温度TLC检测结果图；
图7：高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)高温全细胞催化反应KP溶液pH值TLC检测结果图；
图8：高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)高温全细胞催化反应时间TLC检测结果图；
图9：高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)高温全细胞催化反应活性的HPLC色谱图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图10：高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)高温全细胞催化反应温度曲线图；
图中，横坐标为反应温度，纵坐标为转化率；
图11：高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)高温全细胞催化反应NaH2PO4缓冲液pH值曲线图；
图中，横坐标为NaH2PO4缓冲液pH值，纵坐标为转化率；
图12：高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)高温全细胞催化反应时间曲线图；
图中，横坐标为反应时间，纵坐标为转化率；
图13：TmαGP和StUSP高温全细胞催化反应合成UDP-Glc的HPLC色谱图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图14：TmαGP和StUSP高温全细胞催化合成的UDP-Glc的MS图谱；
图15：TmαGP和StUSP高温全细胞催化反应中StUSP菌体加入量的曲线图；
图中，横坐标为StUSP菌体干重，纵坐标为转化率；
图16：TmαGP和StUSP高温全细胞催化反应中UTP加入量的曲线图；
图中，横坐标为UTP加入量，纵坐标为UTP转化率；
图17：高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)在重组大肠杆菌中可溶性表达的SDS-PAGE检测结果图；
图18：高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)高温全细胞催化反应的HPLC色谱图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图19：高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)高温全细胞催化反应温度曲线图；
图中，横坐标为反应温度，纵坐标为转化率；
图20：高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)高温全细胞催化反应NaH2PO4缓冲液pH值曲线图；
图中，横坐标为NaH2PO4缓冲液pH值，纵坐标为转化率；
图21：高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)高温全细胞催化反应时间曲线图；
图中，横坐标为反应时间，纵坐标为转化率；
图22：TmαGP、StUSP和PiUdh高温全细胞催化反应合成UDP-GlcA的HPLC色谱图；
图中，横坐标为保留时间，纵坐标为电信号强度；
图23：TmαGP、StUSP和PiUdh高温全细胞催化反应中PiUdh菌体加入量的曲线图；
图中，横坐标为PiUdh菌体干重，纵坐标为转化率；
图24：TmαGP、StUSP和PiUdh高温全细胞催化反应中NAD+加入量的曲线图；
图中，横坐标为NAD+加入量，纵坐标为转化率；
图25：高温NADH氧化酶(TkNOX)在重组大肠杆菌中可溶性表达的SDS-PAGE检测结果图；
图26：TkNOX和PiUdh高温全细胞催化反应对UDP-GlcA合成影响的检测结果；
图中，纵坐标为UDP-GlcA转化率；
图27：TmαGP、StUSP、PiUdh和TkNOX的高温全细胞催化反应合成UDP-GlcA的MS图谱。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特殊说明，本发明中所运用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而非限制本发明的保护范围。
本发明所采用的底物糖类试剂均购自于sigma公司，重组大肠杆菌均为南京金斯瑞公司合成，所用菌株和质粒载体见表1。
表1本发明所用菌株和质粒载体
本发明所采用的TLC检测方法如下：
硅胶板：TLC Silica gel 60F254；展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝2：1：1；染色剂：茴香醛。
本发明所采用的HPLC检测方法均使用YMC-Pack Polyamine II柱，液相***为日本岛津液相，紫外检测***为SPD-20A。具体方法程序根据检测成分的不同包括两种：
检测尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的HPLC流动相条件见表2：
表2 UDP-Glc所用HPLC分析程序
检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的HPLC流动相条件见表3：
表3 UDP-GlcA的HPLC分析程序
本发明中还使用了来自艾美捷公司的NADH检测试剂盒。
实施例1.重组大肠杆菌高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)与高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的诱导表达
将金斯瑞公司合成好的含有目的基因TmαGP或StUSP的重组大肠杆菌BL21(DE3)分别接种于30mL的LB培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃225rpm活化12～14h；然后，将活化后的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于250mL的LB培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)进行扩大培养，初始OD600值为0.05，37℃225rpm培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，其中，含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.1～2.3；含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.4～2.6。
取上述两种重组大肠杆菌菌液，8000rpm离心20min收集菌体沉淀，每2mL菌液的菌体沉淀以100μL三蒸水重悬，80℃煮10min后，12000rpm离心20min，上清液以SDS-PAGE检测TmαGP与StUSP的表达情况。TmαGP与StUSP的SDS-PAGE结果见图3与图4，均检测到了目的蛋白，说明两者在重组大肠杆菌中均有可溶性表达。
实施例2.高温α-葡聚糖磷酸化酶(TmαGP)的高温全细胞催化反应
1)TmαGP的高温全细胞催化反应
首先，将实施例1制备的含有诱导表达好TmαGP的重组大肠杆菌菌液离心收集菌体沉淀，将得到的菌体沉淀于-20℃冻存约一天，反应时取出冰上融化，每60mL菌液离心得到的菌体沉淀以2mL三蒸水重悬。反应体系如表4所示，其中，KP溶液是将KH2PO4和K2HPO4溶解于水中配制而成，KP溶液中KH2PO4和K2HPO4的浓度分别为0.38M和0.62M，pH为7，PO4 3-的总浓度为1M，TmαGP菌体的加量为6.6g菌体干重/L反应液；另外设置对照组，分别为反应液中无可溶性淀粉、反应液中无TmαGP菌体、反应液中添加1-磷酸-葡萄糖(1-P-Glc)，各反应液于70℃反应16h，冰浴5min终止反应。将各反应液12000rpm离心20min，上清液加入过量钙离子除盐后，稀释一倍，以TLC进行检测。
表4 TmαGP的高温全细胞催化反应体系
检测结果如图5所示，反应组中有1-P-Glc生成，说明TmαGP的高温全细胞催化反应具有将可溶性淀粉转变为1-P-Glc的活性。
2)TmαGP的高温全细胞催化反应温度
反应体系如表4，反应温度分别设置50℃，60℃，70℃，75℃，80℃共计5个温度梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
TLC检测结果如图6所示，说明TmαGP的高温全细胞催化反应最适温度为70℃。
3)TmαGP的高温全细胞催化反应的KP溶液pH值
反应体系除KP溶液外均如表4，将KP溶液换成不同pH值的KP溶液，设置3,4,5,6,7,8,9,10,11,12共计10个pH梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
检测结果见图7，说明TmαGP的高温全细胞催化反应中KP溶液的pH值为6～7，最适pH值为7。
4)TmαGP的高温全细胞催化反应时间
反应体系如表4，反应时间分别设置0min，5min，10min，20min，30min，60min，120min，180min，360min，660min，960min共计11个梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
检测结果见图8，说明TmαGP的高温全细胞催化反应时间大于180min均有Glc-1-P生成，最适反应时间为360min。
实施例3.高温糖-1-磷酸核苷酸化酶(StUSP)的高温全细胞催化反应
1)StUSP的高温全细胞催化反应
首先，将实施例1制备的含有诱导表达好StUSP的重组大肠杆菌菌液离心收集菌体沉淀，将得到的菌体沉淀于-20℃冻存约一天，反应时取出冰上融化，每60mL菌液离心得到的菌体沉淀以2mL三蒸水重悬。反应体系如表5所示，其中，Mg2+由氯化镁水解产生，磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO4 0.2M，NaOH调节pH 7.5；另外设置对照组，分别为反应液中无StUSP菌体、反应液中添加尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)，各反应液于80℃反应0.5h，冰浴5min终止反应。将各反应液12000rpm离心20min，上清液以0.22μm滤膜过滤后，按照表2描述的HPLC条件进行检测。
表5 StUSP的高温全细胞催化反应体系
检测结果见图9，反应组中有UDP-Glc生成，说明StUSP的高温全细胞催化反应具有将1-P-Glc转变为UDP-Glc的活性。
2)StUSP的高温全细胞催化反应温度
反应体系如表5，反应温度分别设置60℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃共计6个温度梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
检测结果见图10，当反应温度为70～90℃时1-P-Glc的转化率大于等于50％，当反应温度为80℃时1-P-Glc的转化率最高，说明StUSP的高温全细胞催化反应适宜的温度为70～90℃，最适温度为80℃。
3)StUSP的高温全细胞催化反应的NaH2PO4缓冲液pH值
反应体系除NaH2PO4缓冲液外均如表5，将NaH2PO4缓冲液换成不同pH值的NaH2PO4缓冲液，分别设置2.5,6,7,7.5,8,8.5,9,9.5,10,11,12共计11个pH梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
检测结果见图11，当NaH2PO4缓冲液的pH值为6～11时1-P-Glc的转化率大于等于50％，当NaH2PO4缓冲液的pH值为9时1-P-Glc的转化率最大，说明StUSP的高温全细胞催化反应适宜的NaH2PO4缓冲液pH值为6～11，最适pH值为9。
4)StUSP的高温全细胞催化反应时间
反应体系除将NaH2PO4缓冲液换为pH＝9的NaH2PO4缓冲液外均如表5，反应时间分别设置0min，5min，10min，30min，40min，60min，80min，150min，180min，240min共计10个梯度点，每个梯度三组平行。其余处理条件同上。
检测结果见图12，说明StUSP的高温全细胞催化反应时间大于60min时1-P-Glc的转化率大于50％，最适反应时间为180min。
实施例4.以淀粉为原料TmαGP和StUSP偶联的高温全细胞催化反应合成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)
1)TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应
首先，按表4中体系进行TmαGP的高温全细胞催化反应，70℃6h生物合成1-P-Glc，TmαGP的高温全细胞催化反应液参与StUSP全细胞催化反应，反应体系如表6，其中，TmαGP反应液中1-P-Glc的浓度为11g/L，添加量为16μL，Mg2+由氯化镁水解产生，NaH2PO4缓冲液的组分为NaH2PO4 0.2M，NaOH调节pH 9；另外设置对照组，分别为反应液中无StUSP菌体、反应液中添加UDP-Glc，80℃反应3h，冰浴5min终止反应。12000rpm离心20min后，上清液以0.22μm滤膜过滤后，按照表2的HPLC分析条件进行检测。
表6 TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应体系
检测结果见图13，说明以淀粉为原料TmαGP和StUSP偶联的高温全细胞催化反应可以合成UDP-Glc。
将上清液经P2分子筛纯化后，进行MS检测，MS结果图见图14。质谱条件为负离子，得到了与UDP-Glc(Mw＝566.30)脱去一个质子后分子量相符合的峰(565.05)，证明产物UDP-Glc合成。
2)TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应的StUSP菌体加入量
反应体系如表6，上述含有1-P-Glc的TmαGP反应液的加入量为16μL。StUSP菌体重悬液共设置0μL，3.33μL，8.33μL，16.6μL，33.3μL，50μL，66.7μL共计7个梯度，改变H2O的加量，使总体积保持为320μL，每个梯度三组平行。其余条件均不变。
检测结果见图15，当StUSP菌体的加入量大于16.6μL时1-P-Glc的转化率大于50％，StUSP菌体最适加入量为50μL，换算得到为4.17g(干重菌体)/L反应液。
3)TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应的UTP用量
反应体系如表6，上述含有1-P-Glc的TmαGP反应液的加入量为16μL，StUSP菌体加入量改变为50μL。改变UTP的加入量，UTP在反应液中的终浓度共设置0mM，0.5mM，1mM，1.5mM，2mM，2.5mM，3mM，4mM，5mM，6mM共计10个梯度，改变H2O的加量，使总体积保持为320μL，每个梯度三组平行。其余条件均不变。
检测结果见图16，当UTP的加入量为0.5～2.5mM时UTP的转化率均在50％以上，UTP最适加入量为2mM。
实施例5.重组大肠杆菌高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的诱导表达
将金斯瑞公司合成好的含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于30mL的LB培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃225rpm活化12～14h；然后，将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL的LB培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素Amp)进行扩大培养，初始OD600值为0.05，37℃225rpm培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌诱导表达后的OD6002.2～2.5。
取上述重组大肠杆菌菌液，8000rpm离心20min收集菌体沉淀，每2mL菌液的菌体沉淀以100μL三蒸水重悬，80℃煮10min后，12000rpm离心20min，上清液以SDS-PAGE检测表达情况。PiUdh的SDS-PAGE结果见图17，检测到了目的蛋白高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)，说明PiUdh在重组大肠杆菌中有可溶性表达。
实施例6.高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶(PiUdh)的高温全细胞催化反应
1)PiUdh的高温全细胞催化反应
首先，将上述含有诱导表达好PiUdh的重组大肠杆菌菌液离心收集菌体沉淀，将得到的菌体沉淀于-20℃冻存约一天，反应时取出冰上融化，每60mL菌液离心得到的菌体沉淀以2mL三蒸水重悬。反应体系如表7所示，NaH2PO4缓冲液的组分为NaH2PO4 0.5M，NaOH调节pH10；另外设置对照组，分别为反应液中无PiUdh菌体、反应液中添加尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)、反应液中添加尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)，各反应液于70℃反应0.5h，冰浴5min终止反应。然后12000rpm离心20min，上清以0.22μm滤膜过滤后，按照表3描述的HPLC条件进行检测。
表7 PiUdh的高温全细胞催化体系
检测结果见图18，说明PiUdh的高温全细胞催化反应具有将UDP-Glc转变为UDP-GlcA的活性。
2)PiUdh的高温全细胞催化反应温度
反应体系如表7，反应温度分别设置50℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃共计7个温度梯度点，每个梯度三组平行。采用NADH试剂盒进行检测，测定460nm处吸光度值。
检测结果见图19，说明PiUdh的高温全细胞催化反应的最适温度为65℃。
3)PiUdh的高温全细胞催化反应的NaH2PO4缓冲液pH值
反应体系除NaH2PO4缓冲液外均如表7，将NaH2PO4缓冲液换成不同pH值的NaH2PO4缓冲液，分别设置2.5，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13共计11个pH梯度点，65℃反应0.5h。每个梯度三组平行。采用NADH试剂盒进行检测，测定460nm处吸光度值。
检测结果见图20，说明PiUdh的高温全细胞催化反应中适宜的NaH2PO4缓冲液pH值为8～11，最适pH值为10。
4)PiUdh的高温全细胞催化反应时间
反应体系如表7，反应时间分别设置0min，10min，20min，30min，40min，60min，90min，120min，150min，180min共计10个梯度点，65℃反应。每个梯度三组平行。按照表3所述的HPLC程序对结果进行检测。
检测结果见图21，说明PiUdh的高温全细胞催化反应时间大于10min时UDP-Glc的转化率均在50％以上，最适反应时间为30min。
实施例7.TmαGP、StUSP和PiUdh的高温全细胞催化反应合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)
1)TmαGP、StUSP和PiUdh的高温全细胞催化反应
首先，按照实施例4合成UDP-Glc，12000rpm 20min离心反应液去除菌体后，以上清液作为表7中UDP-Glc标准品的替代品参与PiUdh全细胞催化反应，上清液中UDP-Glc的浓度为2.4g/L，加入量为200μL，改变H2O的加量，使总体积保持为400μL，NaH2PO4缓冲液pH＝10，65℃反应30min，冰浴5min终止反应。12000rpm离心20min后，上清液以0.22μm滤膜过滤后，按照表3的HPLC分析条件进行检测。
检测结果见图22，说明TmαGP、StUSP和PiUdh的高温全细胞催化反应可以合成UDP-GlcA。
2)TmαGP、StUSP和PiUdh的高温全细胞催化反应中PiUdh菌体加入量
将表7中的UDP-Glc替换为实施例4中TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应合成UDP-Glc的上清液，上清液中UDP-Glc的浓度为2.4g/L，加入量为200μL。另外，每90mL实施例5制备的PiUdh重组大肠杆菌菌液离心后，菌体沉淀以2mL三蒸水重悬。PiUdh菌体的加入量共设置0μL，1.1μL，2.2μL，5.6μL，11.1μL，16.7μL，22.2μL，33.3μL，44.4μL，66.7μL，88.9μL，100μL共计12个梯度，改变H2O的加量，使总体积保持为400μL，每个梯度三组平行。其余条件均不变。
检测结果见图23，说明PiUdh最适加入量为88.9μL，换算得到为7.28g(干重菌体)/L反应液。
3)TmαGP、StUSP和PiUdh的高温全细胞催化反应中NAD+用量
将表7中的UDP-Glc替换为实施例4中TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应合成UDP-Glc的上清液，上清液中UDP-Glc的浓度为2.4g/L，加入量为200μL。另外，每60mL实施例5制备的PiUdh重组大肠杆菌菌液离心后，菌体沉淀以1mL三蒸水重悬。PiUdh菌体的加入量变为66.7μL。改变NAD+的加量，NAD+在反应液中的终浓度共设置0mM，0.05mM，0.1mM，0.3mM，0.6mM，0.9mM，1.2mM，1.5mM共计8个梯度，改变H2O的加量，使总体积保持为400μL，每个梯度三组平行。其余条件均不变。
检测结果见图24，不加入NAD+时，菌体本身含有的NAD+也可以使反应发生。
实施例8.TmαGP、StUSP、PiUdh和TkNOX偶联的高温全细胞催化反应合成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)
1)重组大肠杆菌高温NADH氧化酶(TkNOX)的诱导表达
将金斯瑞公司合成好的含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于30mL的LB培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃225rpm活化12～14h；然后，将活化后的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于250mL的LB培养基中(含100μg/ml的氨苄青霉素)进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.2～2.5。
取上述重组大肠杆菌菌液，8000rpm离心20min收集菌体沉淀，每2ml菌液的菌体沉淀以100μL三蒸水重悬，80℃煮10min后，12000rpm离心20min，上清液以SDS-PAGE检测表达情况。TkNOX的SDS-PAGE结果见图25，检测到了目的蛋白高温NADH氧化酶(TkNOX)，证明TkNOX在重组大肠杆菌中有可溶性表达。
2)TmαGP、StUSP、PiUdh和TkNOX的高温全细胞催化反应
首先，将上述含有诱导表达好TkNOX的重组大肠杆菌菌液离心收集菌体沉淀，将得到的菌体沉淀于-20℃冻存约一天，反应时取出冰上融化，每60mL菌液离心得到的菌体沉淀以1mL三蒸水重悬。按表8的反应体系进行反应，其中UDP-Glc为实施例4中TmαGP和StUSP的高温全细胞催化反应合成UDP-Glc的上清液，上清液中UDP-Glc的浓度为2.4g/L，PiUdh菌体的加量为7.28g菌体干重/L反应液，TkNOX菌体的加量为4.4g菌体干重/L反应液；同时设置对照组，分别为反应液中无TkNOX菌体、反应液中TkNOX菌体替换为空载大肠杆菌BL21(DE3)。按照表3所述的HPLC程序对产物UDP-GlcA进行检测。
表8 UDP-GlcA合成的TmαGP、StUSP、PiUdh和TkNOX高温全细胞催化反应体系
检测结果见图26，说明TkNOX高温全细胞催化反应可以构建高温NAD+/NADH循环***，促进UDP-GlcA的合成，减少NAD+的消耗。
按照表8所述条件放大反应，反应完毕后12000rpm离心20min，上清液经P2分子筛纯化后，进行MS检测。MS结果见图27。质谱条件为负离子，得到了与UDP-GlcA(Mw＝580.28)脱去一个质子后分子量相符合的峰(579.19)，并且其二倍峰(1159.19)同时被检测到，证明产物UDP-GlcA合成。

Claims (10)

1.一种尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)在反应液中，以可溶性淀粉和磷酸盐为底物，以含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到1-磷酸-葡萄糖；
(2)取步骤(1)得到的1-磷酸-葡萄糖，加入无机离子、磷酸二氢钠缓冲液、尿苷三磷酸，以含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖。
2.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(1)中包括以下中的一项多多项：
i.所述可溶性淀粉在反应液中的终浓度为45～55g/L；
ii.所述磷酸盐为KH2PO4和K2HPO4，进一步优选的，将KH2PO4和K2HPO4溶解于水中配制成KP溶液，所述KP溶液中PO4 3-的总浓度为1M，pH为6～7，所述KP溶液中PO4 3-在反应液中的终浓度为0.2～0.9M；
iii.所述含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌加量为6～7g菌体干重/L反应液；
iv.所述生物合成的反应温度为70℃，反应时间大于180min。
3.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，步骤(2)中包括以下中的一项或多项：
i.所述1-磷酸-葡萄糖在反应体系中终浓度为0.4～0.6g/L；
ii.所述无机离子为镁离子，进一步优选的，所述镁离子由氯化镁水解产生，镁离子的终浓度为10～20mM；
iii.所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO4 0.2M，NaOH调节pH 6～11；
iv.所述尿苷三磷酸的终浓度为0.05～3.0mM；
v.所述含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌的加量为3.0～5.5g菌体干重/L反应液；
vi.所述生物合成的反应温度为70～90℃，反应时间大于60min。
4.如权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于，所述诱导表达的步骤包括：
将含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌或含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温α-葡聚糖磷酸化酶的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温糖-1-磷酸核苷酸化酶的重组大肠杆菌；
其中，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET20b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。
5.如权利要求4所述的生物合成方法，其特征在于，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.1～2.3；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.4～2.6。
6.一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的生物合成方法，其特征在于，包括本发明上述的尿苷二磷酸葡萄糖的生物合成方法的步骤，还包括以下步骤：
在反应液中，以上述生物合成方法得到的尿苷二磷酸葡萄糖为底物，加入磷酸二氢钠缓冲液，以含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌为催化剂，生物合成得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸；同时利用含有诱导表达好高温NADH氧化酶的重组大肠杆菌构建高温NAD+/NADH循环***，消耗氧气推动循环过程，从而使合成体系不需额外加入辅酶NAD+。
7.如权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，包括以下中的一项或多项：
i.所述尿苷二磷酸葡萄糖在反应液中的终浓度为1.2～1.4g/L；
ii.所述磷酸二氢钠缓冲液的组分为NaH2PO4 0.5M，NaOH调节pH 8～11；
iii.所述含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌的加量为7～8g菌体干重/L反应液；
iv.所述含有诱导表达好高温NADH氧化酶的重组大肠杆菌的加量为4～5g菌体干重/L反应液。
8.如权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，所述生物合成的反应温度为65℃，反应时间大于10min。
9.如权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，所述诱导表达的步骤包括：
将含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌或含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌接种于30mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃225rpm活化12～14h；将活化后的重组大肠杆菌接种于250mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中进行扩大培养，初始OD600值为0.05；37℃225rpm培养至OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，诱导条件为22℃225rpm，18～20h，测量重组大肠杆菌菌液的OD600值，即得含有诱导表达好高温尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的重组大肠杆菌或含有诱导表达好高温NADH氧化酶的重组大肠杆菌；
其中，所述含有目的基因PiUdh的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET15b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)；所述含有目的基因TkNOX的重组大肠杆菌所用质粒载体为pET21b，所用菌株为E.coliBL21(DE3)。
10.如权利要求6所述的生物合成方法，其特征在于，所述含有目的基因TmαGP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.2～2.5；所述含有目的基因StUSP的重组大肠杆菌诱导表达后的OD600值为2.2～2.5。
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