CN109371025A - 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用 - Google Patents

一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109371025A
CN109371025A CN201811508160.1A CN201811508160A CN109371025A CN 109371025 A CN109371025 A CN 109371025A CN 201811508160 A CN201811508160 A CN 201811508160A CN 109371025 A CN109371025 A CN 109371025A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
circular rna
reaction
breast cancer
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811508160.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王立斌
张旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
General Hospital of Ningxia Medical University
Original Assignee
General Hospital of Ningxia Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by General Hospital of Ningxia Medical University filed Critical General Hospital of Ningxia Medical University
Priority to CN201811508160.1A priority Critical patent/CN109371025A/zh
Publication of CN109371025A publication Critical patent/CN109371025A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种环状RNA hsa‑circ‑0044508及其特异性扩增引物和应用，其中，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其在乳腺癌组织细胞以及患有乳腺癌患者的血液中高表达，可以作为筛查乳腺癌的分子标志物；本发明还提供一种用于扩增所述环状RNA的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；本发明还公开了所述特异性扩增引物在制备用于乳腺癌筛查的试剂盒中的应用及包括所述特异性扩增引物的试剂盒。

Description

一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，尤其涉及一种用于乳腺癌诊断的环状RNA，用于所述 环状RNA的特异性扩增引物及应用。
背景技术
乳腺癌是一种常见的女性高危恶性肿瘤，严重影响人们的生活质量。近年来，全世界的 女性癌症患者中大约有22.9％为乳腺癌患者，新发现的乳腺癌患者中，中国患者占12.2％。 尽管在药物敏感性和外科技术上已有巨大的突破，乳腺癌的复发和转移仍频繁地发生，成为 晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。早期诊断、早期治疗能够大大减少乳腺癌恶化的进一步发 生，随着分子水平的发展以及对乳腺癌发生、发展、治疗相关机制的进一步研究，对靶向诊 断和靶向治疗分子标志物的筛选和研究成为乳腺癌研究最受关注的领域之一。
环状RNA(Circular RNA，circRNA)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、 并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子，主要由前体RNA(pre-mRNA)通过可变剪切加工产生。circRNA大多数定位于细胞质中，少数定位于细胞核内，大多数由外显子形成。circRNA不易被核酸外切酶降解，与线性RNA相比能更稳定地存在于生物体内，其在不同的物种中具有保守性，同时在不同组织及发育阶段具有表达特异性，大多数circRNA在不同的物种间含量丰富且都具有组织特异性，在人体组织、唾液、血液和外泌体中都有稳定表达，这使得circRNA成为肿瘤患者诊断、治疗和预后追踪的理想生物标志物。
近年来，关于circRNA与肿瘤之间的关系研究已有很多报道，已经明确circRNA具有调 节肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成、代谢以及耐药等功能。Zhang等通过对不同泌乳时期的 两组老鼠的乳腺组织进行circRNA芯片检测，发现circRNA在不同泌乳期老鼠乳腺组织中 的表达有很大差异，两个时期检测到circRNA种类大多数不同。因此，circRNA可能是乳腺 癌精准诊疗的新靶点，发现和筛选乳腺癌相关的circRNA标志物，对早期防治乳腺癌具有重 要的意义和价值。
发明内容
本申请的目的在于提供以下几个方面：
第一方面，本申请提供一种环状RNA，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中，起始两个核苷酸与最末两个核苷酸为成环结合位点。
所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa-circ-0044508，简称circ-0044508，定 位于人类17号染色体反义链48261456-48270211区域，由COL1A1基因外显子(exon)27-50 区剪切环化而成。
图1为所述环状RNA的基因结构图，如图1所示，所述环状RNA circ-0044508的序列全长3980bp，其中，CDS为蛋白质编码区。
根据本申请的第二方面，提供本发明第一方面所述环状RNA circ-0044508作为筛查乳腺 癌的分子标志物的用途。
通过生物信息学预测，发明人发现环状RNA circ-0044508的应答原件miR-21，该基因能 够通过PDCD4/MAPK信号通路影响肿瘤细胞凋亡。
并且，本发明研究发现相对于乳腺癌患者癌旁正常组织，环状RNA circ-0044508在乳腺 癌组织中显著上调；在血液样本中，相对健康人群，环状RNA circ-0044508在乳腺癌患者血 液中也显著上调。
因此，所述环状RNAcirc-0044508可用于乳腺癌筛查。
第二方面，本申请还提供所述环状RNA用作筛查乳腺癌的分子标志物的用途。
第三方面，本申请还提供一种用于扩增第一方面所述环状RNA的特异性扩增引物，所述 特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，所述上游引物的核苷酸序列为：5’-AAACATAAGGTCCTGCTGGCAA-3’；
所述下游引物的核苷酸序列为：5’-GCCTTGTTCACCTCTCTCGC-3’。
在一种可实现的方式中，所述上游引物的GC含量为45.5％，所述下游引物的GC含量为 60.0％，其中，所述GC含量是指在DNA 4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率。
进一步地，所述上游引物的TM值为56.8，所述下游引物的TM值59.1，验证后上下游引物qPCR使用时的最适合TM值为60，其中，所述TM值是指上游引物或者下游引物的熔 解温度。
本发明人发现，使用本申请提供的特异性扩增引物对第一方面所述RNA进行扩增，如实 施例1所示，将扩增结果进行分析，得到ROC曲线，结果如图3所示，ROC曲线下面积为0.972，这表明使用本申请提供的特异性扩增引物得到的扩增产物为单一条带，无非特异性扩增，所述特异性扩增引物能够作为该种检测的特异性标志物。
第四方面，本申请还提供一种扩增第一方面所述环状RNA的方法，所述方法包括：
步骤1，合成第一链cDNA：混合原料，所述原料包括第一方面所述环状RNA、随机引物、ddH2O、dNTP混合液、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶，按照第一程序控温 反应；
步骤2，对步骤1制得的第一链cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(即，qPCR)扩 增：配制扩增体系，所述扩增体系包括步骤1制备的cDNA、第三方面所示的上游引物、第三方面所示的下游引物、ddH2O、qPCR扩增Mix(含SYBGREEN染料)，按照第二程序控温 反应。
在一种可实现的方式中，步骤1中，
所述原料的按照如下配比混合：1μl第一方面所述环状RNA，1μl随机引物，10μlddH2O， 2μl dNTP混合液，4μl反转录缓冲液，1μl RNA酶抑制剂，1μl反转录酶，其中，所述dNTP 混合液包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP；
所述第一程序为：25℃条件下反应5min，42℃条件下反应60min，70℃条件下反应5min。 使用ABI PCR扩增仪进行反转录，所述cDNA置于-80℃储存备用。
进一步地，在步骤2中，
所述扩增体系按照如下配比配制：2μl步骤1制备的cDNA，0.5μl如第三方面所述的上 游引物，0.5μl第三方面所述的下游引物，7μl ddH2O，10μl qPCR扩增Mix(SYBGREEN 染料)；
所述第二程序为：95℃预变性10s，然后以95℃反应15s、60℃反应30s、72℃反应40s 进行40个循环，以95℃反应5s、65℃反应1min、37℃反应1min，最后终止反应。
第五方面，本申请还提供前述特异性扩增引物在制备用于乳腺癌筛查的试剂盒中的应用。
第六方面，本申请还提供一种用于乳腺癌筛查的试剂盒，所述试剂盒包括第三方面所述 的特异性扩增引物。
在一种可实现的方式中，所述试剂盒还包括反转录酶、缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、荧光染料和dNTP混合液中的至少一种。
所述试剂盒可使用qPCR的方法检测乳腺癌组织及外周血中的circ-0044508，用于筛查乳 腺癌。
本申请人发现，本申请所述的环状RNA在乳腺癌组织细胞中呈现高表达，即，乳腺癌组 织中所述环状RNA的含量远高于癌旁组织中该RNA含量，因此，所述环状RNAcirc-0044508 可以用作乳腺癌筛查的分子标志物，而且，本申请提供的用于扩增所述环状RNA的特异性扩 增引物对所述环状RNA具有高度稳定性、特异性和敏感性，其中灵敏度可达100％，特异性 可达83.3％以上。
附图说明
图1示出circ-0044508基因结构图；
图2示出qPCR检测circ-0044508在乳腺癌组织及癌旁组织中差异表达图；
图3示出乳腺癌组织中circ-0044508检测结果的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更 为清楚、明确。不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例
在实施例中，
所述无RNA酶无DNA酶灭菌水(ddH2O)购自天根生物公司，所述PCR扩增混合体系(Mix)及qPCR(含荧光染料)扩增混合体系(Mix)购自TAKARA公司，所述反转录酶购 自Thermo公司，所述dNTP混合液购自Invitrogen公司。
实施例1 qPCR反应检测circ-0044508在乳腺癌组织中的表达
1、设计特异性扩增引物：
本申请人所设计的特异性扩增引物序列及相关信息如表1所示：
表1特异性扩增引物序列及相关信息
2、总RNA的提取：
(1)Trizol法提取乳腺癌组织/血液中的总RNA：取0.2g乳腺癌组织/血液，在液氮条件 下进行研磨，直至所述组织/血液呈粉末状态，在液氮中加入1mL Trizol继续研磨，待将Trizol 研磨为干粉状态后，室温静置，待干粉化为液体后收集所有液体；
(2)步骤1制得的液体样品在室温下裂解5分钟后，按照每1mL的Trizol研磨匀浆加入0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖紧管盖，涡旋震荡15s后，静置待出现分层后，4℃条件 下12000rpm离心15分钟，离心后混合液体分层为下层氯仿相，中层蛋白层，上层无色水相，RNA全部被分配于水相中；
(3)将水相转移到新的离心管中，按照每1mL的Trizol研磨匀浆加入0.5mL异丙醇的 比例向体系中加入异丙醇，混匀，于-20℃静置30min后，4℃条件下12000rpm离心15分钟， 得沉淀，RNA全部存在于沉淀中；
(4)移去上清液，向体系中加入1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀，于4℃条件下7500rpm离心5分钟；
(5)去除乙醇溶液，室温下干燥5-10分钟，至乙醇挥发，但使RNA未完全干燥，将无RNA酶的ddH2O水加入离心管，60℃孵育5分钟，获得总RNA；
(6)提取的总RNA使用NanoDrop ND-2000测定RNA的浓度和纯度，确定总RNA的 浓度和纯度能够满足后续实验的要求，总RNA溶液分装并置于-80℃保存。
3、第一链cDNA序列的合成：
取PCR管配置反转录体系，反转录体系为：1μL总RNA(约500ng)，1μL随机引物(Thermo公司)，10μL ddH2O(天根生物公司)，2μL dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP 和dTTP，Invitrogen公司)，4μL反转录缓冲液(Thermo公司)，1μL RNA酶抑制剂(Thermo 公司)，1μL反转录酶(Thermo公司)，总体积20μL；
反应条件为：25℃下反应5min；42℃下反应60min，70℃下反应5min。使用ABI PCR扩增仪器进行反转录。反转录得到的cDNA置于-80℃储存备用。
4、Circ-0044508基因cDNA扩增验证：
取2μL步骤3反转录得到的cDNA，配制体系进行PCR扩增；
PCR扩增体系为：2μL cDNA，0.5μL表1中所示上游引物，0.5μ表1中所示下游引物，7μL ddH2O、10μLPCR扩增Mix，总体积20μL；
反应条件为94℃预变性5min；然后以94℃反应30s、60℃下反应20s、72℃反应20s进 行35个循环；最后以72℃反应5min。取2μL反应产物在1.5g琼脂糖/100ml 1×TAE缓冲液，120V电压，25min条件下验证PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
5、qPCR扩增反应：
使用反转录得到的cDNA样品进行检测。
反应体系为：2μL cDNA，0.8μL上游引物，0.8μL下游引物，6.4μL ddH2O(天根生 物公司)，10μL qPCR扩增Mix(SYBGREEN染料)，总体积20μL；
qPCR反应条件：95℃预变性10s，然后以95℃反应15s、60℃反应30s、72℃反应40s进行40个循环，以95℃反应5s、65℃反应1min、37℃反应1min，最后终止反应。
扩增反应在实时荧光定量PCR仪LightCyler480上进行，在扩增目的基因的同时扩增 β-actin作为内参对照，并通过2(-△△CT)法计算基因的相对表达量。
对于实施例1，分别取不同样本，重复6次。
其中，在内参β-actin基因及circ-0044508基因qPCR溶解曲线图中可以看出，扩增峰单 一，无杂峰，证明引物特异性优秀，扩增实验正常。
实施例2 qPCR反应检测circ-0044508在乳腺癌癌旁组织中的表达
重复实施例1的过程，区别在于：在步骤2中，提取乳腺癌癌旁组织中的总RNA。
对于实施例2，分别取不同样本，重复6次。
实施例1～2的qPCR结果分析
1、基因表达分析
其中，circ-0044508的表达结果如图2～3所示：
在图2的6对组织中，相对于乳腺癌癌旁组织，环状RNA circ-0044508在乳腺癌组织中 表达显著上调，上调约6倍。
以上结果表明，环状RNA circ-0044508在乳腺癌组织及癌旁组织中具有差异表达，具体 地，所述环状RNAcirc-0044508在乳腺癌组织中为高表达，因此，所述环状RNAcirc-0044508 可以用于乳腺癌的筛查。
2、ROC曲线分析
对实施例1得到的试验数据进行分析，得到ROC曲线，如图3所示，其中，曲线下面积AUC为0.972，表示检测靶点能够作为检测该环状RNA的特异性标志物，并且，检测灵敏度 可达100％，特异性可达88.3％以上。
本领域技术人员知道，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定 准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性，该值大于0.7即表示检测靶点能够作为该种检测 的特异性标示物。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理 解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对 本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。 本申请的保护范围以所附权利要求为准。
序列表
<110> 宁夏医科大学总医院
<120> 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3980
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
ggtcctgctg gcaaagatgg agaggctgga gctcagggac cccctggccc tgctggtccc 60
gctggcgaga gaggtgaaca aggccctgct ggctcccccg gattccaggg tctccctggt 120
cctgctggtc ctccaggtga agcaggcaaa cctggtgaac agggtgttcc tggagacctt 180
ggcgcccctg gcccctctgg agcaagaggc gagagaggtt tccctggcga gcgtggtgtg 240
caaggtcccc ctggtcctgc tggtccccga ggggccaacg gtgctcccgg caacgatggt 300
gctaagggtg atgctggtgc ccctggagct cccggtagcc agggcgcccc tggccttcag 360
ggaatgcctg gtgaacgtgg tgcagctggt cttccagggc ctaagggtga cagaggtgat 420
gctggtccca aaggtgctga tggctctcct ggcaaagatg gcgtccgtgg tctgactggc 480
cccattggtc ctcctggccc tgctggtgcc cctggtgaca agggtgaaag tggtcccagc 540
ggccctgctg gtcccactgg agctcgtggt gcccccggag accgtggtga gcctggtccc 600
cccggccctg ctggctttgc tggcccccct ggtgctgacg gccaacctgg tgctaaaggc 660
gaacctggtg atgctggtgc taaaggcgat gctggtcccc ctggccctgc cggacccgct 720
ggaccccctg gccccattgg taatgttggt gctcctggag ccaaaggtgc tcgcggcagc 780
gctggtcccc ctggtgctac tggtttccct ggtgctgctg gccgagtcgg tcctcctggc 840
ccctctggaa atgctggacc ccctggccct cctggtcctg ctggcaaaga aggcggcaaa 900
ggtccccgtg gtgagactgg ccctgctgga cgtcctggtg aagttggtcc ccctggtccc 960
cctggccctg ctggcgagaa aggatcccct ggtgctgatg gtcctgctgg tgctcctggt 1020
actcccgggc ctcaaggtat tgctggacag cgtggtgtgg tcggcctgcc tggtcagaga 1080
ggagagagag gcttccctgg tcttcctggc ccctctggtg aacctggcaa acaaggtccc 1140
tctggagcaa gtggtgaacg tggtccccct ggtcccatgg gcccccctgg attggctgga 1200
ccccctggtg aatctggacg tgagggggct cctggtgccg aaggttcccc tggacgagac 1260
ggttctcctg gcgccaaggg tgaccgtggt gagaccggcc ccgctggacc ccctggtgct 1320
cctggtgctc ctggtgcccc tggccccgtt ggccctgctg gcaagagtgg tgatcgtggt 1380
gagactggtc ctgctggtcc caccggtcct gtcggccctg ttggcgcccg tggccccgcc 1440
ggaccccaag gcccccgtgg tgacaagggt gagacaggcg aacagggcga cagaggcata 1500
aagggtcacc gtggcttctc tggcctccag ggtccccctg gccctcctgg ctctcctggt 1560
gaacaaggtc cctctggagc ctctggtcct gctggtcccc gaggtccccc tggctctgct 1620
ggtgctcctg gcaaagatgg actcaacggt ctccctggcc ccattgggcc ccctggtcct 1680
cgcggtcgca ctggtgatgc tggtcctgtt ggtccccccg gccctcctgg acctcctggt 1740
ccccctggtc ctcccagcgc tggtttcgac ttcagcttcc tgccccagcc acctcaagag 1800
aaggctcacg atggtggccg ctactaccgg gctgatgatg ccaatgtggt tcgtgaccgt 1860
gacctcgagg tggacaccac cctcaagagc ctgagccagc agatcgagaa catccggagc 1920
ccagagggca gccgcaagaa ccccgcccgc acctgccgtg acctcaagat gtgccactct 1980
gactggaaga gtggagagta ctggattgac cccaaccaag gctgcaacct ggatgccatc 2040
aaagtcttct gcaacatgga gactggtgag acctgcgtgt accccactca gcccagtgtg 2100
gcccagaaga actggtacat cagcaagaac cccaaggaca agaggcatgt ctggttcggc 2160
gagagcatga ccgatggatt ccagttcgag tatggcggcc agggctccga ccctgccgat 2220
gtggccatcc agctgacctt cctgcgcctg atgtccaccg aggcctccca gaacatcacc 2280
taccactgca agaacagcgt ggcctacatg gaccagcaga ctggcaacct caagaaggcc 2340
ctgctcctcc agggctccaa cgagatcgag atccgcgccg agggcaacag ccgcttcacc 2400
tacagcgtca ctgtcgatgg ctgcacgagt cacaccggag cctggggcaa gacagtgatt 2460
gaatacaaaa ccaccaagac ctcccgcctg cccatcatcg atgtggcccc cttggacgtt 2520
ggtgccccag accaggaatt cggcttcgac gttggccctg tctgcttcct gtaaactccc 2580
tccatcccaa cctggctccc tcccacccaa ccaactttcc ccccaacccg gaaacagaca 2640
agcaacccaa actgaacccc ctcaaaagcc aaaaaatggg agacaatttc acatggactt 2700
tggaaaatat ttttttcctt tgcattcatc tctcaaactt agtttttatc tttgaccaac 2760
cgaacatgac caaaaaccaa aagtgcattc aaccttacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaga 2820
ataaataaat aactttttaa aaaaggaagc ttggtccact tgcttgaaga cccatgcggg 2880
ggtaagtccc tttctgcccg ttgggcttat gaaaccccaa tgctgccctt tctgctcctt 2940
tctccacacc ccccttgggg cctcccctcc actccttccc aaatctgtct ccccagaaga 3000
cacaggaaac aatgtattgt ctgcccagca atcaaaggca atgctcaaac acccaagtgg 3060
cccccaccct cagcccgctc ctgcccgccc agcaccccca ggccctgggg gacctggggt 3120
tctcagactg ccaaagaagc cttgccatct ggcgctccca tggctcttgc aacatctccc 3180
cttcgttttt gagggggtca tgccggggga gccaccagcc cctcactggg ttcggaggag 3240
agtcaggaag ggccacgaca aagcagaaac atcggatttg gggaacgcgt gtcaatccct 3300
tgtgccgcag ggctgggcgg gagagactgt tctgttcctt gtgtaactgt gttgctgaaa 3360
gactacctcg ttcttgtctt gatgtgtcac cggggcaact gcctgggggc ggggatgggg 3420
gcagggtgga agcggctccc cattttatac caaaggtgct acatctatgt gatgggtggg 3480
gtggggaggg aatcactggt gctatagaaa ttgagatgcc cccccaggcc agcaaatgtt 3540
cctttttgtt caaagtctat ttttattcct tgatattttt cttttttttt tttttttttt 3600
gtggatgggg acttgtgaat ttttctaaag gtgctattta acatgggagg agagcgtgtg 3660
cggctccagc ccagcccgct gctcactttc caccctctct ccacctgcct ctggcttctc 3720
aggcctctgc tctccgacct ctctcctctg aaaccctcct ccacagctgc agcccatcct 3780
cccggctccc tcctagtctg tcctgcgtcc tctgtccccg ggtttcagag acaacttccc 3840
aaagcacaaa gcagtttttc cccctagggg tgggaggaag caaaagactc tgtacctatt 3900
ttgtatgtgt ataataattt gagatgtttt taattatttt gattgctgga ataaagcatg 3960
tggaaatgac ccaaacataa 3980
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaacataagg tcctgctggc aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccttgttca cctctctcgc 20

Claims (9)

1.一种环状RNA，其特征在于，所述环状RNA在circ-RNA数据库中的全称为hsa-circ-0044508，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述环状RNA用作筛查乳腺癌的分子标志物的用途。
3.用于扩增权利要求1所述环状RNA的特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物包括上游引物和下游引物，其中，
所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种扩增权利要求1所述环状RNA的方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1，合成第一链cDNA：混合原料，所述原料包括权利要求1所述环状RNA、随机引物、ddH2O、dNTP混合液、反转录缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶，按照第一程序控温反应；
步骤2，对步骤1制得的第一链cDNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应扩增：配制扩增体系，所述扩增体系包括步骤1制备的cDNA、如权利要求3所示的上游引物、如权利要求3所示的下游引物、ddH2O、qPCR扩增荧光染料Mix，按照第二程序控温反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中，
所述原料的按照如下配比混合：1μl权利要求1所述环状RNA，1μl随机引物，10μl ddH2O，2μl dNTP混合液，4μl反转录缓冲液，1μl RNA酶抑制剂，1μl反转录酶，其中，所述dNTP混合液包括dATP，dGTP，dCTP和dTTP；
所述第一程序为：25℃条件下反应5min，42℃条件下反应60min，最后在70℃条件下反应5min。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中，
所述扩增体系按照如下配比配制：2μl步骤1制备的cDNA，0.5μl如权利要求3所述的上游引物，0.5μl如权利要求3所述的下游引物，7μl ddH2O，10μl qPCR扩增荧光染料Mix；
所述第二程序为：95℃预变性10s，然后以95℃反应15s、60℃反应30s、72℃反应40s进行40个循环，以95℃反应5s、65℃反应1min、37℃反应1min，最后终止反应。
7.权利要求3所述的特异性扩增引物在制备用于乳腺癌筛查的试剂盒中的应用。
8.一种用于乳腺癌筛查的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述的特异性扩增引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反转录酶、缓冲液、ddH2O、DNA聚合酶、荧光染料和dNTP混合液中的至少一种。
CN201811508160.1A 2018-12-11 2018-12-11 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用 Pending CN109371025A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508160.1A CN109371025A (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811508160.1A CN109371025A (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109371025A true CN109371025A (zh) 2019-02-22

Family

ID=65373263

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811508160.1A Pending CN109371025A (zh) 2018-12-11 2018-12-11 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109371025A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050975A2 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel circular mammalian rna molecules and uses thereof
CN107254519A (zh) * 2017-06-06 2017-10-17 重庆市肿瘤研究所 三阴性乳腺癌特异性环状rna的筛选方法
CN107475258A (zh) * 2017-08-22 2017-12-15 中山大学肿瘤防治中心 一种RNAcircEPSTI1及其在三阴乳腺癌上的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012050975A2 (en) * 2010-09-29 2012-04-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel circular mammalian rna molecules and uses thereof
CN107254519A (zh) * 2017-06-06 2017-10-17 重庆市肿瘤研究所 三阴性乳腺癌特异性环状rna的筛选方法
CN107475258A (zh) * 2017-08-22 2017-12-15 中山大学肿瘤防治中心 一种RNAcircEPSTI1及其在三阴乳腺癌上的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SALZMAN: "circBase ID hsa_circ_004508", 《CIRCBASE/UCSC》 *
黄宏兴: "《骨质疏松实验研究概论》", 31 July 2018 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101082060B (zh) 新型微核糖核酸定量pcr（聚合酶链式反应）检测方法
CN111004850A (zh) circRNAs分子在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及应用该分子的试剂盒
CN108531596A (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
CN107519193B (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN109371022A (zh) 一种环状RNA hsa_circKPNA2_002及其特异性扩增引物和应用
CN109402123A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0073004及其特异性扩增引物和应用
CN109371027A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0002938及其特异性扩增引物和应用
CN107475441B (zh) 一种预测乳腺癌患者对at方案新辅助化疗的反应性的生物标记物
CN109022583A (zh) hsa_circ_0021977在制备诊断乳腺癌产品上的应用
CN110387372B (zh) 抑制lncRNA表达在胃癌治疗中的应用
CN107190005B (zh) lncRNA作为生物标志物在肺腺癌诊治中的应用
CN107177676A (zh) 长链非编码rna nonhsat113026用于肾癌诊断分子标志物的用途
CN109280705A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0044506及其特异性扩增引物和应用
CN110923324A (zh) 一种乳腺癌miRNA标记物及其应用
CN109402120A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0054020及其特异性扩增引物和应用
CN109280706A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0102618及其特异性扩增引物和应用
CN109371024A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0073006及其特异性扩增引物和应用
CN109402126A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0044513及其特异性扩增引物和应用
CN109371025A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0044508及其特异性扩增引物和应用
CN110317878A (zh) 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用
CN114292919A (zh) 一种早期Luminal乳腺癌风险诊断试剂盒
CN109402122A (zh) 一种环状RNA hsa-circ-0044551及其特异性扩增引物和应用
CN107858427B (zh) miR-429在制备乳腺癌诊断和检测试剂盒中的应用
CN109280707A (zh) 一种环状RNA hsa_circPDE4D_040及其特异性扩增引物和应用
CN109371023A (zh) 一种环状RNA hsa_circKIAA1199_006及其特异性扩增引物和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination