CN109370981A - 安徽白山羊的x***分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种安徽白山羊X***分离方法,包括:对采集的***进行液化;对液化后的***进行孵化;在离心管中依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液,得到密度梯度离心管;取孵化后的***进行离心,倒掉上清液,用PBS溶液重悬后移入密度梯度离心管的最上层,离心后,吸取密度梯度离心管的最下一层的悬液,得到分离的X***。本发明的方法能够有效地对X***进行分离,进而对后代的性别进行有效地选择。
Description
技术领域
本发明涉及山羊的X***分离方法。
背景技术
安徽白山羊属肉皮兼用型羊,是在暖温带半温润气候条件经过长期选育而形成的地方品种,分布于安徽省皖北地区和江淮之间北部,是黄淮山羊的一个地方群,在安徽省分布较广。该品种以性早熟、繁殖力高、板皮质量好而著称,但其个体小、生长速度慢,故作为肉羊生产。安徽白山羊体质结实,结构匀称,肉质鲜美、皮张质量好,是优良的地方畜牧品种。但是该品种繁殖率不高,扩繁速度不够快。因此,挑选X***,提高后代母羊比例具有非常重要的意义。
***分离术是由美国遗传与辅助生育研究所***分离部的研究员发明的一种技术,使得妊娠前可以选择胎儿性别。关于动物的***分离方法和应用,国外学者做了大量研究,有白蛋白梯度游动分离法、***表面抗原免疫学分离法、自由电泳分离法、遗传学分离法、***差异膜蛋白分离法、流氏细胞仪分离法等。Lush试图利用***的密度差异,通过离心分离***的方法控制兔子后代的性别,结果不理想。此后,大多数分离***的研究都通过“物理分离法”进行,以X和Y***之间存在的细微物理差异(密度、电荷、运动特性等)为依据进行分离。Schilling等使用沉降下层的***部分给母牛授精,得到70%雌性率;Ericsson等报道用白蛋白柱法分离Y***,其分离率达到85%,人工授精后男婴出生率为79%;铃木达行用梯度离心法分离牛的***,用分离的X***层授精后到77.18%的母犊;Cardon电泳分离兔***时,用阳极***授精,仔兔中有74.13%的雌性率等。但以上方法重复性差,不同试验之间存在很大的差异(甚至得到相反的结果),不足以指导生产。真正让人们看到希望的性别控制方法是近10多年出现的流式细胞仪分离***的方法。此法在国外已用于畜牧业生产中,并产生了很好的效益,国内近年也有研究和少量使用,前景良好。经过染色后的***通过流式细胞仪时,由于喷嘴产生高频率震动,高速喷射出的液流形成了包含单个X***或者Y***的微小液滴,高速射出喷嘴后逐个与激光交截。***上的荧光染料Hoechst33342被氩离子紫外激光(~350nm)激发会产生蓝色激发光(~460nm)。由于X***所含有DNA比Y***多,结合上比较多的Hoechst33342,所激发出的荧光的强度就比Y***强。蓝色激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号,同时将接受到的信号传入主控机,其根据荧光强度的差别分辨出哪个是X***,哪个是Y***。同时,给被判别的包含单个X***或者Y***的微小液滴加载正电荷或者负电荷。携带正电荷或者负电荷***的液滴在电场力的引导下,分别落入不同的收集容器中,X***和Y***得以分离。1989年美国XY公司首次应用流式细胞仪成功将XY***分离,并达到一定的精确度,自此以后,经过11年的不断技术更新和开发,该项技术从2000年开始从实验室成功进入商业化生产应用,至今已利用分离X***对10787头青年母牛进行了人工授精,受孕率达到53%。XY***分离方法已应用于牛、马等哺乳动物。
上述这些方法都存在着所需设备昂贵,难以在普通繁殖场推广的特点。因此需要发明一种新的简单有效的X***分离方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单有效的X***分离方法。
本发明提供了一种X***分离方法,包括:对采集的***进行液化;对液化后的***进行孵化;在离心管中依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液,得到密度梯度离心管;取孵化后的***进行离心,倒掉上清液,用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层,离心后,吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液,得到分离的X***。
在上述X***分离方法中,其中,对采集的***进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。
在上述X***分离方法中,其中,对液化后的***进行孵化包括:用移液管取1mL液化后的***,放于带有刻度的10ml试管底部,再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液,试管倾斜45度,放于CO2培养箱,孵化35min。
在上述X***分离方法中,其中,在离心管中依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液各2ml。
在上述X***分离方法中,其中,取孵化后的***进行离心包括:从放于CO2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间,吸取2ml***悬液,1000r/min离心8min。
在上述X***分离方法中,其中,用PBS溶液重悬包括用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬。
在上述X***分离方法中,其中,在移入所述密度梯度离心管的最上层之后,250r/min离心30min,之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。
在上述X***分离方法中,还包括:在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后,1000r/min离心8min,之后用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。
本发明的方法能够有效地对X***进行分离,进而对后代的性别进行有效地选择。
附图说明
图1示出了本发明分离的X***与未经分离的***授精后得到的后代性别的结果图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
下面详细描述***的选择与结果验证流程。
1.采***公羊选择与管理
1.1种公羊的选择。种公羊应选择个体等级优秀,符合种用要求,年龄在2岁~5岁龄,体质健壮、睾丸发育良好、***旺盛的种羊。正常使用时,***的活力在0.7~0.8,畸形***少,正常***量为0.8毫升~1.2毫升,密度中等以上。
1.2种公羊的管理。放牧饲养时,要选派责任心强、有放牧经验的放牧员放牧,每天的放牧距离不少于7.5千米。种公羊要单独饲养,圈舍宽敞、清洁干燥、阳光充分、远离母羊圈舍。饲料应多样化,保证青绿饲料和蛋白质饲料的供给。配种季节,每天保证喂给2个~3个新鲜的鸡蛋(带壳喂给)。
1.3种公羊***调教。有些初次配种的公羊,***时可能会遇到困难,此时可采取以下方法进行调教:一是观摩诱导法。即在其他公羊配种或***时,让被调教公羊站在一旁观看,然后诱导它爬跨。二是睾丸按摩法。即在调教期每日定时按摩睾丸10分钟~15分钟,经几天后则会提高公羊***。三是发情母羊刺激法。用发情母羊***羊,将发情母羊***黏液或尿液涂在公羊鼻端,刺激公羊***。四是药物刺激法,即对***差的公羊,隔日每只注射丙***1毫升~2毫升,连续注射3次后可使公羊爬跨。
2.***前的准备
2.1选择发情好的健康母羊作台羊,后躯应擦干净,头部固定在***架上。
2.2种公羊在***前,用湿布将***周围擦干净。
2.3假***的准备:将消毒过的、酒精完全挥发后的内胎,用生理盐水棉球或稀释液棉球从里到外擦拭,在假***一端扣上消过毒并用生理盐水或稀释液冲洗后甩干的集精瓶(温度低于25℃时,集精瓶夹层内要注入30~35℃温水)。在外壳中部生水孔注入150毫升左右的50~55℃温水,拧上气卡塞,套上双连球打气,使假***的***口形成三角形,并拧好气卡。最后把消毒好的温度计***假***内测温,温度在39~42℃,在假***内胎的前1/3,涂抹稀释液或生理盐水作润滑剂,就可立即用于***。
3.***
3.1安装好假***并使其内部温度适当。
3.2将发情旺盛的母羊保定在***架内。
3.3一切准备就绪后,再将公羊赶至***场并避免公羊靠近母羊,等待约一分钟左右。
3.4***员手持假***蹲在母羊右侧一旁。
3.5当公羊跳爬母羊臂部后,立即用左手掌扶住***导引公羊***,右手将假***固定在母羊臂部右侧,使公羊***伸入假***内,公羊向前一冲,说明已经***。待公羊跳下,立即放掉假***内空气,并垂直放置。
3.6取出集精杯,使假***内的精全部进入集精杯内。
应该理解,以上***方法仅是示例性的,还可以采用其他合适的***方法,只要不损坏***的活性即可。
4.原***检查
包括公羊品种、编号、***日期、***用时、检验室温度、***量、色泽、气味、浓度、活力、pH值、***畸形率。山羊的***量一般在0.5~1毫升,色泽为乳白色,云雾状,有少量尿液混入时是浅黄色,如为深黄色则不可用。气味为无味或微腥。
5.X***分离
5.1液化按上述方法采集***后,37℃水浴锅液化20min。
5.2上游法初步分离
用移液管取1mL液化后***,放于带有刻度的10ml试管底部,再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液,试管倾斜45度,放于CO2培养箱,孵化35min。
5.3密度梯度离心
首先配制密度梯度离心管。在10ml离心管内依次加入80%、60%和40%(质量百分数)的Percoll细胞分离液(SIGMA公司,货号:40501ES60)各2ml。再从5.2的试管刻度0和刻度2之间,缓慢吸取2ml***悬液,1000r/min离心8min,倒掉上清液。用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬后缓慢放入密度梯度离心管的最上层。250r/min离心30min后,用移液管在离心管的最下一层吸取1ml悬液,1000r/min离心8min后,用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。所得***基本为X***。
6母羊的同步发情
取20只健康空怀母羊,用孕激素***栓至于母羊***内,第16天取出后,肌肉注射***1000单位/只。第20天左右开始同步发情。用试情公羊检查母羊群两次,上下午各一次,试情公羊用试情布兜住腹部,避免发生自然交配。如果母羊接受公羊爬跨,证明已经发情。
7.人工授精
将母羊保定在***器或专用保定架内,外***及***用0.3%的高锰酸钾冲洗后,用灭菌纸巾擦干,再将***插管***母羊***内,其前端抵达子宫颈;左手虎口部托于母羊下腹部,以拇指和中指、食指摸到***插管的前端。以左手拇指、食指、中指固定子宫颈位置,右手握持输精器末端通过***插管内腔***,前端抵子宫颈处调整输精器的位置探询子宫颈口。左手、右手配合将输精器前端轻轻***子宫体内1-2cm,固定不动。助手将吸有***的注射器插接在输精器上,推动注射器把***缓慢地注入子宫内。输入***0.5-1.0亿。输精次数,连日输精2--3次,每日一次。10只母羊输入分离后的X***,10只母羊输入未经分离的***。精心护理,统计下一代的性别比,并分析各项技术经济指标。
应该理解,上述人工授精方法仅是示例性的,可以采用其他合适的人工授精方法,只要能够有效授精即可。
8.数理统计
实验结果以均数±标准差表示,用GraphPadPrism 6分析***完成处理过程。正常组与寡精组间的差异性分析用t检验。
结果
10只输入X***的母羊共产23只羊羔,其中公羊4只,所占比例为17.4%,母羊19只,所占比例为82.6%。对照组10只母羊共产羊羔21只,公羊11只,母羊10只,所占比例分别为52.4%和47.6%。经2way ANOVA分析,组间差异显著(p<0.001),结果如图1所示。由此可知,本发明的X***分离方法能够有效地对X***进行分离,进而对后代的性别进行更有效地选择。
本领域技术人员应理解,以上实施例仅是示例性实施例,在不背离本申请的精神和范围的情况下,可以进行多种变化、替换以及改变。
Claims (8)
1.一种安徽白山羊X***分离方法,包括:
对采集的***进行液化;
对液化后的***进行孵化;
在离心管中依次加入质量百分数为80%、60%和40%的Percoll溶液,得到密度梯度离心管;
取孵化后的***进行离心,倒掉上清液,用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层,离心后,吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液,得到分离的X***。
2.根据权利要求1所述的X***分离方法,其中,对采集的***进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。
3.根据权利要求1所述的X***分离方法,其中,对液化后的***进行孵化包括:用移液管取1mL液化后的***,放于带有刻度的10ml试管底部,再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液,试管倾斜45度,放于CO2培养箱,孵化35min。
4.根据权利要求1所述的X***分离方法,其中,在离心管中依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80%、60%和40%的Percoll溶液各2ml。
5.根据权利要求3所述的X***分离方法,其中,取孵化后的***进行离心包括:从放于CO2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间,吸取2ml***悬液,1000r/min离心8min。
6.根据权利要求1所述的X***分离方法,其中,用PBS溶液重悬包括用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬。
7.根据权利要求1所述的X***分离方法,其中,在移入所述密度梯度离心管的最上层之后,250r/min离心30min,之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。
8.根据权利要求1所述的X***分离方法,还包括:
在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后,1000r/min离心8min,之后用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004072220A2 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-26 | Fundacão De Amparo A Pesquisa Do Estado De São Paulo | Process of sex selection of mammal spermatozoa and method to control quality of frozen sexed semen doses |
CN1667118A (zh) * | 2004-08-31 | 2005-09-14 | 广西大学 | 一种分离哺乳动物xy***的方法 |
CN1951185A (zh) * | 2006-11-07 | 2007-04-25 | 山东农业大学 | 山羊***液态保存方法 |
CN101411722A (zh) * | 2008-10-22 | 2009-04-22 | 李喜和 | 奶牛x/y性别控制冷冻混合***及其制备方法 |
-
2018
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004072220A2 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-26 | Fundacão De Amparo A Pesquisa Do Estado De São Paulo | Process of sex selection of mammal spermatozoa and method to control quality of frozen sexed semen doses |
CN1667118A (zh) * | 2004-08-31 | 2005-09-14 | 广西大学 | 一种分离哺乳动物xy***的方法 |
CN1951185A (zh) * | 2006-11-07 | 2007-04-25 | 山东农业大学 | 山羊***液态保存方法 |
CN101411722A (zh) * | 2008-10-22 | 2009-04-22 | 李喜和 | 奶牛x/y性别控制冷冻混合***及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
曲蕾 等: "流式细胞分离法在哺乳动物***分离中的应用及前景 ", 《黑龙江畜牧兽医》 * |
杨恩昌: "流式细胞法分离波尔山羊X、Y***的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库.农业科技辑》 * |
高庆华 等: "奶山羊XY***分离及低剂量输精效果研究 ", 《中国草食动物》 * |
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