CN109370981A - 安徽白山羊的x***分离方法 - Google Patents

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朱茂英
辛洪雷
辛洪飞
辛红忠
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Abstract

本发明提供了一种安徽白山羊X***分离方法，包括：对采集的***进行液化；对液化后的***进行孵化；在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的***进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X***。本发明的方法能够有效地对X***进行分离，进而对后代的性别进行有效地选择。

Description

安徽白山羊的X***分离方法
技术领域
本发明涉及山羊的X***分离方法。
背景技术
安徽白山羊属肉皮兼用型羊，是在暖温带半温润气候条件经过长期选育而形成的地方品种，分布于安徽省皖北地区和江淮之间北部，是黄淮山羊的一个地方群，在安徽省分布较广。该品种以性早熟、繁殖力高、板皮质量好而著称，但其个体小、生长速度慢，故作为肉羊生产。安徽白山羊体质结实，结构匀称，肉质鲜美、皮张质量好，是优良的地方畜牧品种。但是该品种繁殖率不高，扩繁速度不够快。因此，挑选X***，提高后代母羊比例具有非常重要的意义。
***分离术是由美国遗传与辅助生育研究所***分离部的研究员发明的一种技术，使得妊娠前可以选择胎儿性别。关于动物的***分离方法和应用，国外学者做了大量研究，有白蛋白梯度游动分离法、***表面抗原免疫学分离法、自由电泳分离法、遗传学分离法、***差异膜蛋白分离法、流氏细胞仪分离法等。Lush试图利用***的密度差异,通过离心分离***的方法控制兔子后代的性别,结果不理想。此后,大多数分离***的研究都通过“物理分离法”进行,以X和Y***之间存在的细微物理差异(密度、电荷、运动特性等)为依据进行分离。Schilling等使用沉降下层的***部分给母牛授精,得到70％雌性率；Ericsson等报道用白蛋白柱法分离Y***,其分离率达到85％,人工授精后男婴出生率为79％；铃木达行用梯度离心法分离牛的***,用分离的X***层授精后到77.18％的母犊；Cardon电泳分离兔***时,用阳极***授精,仔兔中有74.13％的雌性率等。但以上方法重复性差,不同试验之间存在很大的差异(甚至得到相反的结果),不足以指导生产。真正让人们看到希望的性别控制方法是近10多年出现的流式细胞仪分离***的方法。此法在国外已用于畜牧业生产中,并产生了很好的效益,国内近年也有研究和少量使用,前景良好。经过染色后的***通过流式细胞仪时，由于喷嘴产生高频率震动，高速喷射出的液流形成了包含单个X***或者Y***的微小液滴，高速射出喷嘴后逐个与激光交截。***上的荧光染料Hoechst33342被氩离子紫外激光(～350nm)激发会产生蓝色激发光(～460nm)。由于X***所含有DNA比Y***多，结合上比较多的Hoechst33342，所激发出的荧光的强度就比Y***强。蓝色激发光被正、侧两个光电倍增管接受后放大荧光信号，同时将接受到的信号传入主控机，其根据荧光强度的差别分辨出哪个是X***，哪个是Y***。同时，给被判别的包含单个X***或者Y***的微小液滴加载正电荷或者负电荷。携带正电荷或者负电荷***的液滴在电场力的引导下，分别落入不同的收集容器中，X***和Y***得以分离。1989年美国XY公司首次应用流式细胞仪成功将XY***分离，并达到一定的精确度，自此以后，经过11年的不断技术更新和开发，该项技术从2000年开始从实验室成功进入商业化生产应用，至今已利用分离X***对10787头青年母牛进行了人工授精，受孕率达到53％。XY***分离方法已应用于牛、马等哺乳动物。
上述这些方法都存在着所需设备昂贵，难以在普通繁殖场推广的特点。因此需要发明一种新的简单有效的X***分离方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单有效的X***分离方法。
本发明提供了一种X***分离方法，包括：对采集的***进行液化；对液化后的***进行孵化；在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；取孵化后的***进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X***。
在上述X***分离方法中，其中，对采集的***进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。
在上述X***分离方法中，其中，对液化后的***进行孵化包括：用移液管取1mL液化后的***，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液，试管倾斜45度，放于CO2培养箱，孵化35min。
在上述X***分离方法中，其中，在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液各2ml。
在上述X***分离方法中，其中，取孵化后的***进行离心包括：从放于CO2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间，吸取2ml***悬液，1000r/min离心8min。
在上述X***分离方法中，其中，用PBS溶液重悬包括用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬。
在上述X***分离方法中，其中，在移入所述密度梯度离心管的最上层之后，250r/min离心30min，之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。
在上述X***分离方法中，还包括：在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后，1000r/min离心8min，之后用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。
本发明的方法能够有效地对X***进行分离，进而对后代的性别进行有效地选择。
附图说明
图1示出了本发明分离的X***与未经分离的***授精后得到的后代性别的结果图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
下面详细描述***的选择与结果验证流程。
1.采***公羊选择与管理
1.1种公羊的选择。种公羊应选择个体等级优秀，符合种用要求，年龄在2岁～5岁龄，体质健壮、睾丸发育良好、***旺盛的种羊。正常使用时，***的活力在0.7～0.8，畸形***少，正常***量为0.8毫升～1.2毫升，密度中等以上。
1.2种公羊的管理。放牧饲养时，要选派责任心强、有放牧经验的放牧员放牧，每天的放牧距离不少于7.5千米。种公羊要单独饲养，圈舍宽敞、清洁干燥、阳光充分、远离母羊圈舍。饲料应多样化，保证青绿饲料和蛋白质饲料的供给。配种季节，每天保证喂给2个～3个新鲜的鸡蛋(带壳喂给)。
1.3种公羊***调教。有些初次配种的公羊，***时可能会遇到困难，此时可采取以下方法进行调教：一是观摩诱导法。即在其他公羊配种或***时，让被调教公羊站在一旁观看，然后诱导它爬跨。二是睾丸按摩法。即在调教期每日定时按摩睾丸10分钟～15分钟，经几天后则会提高公羊***。三是发情母羊刺激法。用发情母羊***羊，将发情母羊***黏液或尿液涂在公羊鼻端，刺激公羊***。四是药物刺激法，即对***差的公羊，隔日每只注射丙***1毫升～2毫升，连续注射3次后可使公羊爬跨。
2.***前的准备
2.1选择发情好的健康母羊作台羊，后躯应擦干净，头部固定在***架上。
2.2种公羊在***前，用湿布将***周围擦干净。
2.3假***的准备：将消毒过的、酒精完全挥发后的内胎，用生理盐水棉球或稀释液棉球从里到外擦拭，在假***一端扣上消过毒并用生理盐水或稀释液冲洗后甩干的集精瓶(温度低于25℃时，集精瓶夹层内要注入30～35℃温水)。在外壳中部生水孔注入150毫升左右的50～55℃温水，拧上气卡塞，套上双连球打气，使假***的***口形成三角形，并拧好气卡。最后把消毒好的温度计***假***内测温，温度在39～42℃，在假***内胎的前1/3，涂抹稀释液或生理盐水作润滑剂，就可立即用于***。
3.***
3.1安装好假***并使其内部温度适当。
3.2将发情旺盛的母羊保定在***架内。
3.3一切准备就绪后，再将公羊赶至***场并避免公羊靠近母羊，等待约一分钟左右。
3.4***员手持假***蹲在母羊右侧一旁。
3.5当公羊跳爬母羊臂部后，立即用左手掌扶住***导引公羊***，右手将假***固定在母羊臂部右侧，使公羊***伸入假***内，公羊向前一冲，说明已经***。待公羊跳下，立即放掉假***内空气，并垂直放置。
3.6取出集精杯，使假***内的精全部进入集精杯内。
应该理解，以上***方法仅是示例性的，还可以采用其他合适的***方法，只要不损坏***的活性即可。
4.原***检查
包括公羊品种、编号、***日期、***用时、检验室温度、***量、色泽、气味、浓度、活力、pH值、***畸形率。山羊的***量一般在0.5～1毫升，色泽为乳白色，云雾状，有少量尿液混入时是浅黄色，如为深黄色则不可用。气味为无味或微腥。
5.X***分离
5.1液化按上述方法采集***后，37℃水浴锅液化20min。
5.2上游法初步分离
用移液管取1mL液化后***，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液，试管倾斜45度，放于CO2培养箱，孵化35min。
5.3密度梯度离心
首先配制密度梯度离心管。在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％(质量百分数)的Percoll细胞分离液(SIGMA公司，货号：40501ES60)各2ml。再从5.2的试管刻度0和刻度2之间，缓慢吸取2ml***悬液，1000r/min离心8min，倒掉上清液。用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬后缓慢放入密度梯度离心管的最上层。250r/min离心30min后，用移液管在离心管的最下一层吸取1ml悬液，1000r/min离心8min后，用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。所得***基本为X***。
6母羊的同步发情
取20只健康空怀母羊，用孕激素***栓至于母羊***内，第16天取出后，肌肉注射***1000单位/只。第20天左右开始同步发情。用试情公羊检查母羊群两次，上下午各一次，试情公羊用试情布兜住腹部，避免发生自然交配。如果母羊接受公羊爬跨，证明已经发情。
7.人工授精
将母羊保定在***器或专用保定架内，外***及***用0.3％的高锰酸钾冲洗后，用灭菌纸巾擦干，再将***插管***母羊***内，其前端抵达子宫颈；左手虎口部托于母羊下腹部，以拇指和中指、食指摸到***插管的前端。以左手拇指、食指、中指固定子宫颈位置，右手握持输精器末端通过***插管内腔***，前端抵子宫颈处调整输精器的位置探询子宫颈口。左手、右手配合将输精器前端轻轻***子宫体内1-2cm，固定不动。助手将吸有***的注射器插接在输精器上，推动注射器把***缓慢地注入子宫内。输入***0.5-1.0亿。输精次数，连日输精2--3次，每日一次。10只母羊输入分离后的X***，10只母羊输入未经分离的***。精心护理，统计下一代的性别比，并分析各项技术经济指标。
应该理解，上述人工授精方法仅是示例性的，可以采用其他合适的人工授精方法，只要能够有效授精即可。
8.数理统计
实验结果以均数±标准差表示，用GraphPadPrism 6分析***完成处理过程。正常组与寡精组间的差异性分析用t检验。
结果
10只输入X***的母羊共产23只羊羔，其中公羊4只，所占比例为17.4％，母羊19只，所占比例为82.6％。对照组10只母羊共产羊羔21只，公羊11只，母羊10只，所占比例分别为52.4％和47.6％。经2way ANOVA分析，组间差异显著(p<0.001)，结果如图1所示。由此可知，本发明的X***分离方法能够有效地对X***进行分离，进而对后代的性别进行更有效地选择。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

Claims (8)

1.一种安徽白山羊X***分离方法，包括：
对采集的***进行液化；
对液化后的***进行孵化；
在离心管中依次加入质量百分数为80％、60％和40％的Percoll溶液，得到密度梯度离心管；
取孵化后的***进行离心，倒掉上清液，用PBS溶液重悬后移入所述密度梯度离心管的最上层，离心后，吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液，得到分离的X***。
2.根据权利要求1所述的X***分离方法，其中，对采集的***进行液化包括在37℃水浴锅中液化20min。
3.根据权利要求1所述的X***分离方法，其中，对液化后的***进行孵化包括：用移液管取1mL液化后的***，放于带有刻度的10ml试管底部，再向试管内加入3mL预热至37℃的PBS溶液，试管倾斜45度，放于CO2培养箱，孵化35min。
4.根据权利要求1所述的X***分离方法，其中，在离心管中依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液包括在10ml离心管内依次加入80％、60％和40％的Percoll溶液各2ml。
5.根据权利要求3所述的X***分离方法，其中，取孵化后的***进行离心包括：从放于CO2培养箱孵化的试管的刻度0和刻度2之间，吸取2ml***悬液，1000r/min离心8min。
6.根据权利要求1所述的X***分离方法，其中，用PBS溶液重悬包括用1ml预热至37℃的PBS溶液重悬。
7.根据权利要求1所述的X***分离方法，其中，在移入所述密度梯度离心管的最上层之后，250r/min离心30min，之后吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液。
8.根据权利要求1所述的X***分离方法，还包括：
在吸取所述密度梯度离心管的最下一层的悬液之后，1000r/min离心8min，之后用预热至37℃的PBS溶液调整***密度至7500万/mL。
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