CN109364299A - 一种盆底生物修补网片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种盆底生物修补网片及其制备方法，该盆底生物补片以动物组织为原料，去除细胞、DNA等免疫成分，切成细条状后捻成线，编织成补片。脱细胞材料通过加捻成线获得更大的强度从而不那么容易断裂，并且编织后因为线与线之间有交织，拉伸撕裂的外力不是作用在一个点上而是多个交织点上，因此具有良好的力学性能，解决了脱细胞材料盆底生物补片力学强度差及需要引入交联剂或合成材料的缺点，而且所述网片的结构由编织工艺制得，网片孔径的大小可以很容易通过编织参数调节，以达到满足实际应用的需求。同时，该盆底生物补片保留了细胞外基质中原有的三维结构、非胶原蛋白及生长因子等成分，促进组织的功能性重建及术后愈合。

Description

一种盆底生物修补网片及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种盆底生物修补网片及其制备方法。

背景技术

女性盆底功能障碍主要表现为盆腔器官脱垂和压力性尿失禁等，有报道称50％的经产妇不同程度的存在盆底功能障碍的问题。外科手术是治疗较为严重的盆底功能障碍的主要方法，手术方法主要为各种组织和生理结构的修补术和悬吊术。往往需要同时植入补片等材料用以增强手术疗效。无张力盆底修补术是目前盆底的主要手术方式。随着医用生物材料的迅猛发展，各种盆底修补材料已广泛应用于临床中。

盆底补片主要分为合成材料补片和生物材料补片两大类。

①合成材料补片

合成材料所制盆底补片主要成分为多聚合物，包括可降解型和非可降解型两类。非可降解型合成材料补片抗拉伸强度良好，但因不能被组织降解，无法与机体组织有机结合，置入后易引起术后局部组织炎症以及感染，长期体内存留后的结构完整性遭到破坏，可迁移到其他组织，引起慢性炎症和异物反应，需要进行翻修手术；其次由于在体内与周围组织力学顺应性的差别，会逐渐引起周围组织的纤维化反应并逐渐形成纤维包膜，经过长时间的使用，产品对于相邻组织器官的侵蚀风险加大。

随着技术发展，也衍生出了可降解型合成材料补片，而可降解型合成材料补片，一般是采用聚乳酸等合成，虽然力学性能尚可，但植入体内后引起急性炎症反应，其次是慢性炎症，最终形成肉芽组织，纤维包裹；并且聚乳酸等材料在降解过程中局部形成的高浓度乳酸、羟基乙酸易造成细胞毒性。

合成材料力学强度较好，但生物性能差，且不能诱导组织再生和愈合。因此合成补片发展方向是仿生化，即采用不同的编织方法以及添加天然生物材料如胶原蛋白、纤维蛋白等，模拟组织特性，以便增强愈合潜能，进而提高盆底修复手术的成功率。

②生物材料补片

生物材料补片多来源于组织材料，可分为同种异体脱细胞组织材料和异种脱细胞组织材料等。

同种异体材料主要源于人类皮肤真皮组织的产品，虽然它们具有促进盆底修补术后组织愈合的能力，但是存在来源缺乏、易传染疾病（如艾滋病）等风险，所以应用受到一定限制。

异种脱细胞材料主要来源于动物的真皮、小肠、膀胱、心包膜等组织，是通过对细胞、DNA等免疫成分的处理，从而获得的保留有细胞外基质中原有的三维结构及胶原纤维成分的材料。细胞外基质中的三维结构、胶原蛋白、非胶原蛋白及生长因子等成分为宿主细胞黏附、增殖、分化提供适应的环境，有助于组织的功能性重建，进而促进盆底修补术后组织的愈合。

在实际应用中脱细胞材料补片因其自身力学强度不足，在其加工过程中需引入环氧化物或戊二醛等化学交联剂，存在以下缺点：有潜在的细胞毒性，降解速率较慢，与组织再生不匹配，可导致纤维化、慢性炎症等反应。授权号为CN103800942的中国发明专利，骨盆底修补片，是通过静电纺丝等技术把不可降解和可降解的合成材料制备成补片；申请号为201610678065.0的中国发明专利，虽然采用了生物材料制备补片，但只是用夹具使多层紧密贴合，或者用粘合剂或缝合线将各层牢固的贴合在一起，没有从本质上增加生物材料的力学强度。

为此，在不引入合成材料或交联剂的基础上，为了增强盆底生物补片材料的力学强度，本发明应运而生。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的生物补片在结构强度上的不足之处，提供一种盆底生物修补网片。

为此，本发明提供的盆底生物修补网片，其中，所述网片由异种脱细胞基质材料编织而成。

进一步的，所述异种脱细胞基质材料由异种脱细胞基质通过清洗切条、病毒灭活、脱脂、脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原、定型、冻干而成。

进一步的，所述脱细胞基质包括但不限制于哺乳动物的小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合。

进一步的，所述脱细胞基质为动物的小肠粘膜下层。

本发明还提供了一种盆底生物修补网片的制备方法，包括：

（1）预处理，

取新鲜屠宰动物的动物组织清洗洁净，置于醋酸溶液浸泡，刮除除去动物组织的粘膜层、肌层、浆膜层、***，分离出粘膜下层，纵向均匀切成细条状，并用纯化水冲洗，得到盆底生物修补材料；

（2）病毒灭活，

将盆底生物修补材料使用过氧乙酸和乙醇的混合水溶液，在超声室温条件下浸泡，进行病毒灭活并用纯化水超声清洗；

（3）脱脂，

使用乙醇溶液，超声、常温条件下浸泡，之后使用注射用水超声清洗；

（4）脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原，

使用含胰蛋白酶和含EDTA的混合水溶液，在超声条件下浸泡，之后使用PBS超声清洗；

使用含DNA 酶的水溶液，超声条件下浸泡；之后使用PBS漂超声清洗；

使用含α-半乳糖苷酶的水溶液，超声条件下浸泡；之后使用PBS超声清洗；

使用NaOH水溶液，超声条件下，常温浸泡之后使用PBS超声清洗直至中性；

（5）定型、冻干、编织、灭菌

将处理后的细条状粘膜下层捻成线，固定于模具上，冷冻干燥后，编织成网片状的盆底生物修补网片，PET包装袋包装后进行辐照灭菌。

进一步的，在预处理步骤中，醋酸的浓度为0.01%-0.5%，浸泡时间为10-120min，动物组织与醋酸溶液的比例为1:2-1:10。

进一步的，在病毒灭活步骤中，过氧乙酸的浓度为0.5-1.5％，乙醇的浓度为15-25％，盆底生物修补材料与混合水溶液的比例为1:2-1：10，浸泡时间为30-120min。

进一步的，在脱脂步骤中，乙醇的浓度为90-100%，盆底生物修补材料与乙醇的比例为1:2-1:10，常温浸泡时间为0.5-12h。

进一步的，在脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原步骤中：

混合水溶液中胰蛋白酶和EDTA的含量分别为0.01-0.10％和0.01- 0.05%，盆底生物修补材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:2-1:10，超声条件下，于36±2℃条件下浸泡15-40min；

含DNA酶的水溶液中DNA酶的含量为0.05-10U/ml，盆底生物修补材料与含DNA酶的水溶液的比例为1:2-1:10，浸泡温度为36±2℃，浸泡时间为15-40min；

含α-半乳糖苷酶的水溶液中α-半乳糖苷酶的含量为0.05-10U/ml，盆底生物修补材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:2-1:10，浸泡温度为20-37℃，浸泡时间为15-40min；

NaOH水溶液的浓度为5-40mM，盆底生物修补材料与NaOH溶液的比例为1:5-1:50，常温浸泡时间为20-60min。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

本发明所要解决的技术问题是针对盆底生物补片的不足之处，提供一种新型盆底生物修补网片。

1. 本发明提供的盆底生物修补网片以动物的真皮、小肠、心包膜等组织为原料，去除细胞、DNA等免疫成分，切成细条状后捻成线，编织成网片。异种脱细胞材料通过加捻成线获得更大的力学强度从而不那么容易断裂，并且编织成网片状的补片后因为线与线之间有交织，拉伸撕裂的外力不是作用在一个点上而是多个交织点上因此具有良好的力学性能，解决了异种脱细胞材料盆底生物补片力学强度差的缺点，而且所述网片的结构由编织工艺制得，网片孔径的大小可以很容易通过编织参数调节，以达到满足实际应用的需求。

2. 本发明提供的盆底生物修补网片保留了细胞外基质中原有的三维结构、胶原纤维、非胶原蛋白及生长因子等成分，具有促愈合作用，加快肌腱的功能性重建及盆底修补术后的愈合。

3.本发明提供的盆底生物修补网片，其ECM三维结构具诱导细胞和血管长入功能，在新组织长入的同时自身会逐渐降解，降解产物的多肽成分具有抗菌性能，可降低植入后炎症和感染的发生率。

4. 本发明提供的盆底生物修补网片，不引入交联剂和合成材料，不会具有潜在的细胞毒性，更不会导致纤维化、慢性炎症等反应。

5. 本发明提供的盆底生物修补网片，根据临床需求，可在制备过程中加入促愈合物质或抗生素，也可以在植入体内之前通过浸泡方式装载促愈合物质或抗生素，从而进一步促进创口愈合和降低感染发生率。

附图说明

图1为盆底生物修补网片的实物图。

图2为盆底生物修补网片的结构示意图。

图3为盆底生物修补网片切片HE染色图。

图4为盆底生物修补网片的微观图。

图5为盆底生物修补网片的制备流程图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

猪小肠粘膜下层盆底生物修补网片的制备，请参阅图5：

（1）预处理

取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.5%醋酸溶液浸泡30min，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、***，分离出粘膜下层，纵向均匀切成细条状，使用纯化水冲洗3 遍，得到生物修补材料，即小肠粘膜下层，下述均简称SIS材料。

（2）病毒灭活

使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100min，进行病毒灭活。之后使用纯化水超声清洗3遍。

（3）脱脂

使用浓度为95%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h。之后使用注射用水超声清洗3遍。

（4）脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原

使用含0.02％胰蛋白酶和含0.02%EDTA的混合水溶液，SIS材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡30min。之后使用PBS超声清洗3遍。

使用含5U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20min。之后使用PBS漂超声清洗3遍。

使用含5U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20min。之后使用PBS超声清洗3遍。

使用浓度为25mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50min。之后使用PBS超声清洗直至中性。

（5）定型、冻干、编织、灭菌

将处理后的带状细条状粘膜下层捻成线，固定于模具上，冷冻干燥后，通过编织机编织成图1中网片状的盆底生物修补网片，PET包装袋包装后进行辐照灭菌，盆底生物修补网片的示意图见图2。

实施例2

猪小肠粘膜下层盆底生物修补网片的制备

（1）预处理

取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.01%醋酸溶液浸泡120min，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:10，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、***，分离出粘膜下层，切成片段，使用纯化水冲洗3 遍。

（2）病毒灭活

使用含有0.5％过氧乙酸和25％乙醇的混合水溶液，SIS材料与混合水溶液的比例为1:15，超声条件下，室温浸泡120min，进行病毒灭活。之后使用纯化水超声清洗3遍。

（3）脱脂

使用浓度为90%的乙醇，SIS材料与乙醇的比例为1:15，超声条件下，常温浸泡4h。之后使用注射用水超声清洗3遍。

（4）脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原

使用含0.05％胰蛋白酶和含0.01%EDTA的混合水溶液，SIS材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:10，超声条件下，于37℃条件下浸泡20min。之后使用PBS超声清洗3遍。

使用含1U/ml DNA 酶的水溶液，SIS材料与DNA酶溶液的比例为1:10，超声条件下，于37℃条件下浸泡30min。之后使用PBS漂超声清洗3遍。

使用含1U/ml α-半乳糖苷酶的水溶液，SIS材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:10，超声条件下，于30℃条件下浸泡30min。之后使用PBS超声清洗3遍。

使用浓度为40mM 的NaOH水溶液，SIS材料与NaOH溶液的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡30min。之后使用PBS超声清洗直至中性。

（5）定型、冻干、编织、灭菌

将处理后的细条状小肠粘膜下层捻成线，固定于模具上，冷冻干燥后，通过编织机编织成网片状的盆底生物修补网片，PET包装袋包装后进行辐照灭菌。

实施例3

为了样品的安全性，对实施例1-2制备得到的样品进行免疫原性物质检测。

（1）细胞残留量检测方法：用10%中性***固定，石蜡包埋，切成0.4微米的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木精—伊红染色，显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构。

（2）DNA含量检测方法：依据YY/T 0606.25-2014《动物源性生物材料DNA 残留量测定法：荧光染色法》进行检测。

（3）α-Gal抗原含量检测方法：将样品用多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，片厚3微米。利用生物素标记BSI-B4与α-Gal抗原的特异亲和特性进行免疫组化反应。染色结果判定 ：深棕黄色颗粒为强阳性（+++）， 棕黄色颗粒为阳性（++），黄色颗粒为弱阳性（+），未见着色为阴性 （-）。

（4）脂质含量检测方法：参照《GB/T 5009.6 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法进行测定。

结果见下表：

实施例4

对实施例1-2制备得到的样品进行生物学性能、组织学检测、细菌内毒素和抗菌性能检测。

（1）生物学性能检测

方法：参照GB/T16886系列方法进行试验。

结果：细胞毒性反应均为1 级；无迟发型超敏反应；皮内反应显示试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0；无致热性；无溶血反应；遗传毒性试验结果显示， 鼠伤寒沙门氏菌回复突变（Ames）试验呈阴性反应、小鼠淋巴瘤试验呈阴性反应、无染色体畸变性；无急性全身性毒性反应；无亚慢性全身性毒性；肌肉植入30天、60天、90天跟阴性对照品的组织反应无明显区别。

（2）组织学检测

1）光学显微镜观察

方法：用10%中性***固定，石蜡包埋，切成0.4微米的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木精—伊红染色，显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构。

结果：无细胞和细胞碎片残留；胶原纤维连续，无断裂，如图3所示。

2）超微结构观察

方法：使用电子扫描镜进行扫描。

结果：材料呈多孔结构，胶原纤维无断裂，如图4所示。

（3）细菌内毒素检测

方法：参照GB/T 14233中相关方法进行检测。

结果：均小于2.15EU/件。

（4）抗菌性能检测

用研磨棒在0.01M的盐酸中分别研磨实施例1和2所制得的样品，直至无肉眼可见颗粒，并调整其浓度为100mg/10mL。加入胃蛋白酶消化，胃蛋白酶:样品比例为1:10。 25℃下持续搅拌48h，后降温至4℃，加入1/10体积的0.1 M氢氧化钠调节PH至7.2-7.4。

制备混菌培养基平板，用接种环分别挑取少许已培养好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌斜面培养基物于无菌生理盐水 5ml中，制成菌悬液。取菌悬液 1.0ml和上述经降解的样品1ml加到已灭菌干燥的培养皿中，加入冷却至 50℃左右的普通营养肉汤琼脂培养基，摇匀，待充分冷凝后备用，35～37℃倒置培养 24 小时，观察细菌生长情况；同时增加不用抗菌材料和加入5 μg/mL抗菌肽做对比，结果见下表：

实施例5

对实施例1-2制备得到的样品及未经过切割和编织的样品1-2进行力学性能检测。

（1）缝合强度

方法：用3-0非吸收缝合线在样品两边中央距边缘2mm处缝合，将缝合线另一端与样品的另一端分别固定在拉力仪两端上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值。

（2）拉伸强度

方法：将样品沿两个方向分别裁剪为宽度为10mm形状；裁剪后在相对湿度40%-60%、温度22±2℃环境内放置2小时后进行试验。夹具间距为25mm，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度拉伸，记录断裂时的最大力值。

（3）顶破强度

方法：按照《YY 0500-2004 心血管植入物人工血管》8.3.3.2探头破裂强度的测量方法选取9.5mm直径探头进行检测，结果见下表：

本领域中普通技术人员可根据上述说明对本发明做出多种变化。因而，在不违反本发明的权利要求宗旨的前提下，实施例中的某些细节不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

Claims (10)

1.一种盆底生物修补网片，其特征在于：所述网片由异种脱细胞基质材料编织而成。

2.根据权利要求1所述的盆底生物修补网片，其特征在于：所述网片的结构由编织工艺制得，网片孔径的大小可通过编织参数调节。

3.根据权利要求1所述的盆底生物修补网片，其特征在于：所述脱细胞基质包括但不限制于哺乳动物的小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、真皮基质、心包膜、脑膜、羊膜、脏器膜、腹膜的一种或多种组合。

4.根据权利要求3所述的盆底生物修补网片，其特征在于：所述脱细胞基质为动物的小肠粘膜下层。

5.一种如权利要求 1~4 所述的盆底生物修补网片在盆底组织的修补愈合用途。

6.一种盆底生物修补网片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）预处理，

取新鲜屠宰动物的动物组织清洗洁净，置于醋酸溶液浸泡，刮除除去动物组织的粘膜层、肌层、浆膜层、***，分离出粘膜下层，纵向均匀切成细条状，并用纯化水冲洗，得到盆底生物修补材料；

（2）病毒灭活，

将盆底生物修补材料使用含有过氧乙酸和乙醇的混合水溶液，在超声室温条件下浸泡，进行病毒灭活并用纯化水超声清洗；

（3）脱脂，

使用乙醇溶液，超声、常温条件下浸泡，之后使用注射用水超声清洗；

（4）脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原，

使用含胰蛋白酶和含EDTA的混合水溶液，在超声条件下浸泡，之后使用PBS超声清洗；

使用含DNA 酶的水溶液，超声条件下浸泡；之后使用PBS漂超声清洗；

使用含α-半乳糖苷酶的水溶液，超声条件下浸泡；之后使用PBS超声清洗；

使用NaOH水溶液，超声条件下，常温浸泡之后使用PBS超声清洗直至中性；

（5）定型、冻干、编织、灭菌，

将处理后的细条状粘膜下层捻成线，固定于模具上，冷冻干燥后，编织成网片状的盆底生物修补网片， PET包装袋包装后进行辐照灭菌。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在预处理步骤中，醋酸的浓度为0.01%-0.5%，浸泡时间为10-120min，动物组织与醋酸溶液的比例为1:2-1:10。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在病毒灭活步骤中，过氧乙酸的浓度为0.5-1.5％，乙醇的浓度为15-25％，盆底生物修补材料与混合水溶液的比例为1:2-1:10，浸泡时间为30-120min。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在脱脂步骤中，乙醇的浓度为90-100%，盆底生物修补材料与乙醇的比例为1:2-1:10，常温浸泡时间为0.5-12h。

10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在脱细胞、去DNA和去α-Gal抗原步骤中：

混合水溶液中胰蛋白酶和EDTA的浓度分别为0.01-0.10％和0.01- 0.05%，盆底生物修补材料与胰蛋白酶/EDTA溶液的比例为1:2-1:10，超声条件下，于36±2℃条件下浸泡15-40min；

含DNA酶的水溶液中DNA酶的含量为0.05-10U/ml，盆底生物修补材料与含DNA酶的水溶液的比例为1:2-1:10，浸泡温度为36±2℃，浸泡时间为15-40min；

含α-半乳糖苷酶的水溶液中α-半乳糖苷酶的含量为0.05-10U/ml，盆底生物修补材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:2-1:10，浸泡温度为20-37℃，浸泡时间为15-40min；

NaOH水溶液的浓度为5-40mM，盆底生物修补材料与NaOH溶液的比例为1:5-1:50，常温浸泡时间为20-60min。