CN109364252A - 抑制ifn-i至arg1诱导通路在制备抗肿瘤药物组合物中的应用 - Google Patents
抑制ifn-i至arg1诱导通路在制备抗肿瘤药物组合物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了抑制肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN‑I至ARG1诱导通路在制备IFN‑I抗实体肿瘤药物组合物中的用途。ARG1蛋白(Arginase 1，精氨酸酶‑1)催化精氨酸分解代谢的关键步骤，其在肿瘤微环境中的表达具有促肿瘤的作用。而本发明相关研究揭示，在IFN‑I抗实体肿瘤疗法模型中，IFN‑I信号会在肿瘤相关单核/巨噬细胞中意外地强烈诱导ARG1表达。因此，IFN‑I至ARG1诱导通路将会影响IFN‑I抗实体肿瘤疗法的效果。本发明通过抑制IFN‑I至ARG1诱导通路，可以消除此负面效果，大大提升IFN‑I的抗实体肿瘤疗效，应用在制备IFN‑I抗实体肿瘤药物组合物中与IFN‑I一起具有抗肿瘤协同作用。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤疾病治疗领域。具体地，涉及抑制肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路在制备IFN-I抗实体肿瘤药物组合物中的应用。
背景技术
I型干扰素(IFN-I)是先天免疫***受特定病原或危险相关分子模式诱导而由细胞生成的一个细胞因子家族(主要包括多个IFNα及IFNβ)，具有强大的抗病毒、抗增殖和免疫调节功能。
IFN-I通过IFN-I受体来激活Jak1/Tyk2。在经典的IFN-I信号通路中，Jak1/Tyk2又主要通过激活称为ISGF3的STAT1/STAT2/IRF9转录因子复合物来诱导大量的干扰素刺激基因(ISGs)表达，从而介导IFN-I的生物学功能。
人们长期以来都意识到IFN-I的抗肿瘤活性。这种活性由IFN对肿瘤的内在和外在调控所介导。重要的是，在防御实体肿瘤中，IFN-I对抗肿瘤的先天免疫***及适应性免疫***的增强起起非常重要的作用。重组IFN-I已被批准用于治疗几种源于实体肿瘤的癌症，如黑色素瘤皮肤癌、肾癌及卡波西肉瘤；并曾广泛应用于包括肺癌、荷尔蒙抗性***癌、头颈癌、鼻咽癌等实体瘤的临床实验中。最近，也有人通过使用可显著诱导IFN-I产生的TLR激动剂(如TLR3激动剂poly(I:C)等)，在包括晚期胃癌、膀胱癌及恶性胶质瘤等癌症临床试验中得到了积极的效果。
尽管IFN-I在多数情况下具有的抗肿瘤活性，也有数据显示，在某些情况下，治疗所伴随的IFN-I信号具有促进肿瘤发展的作用。另外，在应用IFN-I的癌症治疗中，较大的副作用也常常限制对其使用更高的抗肿瘤剂量。这种现象可能来自于肿瘤相关免疫细胞类型的复杂性，它们对IFN-I的细胞特异性响应可能未得到最佳的整合。
肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在实体肿瘤中大量存在。它们在促进血管生成、肿瘤生长和转移以及抑制适应性抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。它们在肿瘤中的比重通常与癌症患者的不良预后相关。巨噬细胞是一类可以针对不同环境刺激，而展现多种功能状态的细胞。早年的研究粗略地将巨噬细胞功能状态分为免疫激活的M1型、与免疫抑制的M2型。近年来的研究发现，肿瘤微环境对TAMs的表型和功能特征有很强的塑造作用；其表型也远比M1/M2的二相化模型复杂，在不同的肿瘤中、甚至在同一肿瘤中都有很大的差异。此外，除了巨噬细胞外，肿瘤还含有来源于循环***的单核细胞，这些单核细胞不仅是TAMs的主要前体，而且本身也对肿瘤微环境信号产生有力的响应。这一细胞谱系中的显著异质性也为精准靶向这些细胞的促肿瘤功能带来挑战。需要重点指出的是，人们在实验中也发现各种肿瘤治疗手段会影响肿瘤相关的单核细胞/巨噬细胞，这种调控对决定治疗的效果发挥了复杂而显著的作用。因此，结合上面介绍的IFN-I抗实体瘤治疗仍有待优化的需求，本发明研究了IFN-I治疗如何影响肿瘤相关单核/巨噬细胞。
ARG1蛋白(Arginase 1，精氨酸酶-1)催化精氨酸分解代谢的关键步骤。ARG1在M2巨噬细胞中被强烈诱导。它被发现在肿瘤相关巨噬细胞及其他肿瘤微环境的髓系细胞中有较高的表达，可通过增进肿瘤生长及抑制抗肿瘤免疫***等行使促肿瘤的作用。在一个利用TLR3激活剂poly(I:C)诱导IFN-I及实体肿瘤治疗的模型中我们首次发现，poly(I:C)诱导的IFN-I作用于肿瘤中正在分化的单核细胞，通过一条非经典的信号通路，致使ARG1的强烈上调，从而减弱了IFN-I的抗肿瘤作用。这揭示了基于IFN-I的治疗方案中可能产生的一种反作用机制。目前没有报道任何靶向到该信号通路的肿瘤治疗方法，本发明由此提出通过抑制肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路，来消除这种反作用机制，从而提升IFN-I的抗实体肿瘤疗效。
发明内容
本发明提供了一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包含肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂，IFN-I重组蛋白或能够促进IFN-I表达的物质，药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施例中，所述能够促进IFN-I表达的物质为TLR3激动剂。
在一个实施例中，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为ARG1蛋白活性抑制剂。
在一个实施例中，所述ARG1蛋白抑制剂为nor-NOHA。
在一个实施例中，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为M-CSF或CSF1R信号阻断剂。
在一个实施例中，所述M-CSF或CSF1R信号阻断剂为GW2580。
在一个实施例中，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为STAT3抑制剂。
在一个实施例中，所述STAT3抑制剂为Stattic。
所述抗肿瘤药物组合物适用的肿瘤包括肺癌、黑色素瘤皮肤癌、肾癌、荷尔蒙抗性***癌、胃癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈癌或鼻咽癌。
本发明还提供了抑制肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路在制备IFN-I抗实体肿瘤药物组合物中的应用。
在一个实施例中，所述药物组合物可包含IFN-I重组蛋白或能够促进IFN-I表达的物质，IFN-I至ARG1诱导通路抑制、阻断试剂，药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，所述能够促进IFN-I表达的物质可为TLR3激动剂poly(I:C)。
在上述实施例中，抑制、阻断IFN-I至ARG1诱导通路的物质可选自：ARG1蛋白(精氨酸酶)抑制剂，M-CSF/CSF1R信号阻断剂(包括CSF1R受体活性小分子抑制剂、抗M-CSF的中和性抗体、抗CSF1R的阻断性抗体)，及STAT3抑制剂。
进一步地，所述ARG1蛋白抑制剂可为nor-NOHA；
所述M-CSF或CSF1R信号阻断剂可为GW2580；
所述STAT3抑制剂可为Stattic。
所述应用适用的肿瘤包括肺癌、黑色素瘤皮肤癌、肾癌、荷尔蒙抗性***癌、胃癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈癌、或鼻咽癌等。
本发明一方面通过体外及小鼠体内实验揭示了poly(I:C)诱导的IFN-I作用于肿瘤浸润的单核细胞，导致了由这些细胞分化而来的肿瘤相关巨噬细胞中ARG1(精氨酸酶-1)基因/蛋白表达的强烈的诱导。
另一方面，本发明证实了抑制肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路可明显提升IFN-I的抗肿瘤效应，应用在制备IFN-I抗实体肿瘤药物组合物中与IFN-I一起具有抗肿瘤协同作用。
如图4所示。(A)中显示了IFN-I对实体肿瘤的两方面影响。图的右半边代表人们通常了解的IFN-I对抗肿瘤免疫的激活效应(以数字“1”表示)；而图的左半边代表我们的实验发现(由阴影部分着重显示)。在这部分效应中，IFN-I在分化的单核细胞中，通过激活STAT3信号通路，后者协同肿瘤微环境中常富集的M-CSF所诱导的信号，共同导致这些单核细胞的“分化重编”，使之随后成为ARG1高表达的肿瘤相关巨噬细胞。这些巨噬细胞中高表达的ARG1具有免疫抑制效应。因此，左边阴影部分的通路对IFN-I同时导致的免疫激活效应起反作用。我们用数字“2”表示抑制IFN-I至ARG1诱导通路的方案。(B)中体现使用上述“1”与“2”的组合，我们将可以显著提升IFN-I抗实体瘤的效果。
附图说明
图1为TLR3激动剂poly(I:C)诱导产生的IFN-I信号在肿瘤相关单核/巨噬细胞中对ARG1(精氨酸酶-1)的诱导情况。
图2为poly(I:C)和ARG1(精氨酸酶)活性抑制剂对小鼠的协同抗肿瘤作用。
图3为STAT3抑制剂或M-CSF/CSF1R信号抑制剂对IFN-I至ARG1诱导通路的抑制情况，以及M-CSF/CSF1R信号抑制剂对poly(I:C)的抗肿瘤加强效果。
图4为本发明组合物抗肿瘤协同作用的原理示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1.IFN-I信号在肿瘤相关单核/巨噬细胞中导致ARG1(精氨酸酶-1)的强烈诱导。
实验材料：
6-8周龄C57/BL6小鼠(购自南京大学-南京生物医药研究院，NJU-NBRI)；骨髓来源单核细胞、骨髓来源巨噬细胞(自上述小鼠骨髓提取、或提取后在分化培养基中继续分化而来)；健康人血单个核细胞(血液来自南京市鼓楼医院，经被采血人知情同意；血样用于进一步提取单个核细胞)；免疫磁珠法小鼠单核细胞提取试剂盒(购自Miltenyi Biotec，130-100-629)；离心法分离骨髓单个核细胞试剂Histopaque-1077(购自Sigma)；M-CSF(人源与小鼠源重组蛋白均购自PeproTech)；重组小鼠IFNβ(购自PBL)；重组人源IFNα(购自生工生物)；基因芯片(Agilent SurePrint G3Mouse Gene Expression Microarray 8x60K，由上海伯豪生物技术有限公司开展销售及样品服务)；RNA提取试剂RNAiso Plus及HiScript反转录试剂盒(购自Vazyme)；
定量PCR分析引物信息：
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mouse Nos2-正向：GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA(SEQ ID NO.11)；
mouse Nos2-反向：GTGGACGGGTCGATGTCAC(SEQ ID NO.12)；
mouse Tnfa-正向：CCCTCACACTCAGATCATCTTCT(SEQ ID NO.13)；
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mouse Ccl2-正向：GGCTCAGCCAGATGCAGTTAA(SEQ ID NO.15)；
mouse Ccl2-反向：CCTACTCATTGGGATCATCTTGCT(SEQ ID NO.16)；
mouse Il1b-正向：GCAACTGTTCCTGAACTCAACT(SEQ ID NO.17)；
mouse Il1b-反向：ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT(SEQ ID NO.18)；
mouse Mx1-正向：GACCATAGGGGTCTTGACCAA(SEQ ID NO.19)；
mouse Mx1-反向：AGACTTGCTCTTTCTGAAAAGCC(SEQ ID NO.20)；
mouse Isg15-正向：CAATGGCCTGGGACCTAAA(SEQ ID NO.21)；
mouse Isg15-反向：CTTCTTCAGTTCTGACACCGTCAT(SEQ ID NO.22)；
mouse Gapdh-正向：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT(SEQ ID NO.23)；
mouse Gapdh-反向：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA(SEQ ID NO.24)；
mouse Hprt-正向：TCAGTCAACGGGGGACATAAA(SEQ ID NO.25)；
mouse Hprt-反向：GGGGCTGTACTGCTTAACCAG(SEQ ID NO.26)；
human ARG1-正向：ACGGAAGAATCAGCCTGGTG(SEQ ID NO.27)；
human ARG1-反向：GTCCACGTCTCTCAAGCCAA(SEQ ID NO.28)；
human GAPDH-正向：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT(SEQ ID NO.29)；
human GAPDH-反向：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA(SEQ ID NO.30)；
human HPRT-正向：TATGGCGACCCGCAGCCCT(SEQ ID NO.31)；
human HPRT-反向：CATCTCGAGCAAGACGTTCAG(SEQ ID NO.32)。
实验用抗体信息(ARG1：Cell Signaling Technology(#93668)；STAT1:生工生物(#AB55186)；Actin：金斯瑞(#A00730)；阻断性IFN-I受体抗体：Biolegend(#127302)；免疫荧光用ARG1抗体：BD(#610708)；带荧光标签F4/80抗体：Biolegend(#123131))。
小鼠接种肺癌细胞系(LLC细胞，Lewis lung carcinoma，由ATCC提供)；Poly(I:C)(购自InvivoGen)。
实验方法：
用Miltenyi Biotec磁珠试剂盒(130-100-629)分选小鼠骨髓单核细胞。分离小鼠大腿骨及胫骨，剪开两头。用针筒及26G针头抽取4℃的含0.5％BSA和2mM EDTA的PBS(pH7.2)将骨髓细胞冲出并混成细胞均匀混悬状态。将细胞滤过40微米的尼龙网后，将细胞在300x g下离心，取沉淀。将细胞用上述缓冲液混匀，进行细胞计数。取175微升含5x107细胞的混悬液，加入25微升试剂盒中的FcR阻断抗体混合。加入50微升试剂盒中的MonocyteBiotin-Antibody Cocktail(分离单核细胞的生物素连接抗体组合)，并混匀。在4℃下孵育5分钟。将细胞用缓冲液洗一次，重悬于400微升缓冲液，加入100微升结合生物素的磁珠，并混匀。细胞在4℃下孵育10分钟。在对细胞进行MACS分离前，将MACS柱子置于MACSseparator(分离器)的磁场下，并用3ml缓冲液洗柱子一次。将细胞加入MACS柱子进行分离，取流出柱子的细胞组分(主要为单核细胞)。分三次用3ml缓冲液洗柱子，也搜集流出的组分，与先前流出的组分合并。
离心法分离小鼠骨髓单个核细胞或人外周血单个核细胞。小鼠骨髓细胞的提取遵循上面的方法。随后，1只小鼠骨髓来源细胞被重悬至3ml RPMI640培养基，随后轻轻放至在已置于15ml离心管中的3ml Histopaque-77溶液的上层。该离心管被在室温、400x g下离心30分钟，骨髓单个核细胞将沉降在培养基及Histopaque-77之间，形成一个非透明层。用吸管吸除培养基层后，可再用吸管小心吸出单个核细胞层至一新离心管。细胞再经培养基洗两次后，即可获得骨髓单个核细胞悬浮液。分离人外周血单个核细胞的方法非常类似，3ml抗凝后的血样液被轻轻放至3ml已置于15ml离心管中的Histopaque-77的上层。类似的，400x g室温30分钟离心后，外周血单个核细胞沉降至中间层，可被吸出/富集。
培养小鼠与人单核/巨噬细胞。小鼠骨髓来源单个核细胞或利用MACS分选的单核细胞被重悬在RPMI-1640+10％FBS的培养基中。随后，将细胞以1x106/ml的密度铺至培养皿中，培液中同时添加20ng/ml的重组小鼠M-CSF。在一些培养组中，铺细胞时同时添加了100U/ml终浓度的重组小鼠IFNβ。这些前体细胞在37℃5％CO2的培养箱中培养1-3天后，细胞被收集。小鼠成熟巨噬细胞的培养初始条件与上述一致。前体细胞在20ng/ml的M-CSF存在条件下培养7天。为了测量成熟巨噬细胞对IFN-I的响应，这些分化后的细胞在被换上新鲜含M-CSF的培养基后，再被加入100U/ml的重组小鼠IFNβ后培养2-3天被收集。人外周血单个核细胞在分离后，以1x 106细胞/ml铺入含40ng/ml重组人源M-CSF±IFNα的培养液中。细胞在分化大约5天后被收集。
体外培养的小鼠肺癌细胞系LLC被消化、收集、计数。1x 106个LLC肿瘤细胞被皮下种植在C57/BL6鼠身上的背部侧面，形成荷瘤小鼠。小鼠的肿瘤体积被有时间规律性地利用游标卡尺测量。小鼠肿瘤的体积被用肿瘤直径3x 0.5的公式计算。
利用Poly(I:C)对荷瘤小鼠开展治疗。由InvivoGen公司购买的Poly(I:C)被溶于生理盐水，浓度为1mg/ml。小鼠一般在被皮下种植肿瘤后6天(体重约18-20g，肿瘤体积达到约45mm3)，被在腹腔中注射以生理盐水(对照)或7.5mg/kg剂量的poly(I:C)。7.5mg/kg的剂量为poly(I:C)使用的一个具体实例。在实验中，poly(I:C)用量在5mg/kg到8mg/kg区间时，均产生肿瘤抑制效应，且效应随浓度增高而增加。Poly(I:C)的注射每两天开展一次。实验在第4次注射poly(I:C)后两天结束。在对肿瘤开始治疗前，及治疗后每两天，肿瘤的大小都被测量。实验结束后，小鼠被安乐死，皮下的肿瘤被解剖出，先被称重，随后进行蛋白质/RNA样品的收集。
利用肿瘤切碎后上清对骨髓单个核细胞的处理。在收集肿瘤提取上清的实验中，接种后的肿瘤在小鼠体内长到第9天(比第6天显著增大，利于切碎后取上清)，小鼠被腹腔注射以7.5mg/kg的poly(I:C)或生理盐水。12小时后，肿瘤被收集。收集后的肿瘤先被称重，被剪成小块后转入1.5ml离心管中。随后继续用手术剪刀剪约40下，至无明显块状物存在。随后，根据肿瘤称重，以10ml/g肿瘤的体积加入RPMI-1640+10％FBS的培养基混匀，并合并同处理组的肿瘤样品。合并后的细胞悬浮液以300x g进行5分钟离心。离心后的上清再经0.45μM的滤膜过滤。过滤后的上清与RPMI-1640+10％FBS以1：1体积混合后，作为培养液加入到刚刚从小鼠骨髓提取的单个核细胞上。这些单个核细胞在被继续培养一段时间后被收集。
实验结果及讨论：
图1A为研究IFN-I调控肿瘤相关单核/巨噬细胞的体外模型示意图。肿瘤细胞及微环境其他组分通常会大量生成M-CSF，作为吸引单核细胞浸润肿瘤及刺激其向巨噬细胞分化的重要驱动。因此，我们在体外对受M-CSF分化信号驱动的骨髓来源单核细胞进行了IFN-I(重组IFNβ或IFNα)的处理。该模型模拟在基于IFN-I的治疗过程中，浸润肿瘤的单核细胞在发生分化的同时接受IFN-I的调控。具体来说，将免疫磁珠法纯化的小鼠骨髓单核细胞分别在M-CSF和M-CSF+IFNβ环境下培养60h，然后进行基因表达芯片分析(M-CSF:20ng/ml,IFNβ:100U/ml)。图1B为经基因芯片分析表达改变倍数最大的一些基因列表(Arg1(精氨酸酶1)基因上升倍数在所有基因中排最高，被突出显示)。由于ARG1显著的免疫抑制功能，常产生免疫刺激效应的IFN-I在我们实验中对Arg1的强烈诱导显得引人注目。图1C显示了利用定量PCR法对IFNβ在M-CSF驱动分化的骨髓单个核细胞中诱导Arg1mRNA的时间梯度分析(M-CSF:20ng/ml,IFNβ:100U/ml)。结果显示，经典IFN-I下游基因(如Irf7所示)在IFNβ处理后24小时达到高点并在48小时有所下降；而Arg1的表达在IFNβ处理48小时后，相比24小时有很大程度的上升。因此，IFN-I在分化单核细胞中对Arg1的强烈诱导需要较长的时间体现。图1D利用与芯片分析实验同样处理的骨髓单核细胞中提取的RNA，对包括Arg1在内的一些基因的表达进行了定量qPCR的测试。Arg1mRNA的上调程度远高于其他一些也受IFN-I调控的免疫抑制(左)及免疫激活(右)的基因。图1E为利用已成熟的小鼠骨髓来源巨噬细胞做的对照。这些细胞经由M-CSF±IFNβ处理2.5天。与处于分化状态下的单核细胞截然不同，IFN-I未在这些细胞中上调Arg1mRNA，说明IFN-I至ARG1诱导通路限于在分化状态下的单核细胞中被启动。而多数前人有关IFN-I功能的研究可能主要利用了成熟后的巨噬细胞，导致过去未曾有研究者发现IFN-I诱导Arg1的现象。图1F为经免疫磁珠法纯化的小鼠骨髓单核细胞分别在M-CSF和M-CSF+IFNβ环境下培养60h后(与图1B条件一致)，对这些细胞的蛋白提取物的蛋白质印迹分析结果。ARG1蛋白也发生了显著的上调。图1G是为了证实上述IFN-I至ARG1诱导通路同时也适用于人来源的分化单核细胞。为此，健康人的外周血单个核细胞在M-CSF(40ng/mL)±hIFNα(500单位/毫升)培养约5天，样品经由定量PCR进行了分析。与小鼠细胞结果类似，ARG1的mRNA水平同样也发生了强烈诱导。为了在IFN-I治疗模型的肿瘤微环境中观察肿瘤相关单核/巨噬细胞所受的调控，C57/BL6小鼠被接种了同种属来源的肺癌细胞系LLC。在接种6天后，小鼠每两天被腹腔注射一次常用于诱导IFN-I的物质，TLR3激动剂poly(I:C)。在接种14天后，对照及poly(I:C)注射组的肿瘤、肺和肝脏组织被收集。图1H统计了对照与poly(I:C)组肿瘤的称重，显示poly(I:C)注射起到了一定抗肿瘤的效果。图1I展示了对照及poly(I:C)组肿瘤及正常组织中的ARG1蛋白水平。ARG1在肿瘤组织、而非正常组织中的表达得到了显著上调。为了证实poly(I:C)通过诱导IFN-I导致肿瘤相关单核/巨噬细胞中ARG1上调，我们利用切碎肿瘤组织的上清液刺激了小鼠骨髓单个核细胞。具体的，荷瘤小鼠(第9天)经对照或poly(I:C)处理12小时后，肿瘤被收获。肿瘤组织被切碎后的上清液被(1：1)加入骨髓单个核细胞的培养液中。培养液中同时加入对照或者IFN-I受体阻断抗体(10微克/ml)。由于这样的肿瘤上清中富含M-CSF，它本身可驱动单核细胞向巨噬细胞的分化。这样培养、分化48小时后，单核/巨噬细胞被收获。我们随后进行了定量PCR分析，测定了Arg1和及其他几个经典IFN-I下游基因的mRNA水平。图1J显示，相比对照组，poly(I:C)注射组的切碎肿瘤上清可以在骨髓单核细胞中显著上调Arg1表达；且该活性可以从很大程度上被IFN-I受体阻断抗体所抑制。这些结果证实利用poly(I:C)进行肿瘤治疗时，肿瘤微环境中产生的IFN-I可在分化状态下的单核细胞中上调Arg1表达。为了进一步确立在poly(I:C)处理下肿瘤组织中高表达ARG1蛋白的细胞构成，我们对接种后第14天的对照或poly(I:C)组的肿瘤切片进行了ARG1及巨噬细胞记号物F4/80的同时免疫荧光染色分析。图1K显示，相比对照组肿瘤，只有在poly(I:C)组，ARG1几乎在所有的F4/80阳性巨噬细胞中均有高表达(右上、右中图箭头所示)。图1K上、中、下三排的深色信号分别代表对照或poly(I:C)组的同一切片中的ARG1，F4/80或细胞核荧光染色(DAPI)信号。由于肿瘤中巨噬细胞多由循环来源的单核细胞所分化而来，图中ARG1与巨噬细胞记号物F4/80的共定位提示poly(I:C)诱导产生的IFN-I作用于肿瘤中的单核细胞，并导致由单核细胞分化成为的巨噬细胞中高表达ARG1。
实施例2.poly(I:C)和精氨酸酶抑制剂对小鼠具有协同抗肿瘤作用。
实验材料：
6-8周龄C57/BL6小鼠(购自南京大学-南京生物医药研究院，NJU-NBRI)；小鼠接种肺癌细胞系(LLC细胞，Lewis lung carcinoma，由ATCC提供)；Poly(I:C)(购自InvivoGen)；ARG1(精氨酸酶)活性抑制剂(购自Cayman(#10006861))；RNA提取试剂RNAiso Plus及HiScript反转录试剂盒(购自Vazyme)。
定量PCR分析引物信息：
mouse Ifng-正向：ATGAACGCTACACACTGCATC(SEQ ID NO.33)；
mouseIfng-反向：CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC(SEQ ID NO.34)；
mouseGzmb-正向：CCACTCTCGACCCTACATGG(SEQ ID NO.35)；
mouseGzmb-反向：GGCCCCCAAAGTGACATTTATT(SEQ ID NO.36)；
mousePrf1-正向：AGCACAAGTTCGTGCCAGG(SEQ ID NO.37)；
mousePrf1-反向：GCGTCTCTCATTAGGGAGTTTTT(SEQ ID NO.38)；
mouseCd3e-正向：ATGCGGTGGAACACTTTCTGG(SEQ ID NO.39)；
mouseCd3e-反向：GCACGTCAACTCTACACTGGT(SEQ ID NO.40)；
mouseCd8a-正向：CCGTTGACCCGCTTTCTGT(SEQ ID NO.41)；
mouseCd8a-反向：CGGCGTCCATTTTCTTTGGAA(SEQ ID NO.42)；
mouseIsg15-正向：CAATGGCCTGGGACCTAAA(SEQ ID NO.43)；
mouseIsg15-反向：CTTCTTCAGTTCTGACACCGTCAT(SEQ ID NO.44)；
mouseGapdh-正向：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT(SEQ ID NO.45)；
mouseGapdh-反向：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA(SEQ ID NO.46)；
mouseHprt-正向：TCAGTCAACGGGGGACATAAA(SEQ ID NO.47)；
mouseHprt-反向：GGGGCTGTACTGCTTAACCAG(SEQ ID NO.48)。
蛋白质印迹用抗体信息(ARG1：Cell Signaling Technology(#93668)；CSF1R:Cell Signaling Technology(#3152)；Actin：金斯瑞(#A00730)；GAPDH:Santa Cruz(#sc-32233))。
实验方法：
LLC肿瘤的种植及poly(I:C)联合精氨酸酶抑制剂的治疗。体外培养的小鼠肺癌细胞系LLC被消化、收集、计数。1x 106个LLC肿瘤细胞被皮下种植在C57/BL6鼠身上的背部侧面，形成荷瘤小鼠。小鼠的肿瘤体积被有时间规律性地利用游标卡尺测量。小鼠肿瘤的体积被用肿瘤直径3x 0.5的公式计算。小鼠在被皮下种植肿瘤后6天(体重约18-20g，肿瘤体积达到约45mm3)，被在腹腔中注射以生理盐水(对照)或7.5mg/kg剂量的poly(I:C)。同时，有的小鼠也被以40mg/kg的剂量注***氨酸酶抑制剂Nor-NOHA。这里的Nor-NOHA浓度仅为一个具体实例。在实验中，Nor-NOHA在用量处于20mg/kg到80mg/kg区间时，与poly(I:C)的协同抗肿瘤效应随Nor-NOHA浓度增加而增加。Poly(I:C)的注射每2天开展一次，而Nor-NOHA的注射每天开展一次。测量肿瘤大小的实验在第4次注射poly(I:C)后两天结束(共第14天)。实验结束后，小鼠被安乐死，皮下的肿瘤被解剖出，随后进行蛋白质样品的收集。在观察poly(I:C)及Nor-NOHA对肿瘤T细胞效应的实验中，小鼠在接种后第6天开始，进行了2次poly(I:C)和/或3次Nor-NOHA的注射。实验在接种后总第9天结束，肿瘤组织随后被收集，留作RNA样品分析。
实验结果与讨论：
图2A显示荷瘤小鼠经poly(I:C)±精氨酸酶抑制剂(nor-NOHA)(40毫克/公斤)处理8天。肿瘤体积(误差条代表标准方差(SD)，n＝12，总第14天肿瘤大小差异经学生t测试分析，p值于图中标注，或者“**”：P＜0.01)。图2B显示上述肿瘤发展与治疗模型开始(第0天)及结束(第14天)时小鼠的体重测量(误差条代表SD)。不同处理组小鼠并未出现显著体重差异。图2C显示肿瘤和肝脏蛋白质样本中ARG1，CSF1R等的水平，证实精氨酸酶抑制剂同时可以阻断poly(I:C)引起的肿瘤组织ARG1蛋白的上调这一现象。为了探讨poly(I:C)和精氨酸酶抑制剂的协同抗肿瘤作用，我们收集了对照、poly(I:C)或精氨酸酶抑制剂单独处理、以及2试剂共同处理3天后的肿瘤组织。图2D显示在poly(I:C)与精氨酸酶抑制剂协同处理的肿瘤中，T细胞的普遍性记号物(代表数量)及激活程度的记号物的mRNA水平(经由qPCR方法测量)均相比对照或单独药品处理组具有显著的提升。这些实验说明poly(I:C)经由IFN-I导致的肿瘤相关单核/巨噬细胞中ARG1的上调，通过影响T细胞介导的抗肿瘤免疫，从很大程度上限制了IFN-I的抗肿瘤效应。而对IFN-I至ARG1诱导通路的抑制能够去除这种反作用，提高IFN-I治疗实体肿瘤的效果。
实施例3.IFN-I至ARG1诱导通路经STAT3信号介导，并由单核细胞的M-CSF/CSF1R信号所促进。
实验材料：
6-8周龄C57/BL6小鼠(购自南京大学-南京生物医药研究院，NJU-NBRI)；
骨髓来源单核细胞(自上述小鼠骨髓提取)；离心法分离骨髓单个核细胞试剂Histopaque-1077(购自Sigma)；重组小鼠M-CSF(购自PeproTech)；重组小鼠IFNβ(购自PBL)；RNA提取试剂RNAiso Plus及HiScript反转录试剂盒(购自Vazyme)。
定量PCR分析引物信息：
mouse Arg1-正向：AACACTCCCCTGACAACCAG(SEQ ID NO.49)；
mouse Arg1-反向：GCAAGCCAATGTACACGATG(SEQ ID NO.50)；
mouse Irf7-正向：CACAGATCTTCAAGGCCTGGGC(SEQ ID NO.51)；
mouse Irf7-反向：CTGTGGAGTGCACAGCGGAAGT(SEQ ID NO.52)；
mouse Emr1-正向：CCCCAGTGTCCTTACAGAGTG(SEQ ID NO.53)；
mouse Emr1-反向：GTGCCCAGAGTGGATGTCT(SEQ ID NO.54)；
mouse Isg15-正向：CAATGGCCTGGGACCTAAA(SEQ ID NO.55)；
mouse Isg15-反向：CTTCTTCAGTTCTGACACCGTCAT(SEQ ID NO.56)；
mouse Gapdh-正向：AGGGCTGCTTTTAACTCTGGT(SEQ ID NO.57)；
mouse Gapdh-反向：CCCCACTTGATTTTGGAGGGA(SEQ ID NO.58)；
mouse Hprt-正向：TCAGTCAACGGGGGACATAAA(SEQ ID NO.59)；
mouse Hprt-反向：GGGGCTGTACTGCTTAACCAG(SEQ ID NO.60)。
实验方法：
分离、培养小鼠骨髓单个核细胞。1只小鼠骨髓来源细胞被重悬至3ml RPMI640培养基，随后轻轻放至在已置于15ml离心管中的3ml Histopaque-77溶液的上层。该离心管被在室温、400x g下离心30分钟，骨髓单个核细胞将沉降在培养基及Histopaque-77之间，形成一个非透明层。用吸管吸除培养基层后，可再用吸管小心吸出单个核细胞层至一新离心管。细胞再经培养基洗两次后，即可获得骨髓单个核细胞悬浮液。小鼠骨髓单个核细胞被重悬在RPMI-1640+10％FBS的培养基中。随后，将细胞以1x106/ml的密度铺至培养皿中，培液中同时添加20ng/ml的重组小鼠M-CSF。在一些培养组中，铺细胞时同时添加了100U/ml终浓度的重组小鼠IFNβ。另外，有些培养组中还添加了终浓度为5μM的STAT3特异性的抑制剂Stattic。在研究不同浓度M-CSF对IFN-I效应的影响时，M-CSF在不同培养组也使用了从5ng/ml到20ng/ml不等的终浓度。细胞因子、药品加入完毕后，这些前体细胞在37℃5％CO2的培养箱中培养1-3天后，细胞被收集。。
LLC肿瘤的种植及poly(I:C)联合CSF1R抑制剂的治疗。体外培养的小鼠肺癌细胞系LLC被消化、收集、计数。1x 106个LLC肿瘤细胞被皮下种植在C57/BL6鼠身上的背部侧面，形成荷瘤小鼠。小鼠的肿瘤体积被有时间规律性地利用游标卡尺测量。小鼠肿瘤的体积被用肿瘤直径3x 0.5的公式计算。小鼠在被皮下种植肿瘤后6天(体重约18-20g，肿瘤体积达到约45mm3)，被在腹腔中注射以生理盐水(对照)或7.5mg/kg剂量的poly(I:C)。随后，GW2580被添加至小鼠的饮用水中。在饮用水中的配置浓度以小鼠每日进水量计算，可按小鼠体重达到40mg/kg。此GW2580用量仅为一个具体实例。在实验中，使用GW2580从20mg/kg到80mg/kg的浓度区间时，它与poly(I:C)抑制肿瘤生长的叠加效应随GW2580剂量增加而增加。Poly(I:C)的注射每两天开展一次，而含GW2580的饮用水则每天换新一次。实验在第4次注射poly(I:C)后两天结束(共第14天)。实验结束后，小鼠被安乐死，皮下的肿瘤被解剖出，随后进行蛋白质/RNA样品的收集。
实验结果与讨论：
图3A显示小鼠骨髓单个核细胞经由M-CSF±IFNβ处理24或48小时后，由蛋白质印迹法进行的蛋白样品分析。可以看到，IFNβ的处理在这些细胞中导致了较为长效的STAT3的Y705位的磷酸化(激活)。图3B显示骨髓单个核细胞在M-CSF±干扰素±Stattic(5微摩/升)下培养60h。Stattic是STAT3的抑制剂。我们对上述处理细胞中获得的RNA样本进行了定量PCR法分析。结果证实STAT3抑制剂可以显著在M-CSF诱导分化的单核细胞中抑制IFN-I至Arg1的诱导通路。相反，Isg15作为一个经典的IFN-I下游靶向，它的mRNA诱导则没有受STAT3抑制剂的影响。这些结果证实IFN-I至Arg1的诱导通路由STAT3依赖性的非经典IFN-I信号通路所介导。图3C为同样实验的蛋白质样品的西方印记法分析，证实Stattic对STAT3磷酸化的抑制，以及对IFN-I诱导ARG1蛋白的抑制。随后，基于IFN-I对ARG1的强烈上调在时程上似乎伴随着单核细胞向成熟巨噬细胞的转变(图1C，图1K)，我们进一步研究了驱动巨噬细胞成熟的M-CSF/CSF1R信号对IFN-I至ARG1诱导通路的影响。图3D显示了不同浓度的M-CSF对IFNβ在骨髓单个核细胞中诱导Arg1表达量的影响。随着M-CSF浓度的提高，IFNβ对Arg1诱导的程度也随之显著上调，说明M-CSF/CSF1R信号对IFN-I至ARG1诱导通路的促进作用。图3E显示了对这些细胞的蛋白质样品的西方印记分析。证实IFNβ对ARG1蛋白的诱导也随着M-CSF浓度的提高而增高。结果同时也显示，STAT3的Y705位磷酸化(激活)并未随M-CSF浓度的提高而增高，提示M-CSF在单核细胞中通过与STAT3Y705磷酸化平行的信号通路促进IFN-I至ARG1诱导通路。为了在体内肿瘤模型中说明M-CSF信号对IFN-I至ARG1诱导通路的影响，荷瘤小鼠在接种6天后进行poly(I:C)处理时又辅以±CSF1R抑制剂GW2580的处理(药物溶于饮水，40mg/kg)。我们在对荷瘤小鼠进行了8天处理后收集了肿瘤，并对蛋白质和RNA样本都被进行了分析。图3F的上半部分显示了在poly(I:C)与CSF1R抑制剂的共处理组肿瘤的ARG1蛋白表达相比poly(I:C)单处理组有明显降低；而该图的下半部分利用巨噬细胞标记物F4/80(Emr1)的mRNA水平证实了CSF1R抑制剂的效应(降低肿瘤相关巨噬细胞占比)。图3G通过对肿瘤组织mRNA的进一步分析，证实CSF1R抑制剂处理降低了poly(I:C)对肿瘤Arg1mRNA的诱导，而未影响一个经典IFN-I信号的靶基因Irf7。图3H展示了同样的实验中肿瘤大小随时间的改变(误差条代表标准方差(SD),n＝12)。实验结束时的肿瘤大小值经过了t检验分析(N.S.:无数据学差异，*****P＜1x10-5，******P＜1x10-6)。结果显示，虽然单独使用CSF1R抑制剂并未对LLC肿瘤生长起明显影响，该抑制剂与poly(I:C)的联用加强了poly(I:C)抑制肿瘤的效果。这些结果证实，抑制可以促进IFN-I至ARG1诱导通路的M-CSF/CSF1R信号也可以明显提升IFN-I治疗实体瘤的效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 南京大学
<120> 抑制IFN-I至ARG1诱导通路在制备抗肿瘤药物组合物中的应用
<130> F1805067
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacactcccc tgacaaccag 20
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gctcttactg actggcatga g 21
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caatggcctg ggacctaaa 19
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cttcttcagt tctgacaccg tcat 24
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acggaagaat cagcctggtg 20
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ggggctgtac tgcttaacca g 21
Claims (10)
1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包含肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂，IFN-I重组蛋白或能够促进IFN-I表达的物质，药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为ARG1蛋白活性抑制剂。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述能够促进IFN-I表达的物质为TLR3激动剂。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述ARG1蛋白抑制剂为nor-NOHA。
5.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为M-CSF或CSF1R信号阻断剂。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述M-CSF或CSF1R信号阻断剂为GW2580。
7.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂为STAT3抑制剂。
8.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、黑色素瘤皮肤癌、肾癌、荷尔蒙抗性***癌、胃癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、头颈癌或鼻咽癌。
9.肿瘤相关单核/巨噬细胞中IFN-I至ARG1诱导通路的抑制剂和/或阻断剂在制备IFN-I抗实体肿瘤药物组合物中的应用。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包含IFN-I重组蛋白或能够促进IFN-I表达的物质，IFN-I至ARG1诱导通路抑制剂和/或阻断剂，药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂。
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