CN109355329A - 一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法。所述预处理方法具体是取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5‑1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；将固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料，然后加入其重量10～30％的纤维素酶和pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合均匀在水浴锅内反应后，离心处理收集上清液过滤得到还原糖溶液。本发明中的方法其还原糖得率可达345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％，大大提高了烟杆的利用率。
Description
技术领域
本发明属于生物炼制技术，具体是一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法。
背景技术
烟草是世界上最重要的非食用经济作物之一，为各国广泛种植。烟叶是烟草工业的主要原料，在烟叶采收后，往往剩余大量烟杆。据估计，全球每年在烟草种植中产生的烟杆可达2.6亿吨以上。这些烟杆即不能作为农用燃料，焚烧后又污染大气，只能堆积在田间地头自然腐烂，严重污染环境。
近年来，环境友好的生物炼制技术逐渐成为木质纤维素类农林废弃物资源化利用的发展趋势。该过程通常利用纤维素酶和微生物将木屑、秸秆等废弃物转化为糖、乙醇、乳酸等生物基产品。还原糖是于烟草加工过程中的比较重要辅料，通常应用于美拉德反应、香料提取等等方面。因此，如果利用生物炼制技术将烟杆转化为还原糖，不仅有助于实现废弃物资源的高值化利用，又能为烟草企业提供廉价的辅料来源，这对提高烟草行业资源化循环利用水平无疑具有重要的意义。
然而，目前利用烟杆进行生物炼制的研究并不多见，其瓶颈在于木质纤维素结构对纤维素酶解的高抗性导致极低的生物转化效率。近年来，研究者们发现预处理技术可以有效降低木质纤维素转化抗性、提高转化效率。常用的预处理方法包括酸预处理、碱预处理、蒸汽***预处理、超压临界水预处理和高压湿氧化预处理等。通常不同原料所适用的预处理方式和条件并不相同，如农业秸秆废弃物更适用于酸、碱等化学预处理方式。因此，选择适当的预处理技术和处理条件将有望提高烟杆生物转化效率，实现烟杆的高效生物炼制。
发明内容
本发明根据现有技术的不足，提供一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，该方法通过对烟杆进行特殊的预处理，使其能够实现高效的生物炼制，利用废弃的烟杆作为生物炼制的原料，生产用于烟草加工中的还原糖，大大提高了烟杆的利用率，节约了生产成本。
本发明提供的技术方案：所述一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)原料的预处理
a.取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；
b.将步骤a中的固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料；
(2)取步骤(1)中经过预处理后的烟杆原料，加入其重量10～30％的纤维素酶，并加入pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合均匀；其中烟杆原料与醋酸纳缓冲溶液的质量比为1:20～1:50；
(3)将步骤(2)中的混合物置于40℃～60℃水浴锅内反应60～84h后，并在转速为9500～11000rpm的条件下离心4～7min，收集上清液并过滤去除大分子物质得到还原糖溶液。
本发明较优的技术方案：所述烟草原料的预处理具体步骤如下：
a取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
b将步骤a中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
本发明较优的技术方案：所述步骤(3)中上清液收集后采用孔径为0.22μm的滤膜过滤去除溶液中的大分子物质得到还原糖溶液。
本发明较优的技术方案：所述烟草原料的预处理的步骤a中在加入NaOH溶液之前，先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒5～30天后，将其在50～60℃的烘箱中烘烤1～3天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
本发明较优的技术方案：所述烟草原料的预处理的步骤b中的固液混合物在加热处理之前，先在40～75℃的条件恒温浸泡0.5～24小时。
本发明较优的技术方案：所述烟草原料的预处理的步骤b中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料。
本发明通过对烟杆进行碱预处理，使烟杆能够作为生物炼制的原料制备还原糖，其制备的还原糖可以作为烟草加工和烟用原料提取中，提高了废弃烟杆的利用率，节约了烟草生产的成本；且本发明中的生产方法，其还原糖的转化率可高达345.06mg/g，其转化率高。
附图说明
图1是实验3中化学预处理对烟杆酶解糖化转化的影响对比图；
图2是实验4中碱预处理温度对烟杆酶解糖化的影响对比图；
图3是实验5中碱预处理时间和氢氧化钠浓度对烟杆酶解糖化的影响对比。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进一步说明。
实施例1所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)烟杆原料的预处理：
a.取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒10天后，将其在50℃的烘箱中烘烤2天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入5L反应器中，按照固液比1:5的比例加入浓度为4％的NaOH溶液；
b.将步骤(1)中的固液混合物在40～75℃的条件恒温浸泡3小时，然后加热至80℃预处理70min，加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料A。
(2)取预处理得到烟杆原料A置于容器中，并加入其重量30倍的浓度50mM pH4.8的醋酸纳缓冲溶液和烟杆原料重量30％的纤维素酶搅拌均匀；
(3)将三角瓶置于50℃水浴锅内反应72h后，并在10000rpm离心5min，收集上清液，用孔径为0.22μm的膜进行过滤，纯化得到还原糖溶液。
实施例2：一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)烟杆原料的预处理：
a.取新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒20天后，将其在55℃的烘箱中烘烤2天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入10L反应器中，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
b.将步骤(1)中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料B。
(2)取烟杆原料B置于250ml三角瓶中，并加入其重量15倍的浓度50mM、pH4.8的醋酸纳缓冲溶液和其重量15％的纤维素酶搅拌均匀；
(3)将三角瓶置于55℃水浴锅内反应80h后，并在10000rpm离心5min，收集上清液，用孔径为0.22μm的膜进行过滤，纯化得到还原糖溶液。
实施例3：一种提高烟杆生物转化效率的预处理方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)烟杆原料的预处理：
a.先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒30天后，将其在60℃的烘箱中烘烤1天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入8L反应器中，按照固液比1:20的比例加入浓度为0.5％的NaOH溶液；
b.将步骤(1)中的固液混合物在40℃的条件恒温浸泡0.5小时，加热至90℃的水浴锅中处理60min，加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料C。
(2)取2.5g预处理得到烟杆原料C置于250ml三角瓶中，并加入100mL浓度50mMpH4.8的醋酸纳缓冲溶液和0.5g纤维素酶搅拌均匀；
(3)将三角瓶置于50℃水浴锅内反应72h后，并在10000rpm离心5min，收集上清液，用孔径为0.22μm的膜进行过滤，纯化得到还原糖溶液。
利用DNS法测定三个实施例得到的未经过滤的上清液的还原糖浓度，并与未处理的烟杆原料糖化后的还原糖得率进行对比，具体如表1所示：
表1为三个实施例中处理后的烟杆原料与未处理的烟杆原料还原糖得率的对比
| 还原糖得率(mg/g) | |
| 实施例1 | 320.85 |
| 实施例2 | 319.90 |
| 实施例3 | 345.06 |
| 未处理的烟杆原料 | 129.85 |
通过表1中的数据可以看出，本申请中的方法对烟杆进行处理后其还原糖得率相比未处理的烟杆得率高出很多。
对比试验1：申请人针对烟杆与其它纤维原料的纤维素、半纤维素、木质素和灰分含量进行研究对比。
(1)原料。烟杆采自湖北恩施，采收时间为2009年6月；稻草秸秆、玉米秸秆和木屑由华中科技大学生命科学与技术学院环境资源微生物研究所提供。
(2)试剂。氢氧化钠、硫酸、酒石酸钾钠、重结晶酚、3,5-二硝基水杨酸、硫酸、十六烷基三甲基溴化铵、乙二胺四乙酸二钠、四硼酸钠、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇***、亚硫酸氢纳、醋酸和醋酸钠(AR，国药集团化学试剂有限公司)。
(3)标样。葡萄糖、木糖、***糖、半乳糖、甘露糖、纤维二糖、乙醇、EDTA钙钠(纯度均大于99％，Sigma公司)。
(4)菌株和酶。纤维素酶(Sigma公司)，总纤维素酶活力为100FPU/g；葡萄酒高活性干酵母(宜昌安琪酵母股份有限公司)。
(5)仪器。金燕HH-S28S数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；TG-332A微量分析天平(上海天平仪器厂)；UV2000紫外-可见光分光光度计(尤尼柯仪器有限公司)；小型台式控温摇床(北京迪索仪器有限公司)；HN101-2型电热鼓风干燥箱(南通沪南科学仪器有限公司)；SRJX-2-9型马福炉(湖北英山国营无线电元件厂)；YX－450A型压力蒸气灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪，配备G1362A型示差折光检测器(美国Agilent公司)。
(6)具体实验方法：分别将烟杆、稻草秸秆、玉米秸秆和木屑晒干、粉碎后，取20—40目，得到平均直径为0.3mm的固体粉末，置于60℃烘箱内72h干燥备用；然后对各个原料的木质纤维素组分的化学分析，其中烟杆、稻草秸秆、玉米秸秆和木屑的纤维素、半纤维素、木质素和灰分含量按照美国分析化学家协会(AOAC)标准方法测定；烟杆半纤维素的糖组成按照美国可再生能源实验室标准方法测定，其测定结果如表2所示：
表2烟杆和几种常见农林废弃物化学组成的比较
表2显示了烟杆的化学组成，并与玉米杆、稻草杆和木屑等几种常用于生物炼制的农林废弃物原料进行比较。结果表明，与农业秸秆相比，烟杆的纤维素含量较高，达到40％左右，仅略低于木屑中的纤维素含量；而烟杆中的木质素含量则与秸秆相似，远低于木屑中的木质素含量。烟杆的半纤维素含量也与秸秆相似，均在20％左右。此外，烟杆中灰分含量较高，这与秸秆类似。半纤维素是由戊糖和己糖构成的低分子量聚合物，通过高效液相分析发现，烟杆半纤维素的主要成分为木糖，另含有少量的***糖。纤维素的是由β-1，4糖苷键所连接而成的葡聚糖大分子，是纤维素酶解和乙醇转化的反应底物，纤维素含量越高，则所获得的转化产物越多。在木质纤维素大分子中，木质素和半纤维素通常与纤维素交联在一起，构成致密的结构，阻碍了纤维素酶对纤维素底物的吸附，从而影响生物转化的效率。通常，木质素含量低的原料生物转化越容易。与其它用于生物炼制的农林废弃物相比，烟杆具有类似秸秆的低木质素含量，但又具有类似木屑的高纤维素含量，因此是一种较有潜力的生物炼制原料。
对比实验2：将实施例3中的酶解液用0.22μm过滤器过滤后，利用高效液相色谱仪测定酶解糖的组成，同时针对未进行预处理的烟杆的酶解液的组成采用相同的方法进行测定，进行比较；其中高效液相色谱仪的条件为：色谱柱：Sugar-pak-1钙型阳离子交换柱(美国Waters公司)，流动相：0.05g/L EDTA钙钠溶液,流速：0.5mL/min，柱温：80℃，示差折光检测器。比较结果具体如表3所示：
表3酶解液的糖组成分析
结果表明，葡萄糖在烟杆酶解液中的含量最高，主要来源于纤维素的水解。预处理显著提升了葡萄糖的含量，较未处理烟杆提高了463％。在未处理烟杆的酶解液中，两种来源于半纤维素的单糖——木糖和***糖的含量相似。预处理后，烟杆酶解液中木糖含量显著上升，仅次于葡萄糖含量，但***糖却没有检测到，这可能是预处理过程中***糖与氢氧化钠发生反应，溶解在碱液中的结果。解液中的葡萄糖可以作为烟用糖加以利用，而木糖则可作为保润剂木糖醇的生产原料。此外，预处理烟杆的酶解液中还含有少量的纤维二糖，这可能是纤维素不完全酶解所导致的。在纤维素酶解过程中，纤维素先由纤维素内切酶和纤维素外切酶水解为纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶水解为葡萄糖，但葡萄糖对β-葡萄糖苷酶具有产物抑制作用，因此导致纤维二糖的部分累积。
本申请的发明人针对化学预处理的条件对烟杆糖化处理的还原糖得率的影响进行了研究，并做了以下具体的对比试验
对比实验3：化学预处理方法的比较
分别用1％NaOH与1％H2SO4试剂按1:10的固液比在90℃水浴锅中处理烟杆30min，水洗过滤至中性，所得的纤维质残渣于60℃烘干后，按照实施例3中的方法制备还原糖，并利用DNS法针对糖化处理后未进行纯化的上清液中还原糖含量进行测定，其测定结果如图1所示。
图1显示了经1％稀酸和稀碱溶液预处理30min后烟杆酶解的还原糖得率。正如所预料的，未经预处理烟杆具有较高的木质素和半纤维素含量，因此对纤维素酶解具有很高的抗性，所以还原糖得率都很低，为129.85mg/g，碱预处理后两者均显著提升，还原糖得率提高115％。
与酸预处理相比，碱预处理对烟杆生物转化的还原糖得率的提升较为显著。研究表明，酸预处理通过水解木质纤维素中的半纤维素，破坏木质纤维素的致密结构并增加其多孔性，从而增强酶转化效率；而碱处理主要是通过碱的去木质化作用去除部分木质素，并断裂木质素和半纤维素之间的连键，同时部分半纤维素与碱发生“剥皮反应”，溶解在碱液中，从而增强纤维素酶和纤维素底物的亲和力。酸处理对木质素没有很大的影响，但由于半纤维素的水解，往往导致处理后基质木质素含量显著上升。尽管半纤维素和木质素对木质纤维素的生物炼制都会产生阻碍作用，但对于烟杆而言，木质素对生物转化的影响可能较半纤维素更加显著，酸处理后木质素含量的上升反而对其转化有负面作用。因此，稀碱处理较酸处理更适合增强烟杆的生物转化。
对比实验4：碱预处理温度对烟杆糖化转化率的影响。
分别用1％NaOH试剂按1:10固液比于30、60、90、120、150℃处理烟杆60min后，水洗过滤至中性，纤维质残渣于60℃烘干后，按照实施例3中的方法制备还原糖，并测定其糖得率，具体如图2所示。其中100℃以上的预处理在压力蒸气灭菌锅中进行，100℃以下的预处理在水浴锅中进行。
如图2所示，碱反应温度的提升会增强预处理的效果，烟杆酶解的还原糖得率随着反应温度的增加而逐渐提升，当反应温度超过100℃时逐渐趋于稳定，由于反应温度超过100℃时需要高温高压的预处理设备，无疑增加了处理成本。
对比实验5：碱浓度和预处理时间对烟杆糖化转化率的影响。
分别用0.25、5、1、2％NaOH试剂按1:10固液比于90℃处理烟杆15、30、45、60、90min，水洗过滤至中性，纤维质残渣于60℃烘干，按照实施例3中的方法制备还原糖，并测定其得糖率，具体如图3所示。
如图3所示，在相同的氢氧化钠浓度下，还原糖得率随着预处理时间的延长而逐渐增加，当预处理时间达到60min后，还原糖得率达到峰值，进一步延长预处理时间，得率并没有明显的变化，甚至有少许下降。氢氧化钠浓度对烟杆还原糖得率有显著的影响，预处理过程中的氢氧化钠浓度越高，预处理后烟杆酶解所得到的还原糖也越多。当氢氧化钠浓度为2％、预处理时间为60min时，烟杆酶解的还原糖得率最高，达到345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％。
本发明中的方法，可以大大提高烟杆糖化处理的得糖率，其酶解糖化的还原糖得率可达345.06mg/g，较未处理烟杆提高165.74％，大大提高了废弃烟杆的利用率。
Claims (6)
1.一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)原料的预处理
a.取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:5-1:30的比例加入浓度为0.2％～5％的NaOH溶液；
b.将步骤a中的固液混合物在80℃～90℃的水浴锅中处理30min～120min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料；
(2)取步骤(1)中经过预处理后的烟杆原料，加入其重量10～30％的纤维素酶，并加入pH为4.8、浓度为50mmol/L的醋酸纳缓冲溶液混合均匀；其中烟杆原料与醋酸纳缓冲溶液的质量比为1:20～1:50；
(3)将步骤(2)中的混合物置于40℃～60℃水浴锅内反应60～84h后，并在转速为9500～11000rpm的条件下离心4～7min，收集上清液过滤去除大分子物质得到还原糖溶液。
2.根据权利要求1所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于所述烟草原料的预处理具体步骤如下：
a取去烟叶后的新鲜烟杆，晾晒烘干后切碎后，按照固液比1:10的比例加入浓度为2％的NaOH溶液；
b将步骤a中的固液混合物在90℃的水浴锅中处理60min，并进行水洗过滤至中性，收集处理后的纤维质残渣于50～60℃条件下烘干得到预处理后的烟杆原料。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于：所述步骤(3)中上清液收集后采用孔径为0.22μm的滤膜过滤去除溶液中的大分子物质得到还原糖溶液。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于:所述烟草原料的预处理的步骤a中在加入NaOH溶液之前，先将新鲜烟杆用自然水清洗掉表面的浮尘和杂质，于室外自然晾晒5～30天后，将其在50～60℃的烘箱中烘烤1～3天，随后将其取出冷却至室温，并用粉碎机将其切碎至0.5～5cm长度的小段后放入1-10L反应器中。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于：所述烟草原料的预处理的步骤b中的固液混合物在加热处理之前，先在40～75℃的条件恒温浸泡0.5～24小时。
6.根据权利要求1或2所述的一种利用烟杆作为生物炼制原料制备还原糖的方法，其特征在于：所述烟草原料的预处理的步骤b中的加热处理后的固液混合物趁热转移至抽滤器中进行抽滤，抽滤完成后再加入固定液混合物体积2～10倍的蒸馏水进行水洗，直至洗出液用pH试纸检测为pH＝7，然后收集经过水洗至中性的纤维质残渣，在烘箱中于50～60℃条件下烘烤1～4天得到预处理后的烟杆原料。
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