CN109349678B - 一种复合烟叶提取物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种复合烟叶提取物的制备方法及其应用，采用晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠复合生物材料为固定化载体，吸附微生物产香菌株，温育水解发酵复合晾晒烟叶原料，再结合连续逆流超声提取技术，制备复合烟叶提取物，具有天然烟草浓郁本香，带有清新果香、酒香、奶香、烤肉香、烤面包香和烤乳酪香等丰富自然复合香气，刺激性减小，香料品质提高，纯化分离步骤简单，工艺条件温和，提取率和生产效率提高；在传统卷烟、新型加热不燃烧卷烟中应用，与烟香协调、风格统一，增加烟气浓度、提高满足感，丰富烟香，刺激性降低，口感改善。
Description
技术领域
本发明涉及烟用添加剂领域，具体涉及一种复合烟叶提取物的制备方法及其应用。
背景技术
烟用添加剂为改善烟草理化性能的助剂，包括香料香精、保润剂、助燃剂、防霉剂和吸附剂。低焦油卷烟的生产更需要加香加料以弥补烟香的不足。烟制品加香加料的目的在于掩盖天然烟草的刺激性和杂气等，并提高或改善其香味。天然香料因其天然性、安全性和自然复合的香气，更迎合消费者对健康的需求，但仍然具有提取效率较低、溶剂残留多、杂质含量高、纯度较低、纯化步骤复杂导致成本高，有些因特征香气显著，会导致外加香气掩盖烟香等缺陷。
生物产香技术是利用微生物工程、酶工程、细胞培养、基因改造等生物技术，通过微生物代谢出特定香气成分，从而提升产品质量的一门新技术。在生物产香技术制备天然香料的过程中，多采用悬浮微生物发酵，这种方式同样存在天然浸膏和提取物类香料产品得率低下、产品质量不稳定、纯化步骤复杂、成本高等缺陷，严重阻碍了生物产香天然香料的应用推广。
晒红烟，光泽鲜明，油分充足，总糖含量平均为3.30％，还原糖含量平均为2.76％，低于晒黄烟，高于白肋烟和马里兰烟。总氮含量平均为3.52％，烟碱含量平均为4.31％，均高于晒黄烟和烤烟。主要用于混合型卷烟、雪茄烟原料。
晒黄烟，在外形、化学成分、烟气和吃味均与烤烟相似。晒黄烟色泽鲜明，品质好的晒黄烟油分充足、弹性好。晒黄烟中含有5～18％的糖分，包括葡萄糖、果糖、半乳糖等，总氮含量在1.5～3.64％，烟碱含量在1.29～5.45％，蛋白质含量在7.83～16.84％之间。晒黄烟叶可用作烟用香料的原料，其提取物可以增加卷烟香气风味，是一种具有烟草本香物质的天然香料。
白肋烟是混合型卷烟和雪茄烟叶组配方的主要原料，有总氮和烟碱高，糖的含量低，劲头大，刺激性大，香气不明显，香气量不足的缺陷。
而将晾晒烟作为烟用提取物原料，采用常规、普通的烟草提取物制备方法，通常提取香味物质的同时，还带有对卷烟吸味不利的蛋白质、鞣质、淀粉、果胶、纤维素、木质素及其他大分子物质，增香的同时也具有增加刺激性、杂气和残留感的缺陷。
目前有专利“一种用于新型烟草的晒黄烟提取物的制备方法”(住专利号ZL201610988163.4)将晒黄烟水提液与复合氨基酸反应的美拉德反应液，进行精馏，应用于新型烟草；专利“一种烟用固定化生物添加剂及其制备方法及其应用”(专利号ZL200410040095.6)采用海藻酸钠或环糊精固定化复合酶来醇化烟叶，提高烟叶品质；专利“一种固定化蜗牛酶制备烟草浸膏的方法”(专利号ZL201610509691.7)通过磁流体悬浮液-海藻酸钠固定化蜗牛酶，酶解烟叶并辅以桂花精油来提高浸膏细腻度，制得烟草浸膏等公开报道。但是通过烟杆、玉米芯、米糠复合生物吸附材料来固定微生物菌株，温育水解发酵复合烟叶，结合连续逆流超声提取技术，得到复合烟叶吸附发酵提取物，并在传统和新型加热不燃烧卷烟中应用，尚未见相关报道。
发明内容
根据上述不足，本发明的目的是提供一种复合烟叶提取物的制备方法及其应用，采用晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠复合生物材料为固定化载体，吸附微生物产香菌株，温育水解发酵复合晾晒烟叶原料，再结合连续逆流超声提取技术，制备复合烟叶提取物，具有天然烟草浓郁本香，带有清新果香、酒香、奶香、烤肉香、烤面包香和烤乳酪香等丰富自然复合香气，刺激性减小，香料品质提高，纯化分离步骤简单，工艺条件温和，提取率和生产效率提高；在传统卷烟、新型加热不燃烧卷烟中应用，与烟香协调、风格统一，增加烟气浓度、提高满足感，丰富烟香，刺激性降低，口感改善。
本发明通过以下技术方案实现：
一种复合烟叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料前处理：复合烟叶经粉碎机粉碎至40目～120目粉末；
(2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4的活性固体冻干菌粉，加入到5～20倍质量的灭菌处理的质量浓度为5～30％葡萄糖或果糖溶液中，置于35～50℃水浴锅活化30～60min，得到微生物菌株活化液，其中所述的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4保藏号为CCTCC NO：M 2012005，分类命名为植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4，2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
(3)固定化载体制备：将晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠洗净烘干，将烟杆和玉米芯处理成碎块，与米糠混合，高压灭菌后烘干，得到混合固定化载体；
(4)微生物菌株的固定化处理：将一定量上述步骤(3)灭菌烘干后的混合固定化载体，装入微孔滤袋后，放入容器，按照固定化载体与微生物菌株活化液质量比为1:1～10，加入已培养好的活化液，放置于4±0.5℃冷藏柜固定12～36h，得到固定化微生物菌株；
(5)复合烟叶发酵：将步骤(1)所得复合烟叶粉末与5～15倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述装有固定化微生物菌株的载体的微孔滤袋，其中微生物菌株-载体与复合烟叶粉末质量比为1:0.5～2，在温度为35～55℃，匀速搅拌，添加苹果酸调节pH值为4.0～6.0，发酵1～6d，微孔过滤复合烟叶残渣，保留复合烟叶发酵液A；
(6)连续逆流超声提取：将步骤(5)过滤所得复合烟叶残渣，按速率0.1～1.0kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度60～100℃，料液比为质量比1:2～6，从浸出舱低端运行0.2～1h后调节出液阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达30～60min时，投料加入一定比例的氢氧化钙、复合氨基酸，当连续逆流超声提取共达90～150min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
(7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得到复合烟叶提取液。
进一步的，还包括步骤(8)：将所述复合烟叶提取液经真空冷冻干燥得到复合烟叶提取物。
进一步的，所述步骤(1)中的复合烟叶为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的混合物，质量比为1:0.5～1:0.5～2。
进一步的，所述步骤(2)中的葡萄糖、果糖为食品级；活性固体冻干菌粉为食品级，活性为10～30u/mg。
进一步的，所述步骤(3)中晾晒烟烟杆为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的烟杆的混合物，三者质量比为1:0.5～1:0.5～2，晾晒烟烟杆和玉米芯的碎块为用剪刀剪成约1cm长的小块，晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠之间的质量比为1:0.5～2：0.5～2。
进一步的，所述步骤(5)中苹果酸为食品级，匀速搅拌的转速为20～80rpm。
进一步的，所述步骤(6)中使用的氢氧化钙为分析纯，占复合烟叶质量的0.1～1％，所述复合氨基酸为吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸、异亮氨酸，食品级，占复合烟叶质量的0.5～1.5％，三者之间的质量比为1:0.5～2:0.5～2。
本发明还提供一种上述方法制备的复合烟叶提取液在传统卷烟配方烟丝加料中的应用，按0.01～0.08％烟丝的质量比的复合烟叶提取液和糖分、水混匀，喷洒到制丝加料罐中，按正常卷烟工艺加工成配方烟丝，具有协调卷烟香气，劲头和浓度增加，刺激性降低，带有清新果香、酒香、奶香和烤肉香。
本发明还提供一种上述方法制备的复合烟叶提取物在新型加热不燃烧卷烟烟丝中加香的应用，将该复合烟叶提取物溶解到70％乙醇溶液中，稀释1000倍，按与烟丝0.01～0.1％的质量比加香，卷烟香气浓郁醇厚、浓度增加、满足感提高，带有清新果香、酒香、奶香和烤面包香气。
本发明还提供一种上述方法制备的复合烟叶提取液在新型加热不燃烧卷烟再造烟叶中的应用，将该复合烟叶提取液按0.01～0.7％再造烟叶原料的质量比，添加到加热不燃烧卷烟再造烟叶涂布液中应用，增加新型卷烟的烟香和提高满足感，香气丰富，带有清新果香、酒香和烤乳酪香，口感改善。
本发明提供的复合烟叶提取物，(1)采用晾晒烟杆、玉米芯碎块和米糠作为微生物菌株吸附固定化的复合生物载体，其中晾晒烟杆是烟草本源物质，含有的纤维素吸附作用强，玉米芯的纤维底物吸附性能强、含有大量木糖成分，米糠含有半纤维素、膳食纤维、高量维生素、富含氨基酸，三者按一定比例混合后，其协同作用下吸附微生物菌株效率高、不易解吸，后期与发酵物液过滤分离容易；(2)本发明的复合烟叶为晒黄烟、晒红烟、白肋烟的一定比例混合烟叶，糖、氮占比更为合理，含糖量提高，经发酵、提取后的特征刺激性气息相比单独烟叶发酵提取物减少；复合烟叶粉末溶解在水中，与吸附在晾晒烟的烟杆、玉米芯碎块和米糠上的微生物菌株的复杂酶体系进行酸性条件下的温育水解发酵过程中，扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)具有产淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、酸性蛋白酶等特性，能够高效降解复合烟叶粉末细胞壁中及游离的纤维素、淀粉、纤维二糖、蔗糖等大分子物质，转化为葡萄糖，并进一步转化为酯香为主的香味物质和乙醇，增加清新酒香，将非挥发性糖苷转化成挥发性的香气物质，产香产酯除杂味，破坏细胞壁更多地释放细胞中的活性化学物质，提高产率和增加香气自然复杂性；植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4具有产β-半乳糖苷酶活性转化非挥发性糖苷为挥发性香气物质、转化细胞壁和游离阿魏酸合成天然香兰素的能力，能分解利用葡萄糖、蔗糖、鼠李糖、麦芽糖、松二糖、海藻糖等糖类物质产醇、酯、酸等香气成分，使复合烟叶提取液中带有香兰素及其香味前体物质等奶香气成分，并破坏细胞壁释放更多有效成分，提高提取率。两种活性菌株发酵构成的复杂酶活力体系，协同强效联合作用，更好地转化非挥发性糖苷为挥发性香气成分，更有效地分解细胞壁中的纤维素、纤维二糖、阿魏酸释放胞内活性成分，降解多糖类物质为挥发性致香小分子成分，且能将部分葡萄糖转化为乙醇，释放到发酵液中，形成发酵液自然复合丰富的清新果香、酒香、奶香，经简单过滤即可与带有微生物菌株的固定化载体分离，步骤简单；(3)再结合连续逆流超声溶剂提取复合烟叶物料残渣，工艺条件温和、缩短生产时间、提高生产效率、降低成本，生产过程中添加氢氧化钙进一步吸附提取液中残留的影响吸味的杂质如鞣质成分，添加复合氨基酸与复合烟叶提取液中的还原糖，在逆流加热条件下充分进行美拉德增色增香反应，进一步增香减杂。总的来说，使得杂质大分子成分包括蛋白质、纤维素、多糖、淀粉等分解、转化为香味物质，杂质杂味减少，刺激性降低，香气种类自然复杂性增加，香气品质提高，赋予复合烟叶提取液/物具有天然烟草浓郁本香的同时，还带有自然复合香气包括清新果香、酒香、奶香、烤肉香、烤面包香和烤乳酪香；生产工艺条件温和、步骤简单、易操作、成效高、成本低，杂质少，香料品质提升，粉末状易运输、贮存、不易变质，液状可直接加料应用减少稀释、混匀步骤；在传统卷烟配方烟叶和新型加热不燃烧烟草中的应用，与烟气协调、风格一致，增强烟草本香、提高满足感、降低刺激性，增加烟香丰富性，带有奶香、清新果香、酒香、烤肉香、烤面包香和烤乳酪香气，工艺条件温和易实现，操作步骤简单。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1
一种复合烟叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料前处理：复合烟叶经粉碎机粉碎至40目粉末，复合烟叶为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的混合物，质量比为1:1:2。
(2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4的活性固体冻干菌粉(食品级，活性为10u/mg)，加入到5倍质量的灭菌处理的质量浓度为5％果糖(食品级)溶液中，置于35℃水浴锅活化30min，得到微生物菌株活化液，其中所述的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4保藏号为CCTCC M 2012005，2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
(3)固定化载体制备：将晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠(晾晒烟烟杆为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的烟杆的混合物，三者质量比为1:0.6:1.2，晾晒烟烟杆和玉米芯的碎块为用剪刀剪成约1cm长的小块)洗净烘干，将烟杆和玉米芯处理成碎块，与米糠混合，晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠之间的质量比为1:2:1，高压灭菌后烘干，得到固定化载体；
(4)微生物菌株的固定化处理：将一定量上述步骤(3)灭菌烘干后的混合固定化载体，装入微孔滤袋后，放入容器，按照固定化载体与微生物菌株活化液质量比为1:1，加入已培养好的活化液，放置于4±0.5℃冷藏柜固定12h，得到固定化微生物菌株；
(5)复合烟叶发酵：将步骤(1)所得复合烟叶粉末与5倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述装有固定化微生物菌株的载体的微孔滤袋，其中微生物菌株-载体与复合烟叶粉末质量比为1:0.5，在温度为35℃，20rpm匀速搅拌，添加苹果酸(食品级)调节pH值为4.0，发酵1d，微孔过滤复合烟叶残渣，保留复合烟叶发酵液A；
(6)连续逆流超声提取：将步骤(5)过滤所得复合烟叶残渣，按速率0.1kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度60℃，料液比为质量比1:2，从浸出舱低端运行0.2h后调节出液阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达30min时，投料加入一定比例的氢氧化钙(分析纯，占复合烟叶质量0.1％)、复合氨基酸(吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸、异亮氨酸，食品级，占复合烟叶质量的0.5％，三者之间的质量比为1:0.5:0.5)，当连续逆流超声提取共达90min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
(7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得到复合烟叶提取液。
将上述制备的复合烟叶提取液在传统卷烟配方烟丝加料中应用，按0.01％烟丝的质量比的提取液和糖分、水混匀，喷洒到制丝加料罐中，按正常卷烟工艺加工成配方烟丝，具有协调卷烟香气，劲头和浓度增加，刺激性降低，带有清新果香、酒香、奶香、烤面包香和烤肉香。
实施例2
一种复合烟叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料前处理：复合烟叶经粉碎机粉碎至80目粉末，复合烟叶为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的混合物，质量比为1:1.2:1.2；
(2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4的活性固体冻干菌粉(食品级，活性为15u/mg)，加入到12倍质量的灭菌处理的质量浓度为12％葡萄糖(食品级)溶液中，置于42℃水浴锅活化45min，得到微生物菌株活化液，其中所述的植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)VP4-4保藏号为CCTCC M 2012005，2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
(3)固定化载体制备：将晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠洗净烘干，晾晒烟烟杆为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的烟杆的混合物，三者质量比为1:0.5:2，将烟杆和玉米芯处理成约1cm长的碎块，与米糠混合，晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠之间的质量比为1:2:2，高压灭菌后烘干，得到混合固定化载体；
(4)微生物菌株的固定化处理：将一定量上述步骤(3)灭菌烘干后的混合固定化载体，装入微孔滤袋后，放入容器，按照固定化载体与微生物菌株活化液质量比为1:5，加入已培养好的活化液，放置于4±0.5℃冷藏柜固定12～36h，得到固定化微生物菌株；
(5)复合烟叶的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得复合烟叶粉末与5～15倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述装有固定化微生物菌株的载体的微孔滤袋，其中微生物菌株-载体与复合烟叶粉末质量比为1:1.2，在温度为45℃，匀速搅拌，添加苹果酸(食品级)调节pH值为5.0，发酵3.5d，微孔过滤复合烟叶残渣，保留复合烟叶发酵液A；
(6)连续逆流超声提取：将步骤(5)过滤所得复合烟叶残渣，按速率5.0kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度80℃，料液比为质量比1:4，从浸出舱低端运行0.6h后调节出液阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达50min时，投料加入氢氧化钙(分析纯，占复合烟叶质量0.5％)、复合氨基酸(吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸、异亮氨酸，食品级，占复合烟叶质量的1.0％，三者之间的质量比为1:0.8:1.6)，当连续逆流超声提取共达120min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
(7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得到复合烟叶提取液。
(8)将所述复合烟叶提取液经真空冷冻干燥得到复合烟叶提取物。
将上述方法制备的复合烟叶提取物在新型加热不燃烧卷烟烟丝中加香应用：将该复合烟叶提取物溶解到70％乙醇溶液中，稀释1000倍，按与烟丝0.01％的质量比加香，赋予新型卷烟浓郁醇厚香气、浓度增加、满足感提高，香气丰富，带有清新果香、酒香、奶香和烤乳酪香气。
实施例3
一种复合烟叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)原料前处理：复合烟叶经粉碎机粉碎至120目粉末,复合烟叶为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的混合物，质量比为1:1:0.5；
(2)微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)和植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4的活性固体冻干菌粉(食品级，活性30u/mg)，加入到20倍质量的灭菌处理的质量浓度为30％葡萄糖(食品级)溶液中，置于50℃水浴锅活化60min，得到微生物菌株活化液，其中所述的植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4保藏号为CCTCC M 2012005，2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
(3)固定化载体制备：将晾晒烟烟杆(晾晒烟烟杆为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的烟杆的混合物，三者质量比为1:1:1.8)、玉米芯、米糠洗净烘干，将烟杆和玉米芯处理成约1cm长的碎块，与米糠混合，晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠之间的质量比为1:0.5:2，高压灭菌后烘干，得到混合固定化载体；
(4)微生物菌株的固定化处理：将一定量上述步骤(3)灭菌烘干后的混合固定化载体，装入微孔滤袋后，放入容器，按照固定化载体与微生物菌株活化液质量比为1:10，加入已培养好的活化液，放置于4±0.5℃冷藏柜固定36h，得到固定化微生物菌株；
(5)复合烟叶的吸附固定化发酵：将步骤(1)所得复合烟叶粉末与15倍质量的水混合均匀，加入步骤(4)所述装有固定化微生物菌株的载体的微孔滤袋，其中微生物菌株-载体与复合烟叶粉末质量比为1:2，在温度为55℃，80rpm匀速搅拌，添加苹果酸(食品级)调节pH值为6.0，发酵6d，微孔过滤复合烟叶残渣，保留复合烟叶发酵液A；
(6)连续逆流超声提取：将步骤(5)过滤所得复合烟叶残渣，按速率1.0kg/10min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度100℃，料液比为质量比1:6，从浸出舱低端运行1h后调节出液阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达60min时，投料加入氢氧化钙(分析纯，占复合烟叶质量1％)、复合氨基酸(吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸、异亮氨酸，食品级，占复合烟叶质量的1.5％，三者之间的质量比为1:2:0.6)，当连续逆流超声提取共达150min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
(7)将步骤(5)的发酵液A和步骤(6)的浸出液B合并，得到复合烟叶提取液。
(8)将上述步骤(7)复合烟叶提取液经真空冷冻干燥得到复合烟叶提取物，易存贮运输。
将上述方法制备的复合烟叶提取液在新型加热不燃烧卷烟再造烟叶中应用：将该复合烟叶提取液按0.7％再造烟叶原料的质量比，添加到加热不燃烧卷烟再造烟叶涂布液中应用，增加新型卷烟的烟香和提高满足感，香气丰富，带有清新果香、酒香和烤肉香。
试验例1：应用的感官效果对比评价
将实施例1-3吸附发酵制备的晒黄烟提取物与空白对照，在传统烟丝和新型加热不燃烧卷烟中分别进行感官评价对比实验。
结果表明(如表1所示)：本发明吸附发酵制备的晒黄烟提取物在传统卷烟和新型加热不燃烧卷烟中的应用，与烟气协调、保持卷烟风格一致，增强烟草本香、提高满足感，烟香舒适，带有奶香、水果酸香、烘烤香气和回甜感，刺激性降低，口感改善。
表1.马里兰烟叶发酵提取物在卷烟中的感官评价
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种复合烟叶提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）原料前处理：复合烟叶经粉碎机粉碎至40目~120目粉末；
（2）微生物菌株的活化：将扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）VP4-4的活性固体冻干菌粉，加入到5~20倍质量的灭菌处理的质量浓度为5~30%葡萄糖或果糖溶液中，置于35~50℃水浴锅活化30~60 min，得到微生物菌株活化液，其中所述的植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）VP4-4保藏号为CCTCCNO： M 2012005，分类命名为植生拉乌尔菌（Raoultella planticola）VP4-4，2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
（3）固定化载体制备：将晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠洗净烘干，将烟杆和玉米芯处理成碎块，与米糠混合，高压灭菌后烘干，得到混合固定化载体；
（4）微生物菌株的固定化处理：将一定量上述步骤（3）灭菌烘干后的混合固定化载体，装入微孔滤袋后，放入容器，按照固定化载体与微生物菌株活化液质量比为1:1~10，加入已培养好的活化液，放置于4±0.5℃冷藏柜固定12~36 h，得到固定化微生物菌株；
（5）复合烟叶发酵：将步骤（1）所得复合烟叶粉末与5~15倍质量的水混合均匀，加入步骤（4）装有固定化微生物菌株的载体的微孔滤袋，其中固定化微生物菌株的载体与复合烟叶粉末质量比为1:0.5~2，在温度为35~55℃，匀速搅拌，添加苹果酸调节pH值为4.0~6.0，发酵1~6 d，微孔过滤复合烟叶残渣，保留复合烟叶发酵液A；
（6）连续逆流超声提取：将步骤（5）过滤所得复合烟叶残渣，按速率0.1~1.0 kg/10 min投料至浸出舱，开启主机和超声波发生器，调节温度60~100 ℃，料液比为质量比1:2~6，从浸出舱低端运行0.2~1 h后调节出液阀门均匀放液，控制溶剂加入流量，保持浸出仓液位平衡，连续逆流超声提取达30~60 min时，投料加入一定比例的氢氧化钙、复合氨基酸，当连续逆流超声提取共达90~150 min时，停止生产工艺，排渣，得到浸出液B；
（7）将步骤（5）的发酵液A和步骤（6）的浸出液B合并，得到复合烟叶提取液。
2.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：还包括步骤（8）：将所述复合烟叶提取液经真空冷冻干燥得到复合烟叶提取物。
3.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的复合烟叶为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的混合物，质量比为1:0.5~1:0.5~2。
4.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的葡萄糖、果糖为食品级；活性固体冻干菌粉为食品级，活性为10~30 u/mg。
5.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中晾晒烟烟杆为晒红烟、晒黄烟、白肋烟的烟杆的混合物，三者质量比为1:0.5~1:0.5~2，晾晒烟烟杆和玉米芯的碎块为用剪刀剪成1 cm长的小块，晾晒烟烟杆、玉米芯、米糠之间的质量比为1:0.5~2：0.5~2。
6.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中苹果酸为食品级，匀速搅拌的转速为20~80 rpm。
7.如权利要求1所述的复合烟叶提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中使用的氢氧化钙为分析纯，占复合烟叶质量的0.1~1%，所述复合氨基酸为吡咯赖氨酸、硒半胱氨酸和异亮氨酸，食品级，占复合烟叶质量的0.5~1.5%，三者之间的质量比为1:0.5~2:0.5~2。
8.一种如权利要求1所述方法制备的复合烟叶提取液在传统卷烟配方烟丝加料中的应用，按0.01~0.08%烟丝的质量比的复合烟叶提取液和糖分、水混匀，喷洒到制丝加料罐中，按正常卷烟工艺加工成配方烟丝。
9.一种如权利要求2所述方法制备的复合烟叶提取物在加热不燃烧卷烟烟丝中加香的应用，将该复合烟叶提取物溶解到70%乙醇溶液中，稀释1000倍，按与烟丝0.01~0.1%的质量比加香。
10.一种如权利要求1所述方法制备的复合烟叶提取液在加热不燃烧卷烟再造烟叶中的应用，将该复合烟叶提取液按0.01~0.7%再造烟叶原料的质量比，添加到加热不燃烧卷烟再造烟叶涂布液中应用。
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