CN109338002A - 一种与西瓜果皮底色相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用。所述的SNP位点位于西瓜基因组第8号染色体的第29880100位核苷酸，该核苷酸为C或G。本发明得到的核苷酸多态性标记位点能够用于鉴定西瓜果皮底色。本发明的SNP分子标记，是基于候选基因开发出来的与西瓜果皮底色紧密连锁的SNP分子标记。利用该SNP分子标记对105份西瓜种质资源进行果皮底色鉴定，结果显示其对墨绿色果皮底色和绿色果皮底色的西瓜鉴定的准确率为100%。本发明不需要经过西瓜果实成熟期鉴定，在苗期就可以准确快速的鉴定出西瓜果皮底色，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，适用于西瓜的遗传鉴定与育种。

Description

一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用。

技术背景

在传统的选择育种中，因为难以确定后代的基因型，选择的依据通常是植物的表现型而不是基因型，选择时间较长，且表现型易受环境因素的影响，导致选择的不准确和效率较低。分子标记辅助育种以与目标形状紧密连锁分子标记为工具对目标性状进行筛选，通过分子标记以基因型进行种质资源的筛选，具有准确、快速、不受环境条件干扰的优点，避免了传统育种过程中性状选择的盲目性，提高了育种效率。

SNP分子标记(single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)是指在基因组水平上由于单个核苷酸的突变所引起的DNA序列的改变。广泛的存在于基因组上，具有高通量、简单、稳定、灵敏度高等特定，是目前分子标记辅助育种工作中极具发展前景的分子标记。西瓜是一种重要的园艺作物，我国是世界第一大的西瓜生产和消费大国，然而在西瓜育种过程中，可用的分子标记较少，仍以传统的选择育种为主，效率较低，难以快速获得满足市场需求的新品种。西瓜果皮底色是西瓜重要的外观和商品性状，在上世纪三四十年代就有研究人员对此性状进行研究，然而作为西瓜果皮底色中存在最普遍的绿色相关性状(绿色和墨绿)，尚未见到有于此性状紧密连锁的分子标记的研究报道，因此存在需求开展西瓜果皮底色研究，开发可用于西瓜育种的分子标记，以缩短育种进程提高育种效率。

发明内容

为解决上述西瓜育种过程中遇到的问题，本发明提供了一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记位。本发明是基于候选基因开发出来的与西瓜果皮底色紧密连锁的SNP分子标记，利用该SNP分子标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜果皮底色，具有通量大、扩增产物稳定、检测快速的优点，可提高西瓜果皮底色选择育种的效率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该序列5’端起第340位碱基为SNP位点，该SNP位点为西瓜基因组第8号染色体29880100位核苷酸。

进一步地，所述的SNP位点的碱基为G的西瓜的果皮底色为墨绿色，所述SNP位点的碱基为C的西瓜的果皮底色为绿色。

本发明还提供上述与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明又提供用于检测上述与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对，所述的引物对的上游引物是根据西瓜基因组第8号染色第29880100位核苷酸及上游序列进行设计，所述引物对的下游引物是根据西瓜基因组第8号染色体的第29880100位核苷酸及下游序列进行设计。

进一步地，所述引物对由两条单链DNA组成，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示。

上述的与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对可用于西瓜分子标记辅助选择育种中。

本发明又提供了用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测上述与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对。

本发明还提供了一种用于鉴定西瓜果皮底色的方法，包括以下步骤：

步骤1：DNA提取：提取西瓜基因组DNA；

步骤2：PCR扩增：以待测的西瓜基因组DNA为模板，利用上述的的引物对对待测样品进行PCR扩增；

步骤3：连接转化：PCR产物切胶回收后，进行连接转化至感受态细胞，涂板后，将长出的菌落在LB液体培养基中培养；

步骤4：基因分型：将菌液进行测序，根据SNP位点的碱基可判断果皮底色，所述的SNP位点碱基为G的西瓜果皮底色为墨绿色，SNP位点的碱基为C的西瓜果皮底色为绿色。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明利用全基因组重测序技术(WGR)构建一张西瓜高密度遗传图谱，并定位到与果皮底色(墨绿色/绿色)相关的基因区间，通过F2群体实现精细定位，基于候选基因并获得与西瓜果皮底色紧密连锁的SNP分子标记，通过该SNP分子标记可以在植株苗期快速地鉴定出西瓜果皮底色，检测方便、准确率高，极大地提高了育种的效率。

2、本发明根据西瓜基因组第8号染色体第29880100位单核苷酸多态性提供的PCR扩增引物对，特异性强，扩增效果稳定，可准确地用于鉴定西瓜果皮底色(墨绿色/绿色)。

3、本发明提供的用于鉴定西瓜果皮底色的方法，可使用于各个时期对西瓜果皮底色的鉴定，不受发育时期的限制，检测便捷。

4、利用本发明的SNP分子标记对105份不同果皮底色的西瓜种质资源进行验证，结果证明，该SNP分子标记对墨绿色和绿色果皮底色的西瓜种质资源鉴定的准确性为100％，鉴定结果说明，本发明提供的SNP分子标记和鉴定方法具有高效快捷、准确率高的优点，可以用于育种工作，提高育种效率。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1SNP分子标记位点的获得

1.1高密度遗传图谱的构建

利用墨绿色果皮底色的母本(9904)和绿色果皮底色的父本(Handel)通过连续多代自交构建含126个单株的重组自交系群体，通过全基因组重测序对亲本和重组自交系群体进行测序，利用HighMap软件开发高密度SNP，构建西瓜高密度遗传图谱，亲本间共检测到178762个适用于重组自交系且深度不低于4X的SNP分子标记。通过生物信息学分析，得到与西瓜果皮底色相关的定位区间位于西瓜基因组第8号染色体末端2.07Mb的区域内。

1.2SNP位点的获得

利用定位区间内的单核酸多态性设计CAPS标记，对分离群体F2进行基因型分析，根据相应F2单株的表现型(墨绿色果皮底色或绿色)筛选重组单株，最后得到控制西瓜果皮底色的候选基因位于西瓜基因组第8号染色体的29869645位核苷酸和29901009位核苷酸之间。在该区间鉴定出29880100位点为SNP位点。

实施例2利用该SNP分子标记鉴定西瓜果皮底色的方法

2.1、西瓜基因组DNA的提取

采用常规CTAB法提取待测西瓜样品组织DNA，去除RNA污染，DNA样品体积为100μL。用紫外分光光度计测定DNA样品的OD_260/280比值，数值应在1.8～2.0之间以获得高质量的DNA样品，浓度稀释到100ng/μL。

2.2、引物设计

根据西瓜基因组第8号染色体第29880100位碱基左右各400bp序列设计引物。具体核苷酸序列见序列表SEQ ID NO:1，引物序列见表1。

表1引物序列

2.3 PCR反应体系

PCR反应体系如表2所示。

表2 PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		2×PCR Mix	25
上游引物	2
		下游引物	2
DNA模板	2
		去离子水	19
总体积	50

PCR扩增程序为：94℃1.5min，94℃20sec，57℃20sec，72℃50sec，35个循环；72℃5min；4℃保存。

2.4连接转化

琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，将回收得到的PCR产物连接到pTOPO载体上，连接体系如下表3。

表3胶回收产物连接体系

试剂	加入体积(μL)
		10×Enhancer	0.5
ptopO	0.5
		PCR回收产物	4.0
总体积	5.0

然后混匀样品，室温(20℃～30℃)连接5分钟。

将上述得到的连接产物转化至感受态细胞中，取菌液涂板(培养基含氨苄青霉素50～100μg/ml)，37℃过夜培养，将长出的菌落在液体LB培养基中培养，之后菌液测序可得到SNP分子标记的碱基序列，根据SNP位点的基因型可以判断果皮底色。SNP位点的碱基为G，则果皮底色为墨绿色；SNP位点的碱基为C，则果皮底色为绿色。

实施例3利用SNP分子标记对105份西瓜种质资源进行鉴定

以国家西甜瓜中期库中的105份不同果皮底色的西瓜种质资源为材料，利用本发明SNP分子标记对果皮底色进行鉴定。具体鉴定方法参照上述实施例2中的方法。鉴定结果表明上述105份西瓜材料表型与基因型结果完全符合，说明本发明的SNP分子标记可准确的鉴定西瓜墨绿色和绿果皮底色，准确率为100％。

105份种质资源中墨绿色果皮底色的西瓜31份，绿色果皮底色的西瓜74份，具体品种及表型见下表4，其中墨表示墨绿色，绿表示绿色。

表4 105份西瓜种质资源的果皮底色

综上所述，本发明提供的SNP分子标记可以准确快速的鉴定出西瓜果皮底色，可以提高育种效率，缩短鉴定时间，适于西瓜的遗传鉴定与育种。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记及其应用

<130> 无

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 667

<212> DNA

<213> 西瓜（Citrullus lanatus）

<220>

<221> variation

<222> (340)..(340)

<223> n=g或c

<400> 1

aaggccataa ccagatgcga ctgggacaac gatgttgttg atcatccatt ccttgcatag 60

aggaagttca ggagaaacaa gcaaaataag taggggcttt agaggtaaac actgagtaga 120

gactctgcta aatttgaagt gtgcaccaca cataaaaaat ttaggccttc acacaaaagt 180

acctgaatag cagcagtagt cggttgtgta gtcttgttaa agtcgagaat tgatacctta 240

ctacctggaa agaccacttg aattttgtaa ctgaatgacc atgttaacaa tcaagaagga 300

ccaaaaaaaa aaaacaaaaa ccttctttta gtactctacn catctcctct aatgctctcc 360

gtttatccac cacatttcgt agaccgtagc ccattgtaat ggcatcgaaa gagccgtcag 420

gaaatggcaa attgagtgca tcaccctcca cccaccttca ctttggcagc agcgttatta 480

ggttgttaat ttcacaaatc aattaccaat tacaattctc actgaagcaa aactgtatcg 540

tgaaatacac agaggaatgc ttcaatattt tcaaaatagt agaggccaac acattaattg 600

ttcaagttta gtaatgctca ctcaatgttg tcatagcagg agttggagag ggaacgttgg 660

cgagaag 667

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

aaggccataa ccagatgcga 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

cttctcgcca acgttccct 19

Claims (8)

1.一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列5’端起第340位碱基为SNP位点，该SNP位点为西瓜基因组第8号染色体29880100位核苷酸。

2.根据权利要求1所述的一种与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP位点的碱基为G的西瓜的果皮底色为墨绿色，所述SNP位点的碱基为C的西瓜的果皮底色为绿色。

3.权利要求1或2所述的与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

4.用于检测权利要求1或2所述与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物是根据西瓜基因组第8号染色第29880100位核苷酸及上游序列进行设计，所述引物对的下游引物是根据西瓜基因组第8号染色体的第29880100位核苷酸及下游序列进行设计。

5.根据权利要求4所述的用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对，其特征在于，所述引物对由两条单链DNA组成，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示。

6.权利要求4或5所述的用于检测与西瓜果皮底色相关的SNP分子标记的PCR扩增引物对在西瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

7.用于鉴定西瓜果皮底色的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4或5所述的引物对。

8.一种用于鉴定西瓜果皮底色的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：DNA提取：提取西瓜基因组DNA；

步骤2：PCR扩增：以待测的西瓜基因组DNA为模板，利用权利要求4或5所述的的引物对对待测样品进行PCR扩增；

步骤3：连接转化：PCR产物切胶回收后，进行连接转化至感受态细胞，涂板后，将长出的菌落在LB液体培养基中培养；

步骤4：基因分型：将菌液进行测序，根据SNP位点的碱基可判断果皮底色，所述的SNP位点碱基为G的西瓜果皮底色为墨绿色，SNP位点的碱基为C的西瓜果皮底色为绿色。