CN109321555B

CN109321555B - 一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用

Info

Publication number: CN109321555B
Application number: CN201811306105.4A
Authority: CN
Inventors: 严芬; 陈淑琼; 翁祖铨; 黎春华; 叶晓玲
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-11-05
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2038-11-05
Also published as: CN109321555A

Abstract

本发明提供一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用，本发明通过发酵培养解淀粉芽孢杆菌MG‑3制备发酵液，从发酵液中分离纯化抗菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，建立抗菌蛋白的实验纯化方法并鉴定该抗菌蛋白，研究其稳定性，并应用在枇杷上研究其保鲜效果，为更好地研究利用该菌株及其抗菌物质防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。

Description

一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用。

背景技术

果蔬具有营养丰富、含水率高等特点，是人们生活消费品之一，但采摘和贮运过程中，新鲜果蔬容易受到机械损伤，一旦受到损伤果蔬致病真菌就更容易侵染伤口并且大量繁殖，会加速果蔬腐烂，缩短保质期。因此，防治果蔬病害成为农业产业化，规模化发展亟需解决的问题之一。目前，应用于防治果蔬病害大多采用化学杀菌剂，长期使用化学杀菌剂不仅病原菌易产生抗药性、污染环境等问题，而且也可能危害人类的健康。因此各国相关领域科研工作者一直致力于找寻新型，高效，清洁的生防技术，能够减少以及逐步取代化学杀菌剂的使用。近年，利用拮抗菌进行果蔬病害的生物防治，是一种安全高效并具有广阔的应用前景而迅速发展为研究热点之一。土壤放射菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌等是目前主要应用于生物防治的微生物。其中芽孢杆菌不仅自身抗菌广、防治病害能力强，而且次生代谢产物中含有多种抗菌物质，是目前国内外生物防治的研究热点之一。

抗菌蛋白质是由芽孢杆菌发酵分泌的物质，一般芽孢杆菌发酵液中含有很多物质，包括抗菌蛋白，脂肽类，还有一些其他蛋白。研究芽孢杆菌的抗菌蛋白等物质的结构和功能，能更好的将其应用于市场，需要将抗菌蛋白从芽孢杆菌发酵液中分离纯化出来。目前，实验室对于蛋白的分离纯化一般经过两个阶段，一是蛋白质的粗提，可以采用盐析、有机溶剂沉淀、透析和超滤等；另一过程是精提，通过离子交换层析、分子凝胶层析、疏水层析以及亲和层析等技术的组合，来获得单一条带的目的蛋白。

本发明通过从福建农林大学食品科学院提供的解淀粉芽孢杆菌MG-3发酵培养，从菌株MG-3分泌的次级代谢产物中纯化抗菌蛋白，建立抗菌蛋白的实验纯化方法，鉴定该抗菌蛋白，研究其稳定性，并应用在枇杷上研究其保鲜效果，为更好地研究利用该菌株的抗菌物质防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的工艺流程如下：

将解淀粉芽孢杆菌MG-3发酵培养，制备发酵液并通过硫酸铵沉淀获得抗菌蛋白粗提液；通过层析方法分离纯化抗菌蛋白；抗菌蛋白的质谱鉴定；探究抗菌蛋白的稳定性，如温度、pH、有机溶剂、紫外线、蛋白酶K；抗菌蛋白对枇杷保鲜的应用。

从超低温冰箱取出解淀粉芽孢杆菌MG-3，将菌株MG-3活化，培养种子液，培养发酵液。将发酵液低温高速离心，弃菌体取上清，根据硫酸铵分级盐析法，将发酵上清液按不同硫酸铵饱和度沉淀分离，验证其沉淀蛋白的活性和纯度，将具有抗菌活性的40%硫酸铵饱和度沉淀蛋白利用离子交换层析分离纯化，采用线性梯度方法洗脱，得到4个洗脱峰（见图1），经过透析，浓缩处理，验证四个样品的抗菌活性，确定峰4具有明显的抗菌活性，再检验峰4的纯度，进而确定需要进一步分离纯化。根据凝胶层析原理，将处理好的峰4样品上样于Sephacryl S-200凝胶层析，获得2个洗脱峰（见图2），同样验证其抗菌活性，得到的峰4-1具有抗菌活性，说明峰4-1样品中含有活性蛋白，再利用SDS-聚丙烯电泳检测其蛋白纯度，结果显示峰4-1样品含有一条明显条带，达到电泳纯，分子量在45KDa左右。实验结果说明解淀粉芽孢杆菌MG-3的发酵液经过三步分离纯化步骤，获得具有抗菌活性峰4-1样品蛋白达到电泳纯，分子量在45KDa左右。

将纯化的抗菌蛋白样品经SDS-PAGE电泳，染色，脱色，将目的条带切下来，采用基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)鉴定分离纯化的抗菌蛋白，将得到的质谱测试原始文件使用Mascot 2.2 软件检索uniprot的数据库。结果显示有10种芽孢杆菌具有相似同类蛋白，该类蛋白是Serine protease，其中最相似的一类就是解淀粉芽孢杆菌，与本发明所用的菌株是同一类。该解淀粉芽孢杆菌含有的丝氨酸蛋白酶分子量48147.1Da，本发明获得的抗菌蛋白经SDS-PAGE验证为45KDa左右很接近；等电点是5.77，本发明获得的抗菌蛋白在利用离子交换层析时，根据实验结果推出抗菌蛋白等点在7.4以下，本发明得到的抗菌蛋白很可能与该类解淀粉芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶是同一类。

本发明研究了不同温度处理抗菌蛋白对其活性效果的影响，发现抗菌蛋白在100℃处理温度，能保持在80%的活性，表明该抗菌蛋白有良好的温度稳定性。研究了不同pH处理抗菌蛋白对其活性效果的影响，发现抗菌蛋白在pH 6处理的样品，与对照样品相比，保持100%的活性，当pH 12时，相对活性75%，表明该抗菌蛋白在酸碱环境下其活性均具有一定的稳定性，尤其是酸性条件下有良好的活性。研究紫外线对抗菌蛋白的影响中发现紫外线持续照射90min，抗菌蛋白仍有80%活性，说明该抗菌蛋白耐受紫外线照射，能保持较高抗菌活性。本发明研究几种有机溶剂对抗菌蛋白的影响，经过有机溶剂处理，排除有机溶剂本身的影响，抗菌蛋白具有较高活性，保持在70%以上，表明有机溶剂对抗菌蛋白的结构或者抗菌蛋白的功能位点没有明显的影响。本发明研究抗菌蛋白对蛋白酶K的敏感性，蛋白酶K对抗菌蛋白没有明显的降解效果，蛋白酶K处理时间的长短都不影响抗菌蛋白的抗菌效果，基本保持在100%，说明该抗菌蛋白对蛋白酶K不敏感，抗菌蛋白的结构稳定，对工业化生产和应用该抗菌蛋白提供理论基础。

将纯化获得的抗菌蛋白直接作用于枇杷，观察其防治效果，在抗菌蛋白浓度为40ug/mL处理条件下，放置于恒温恒湿培养箱中，培养条件：20℃，湿度90%；15天后观察枇杷，发现其可以保存的相对较好，坏果粒较少，外形与最初的状态相差不大，对照组枇杷不仅腐烂多，有致病菌生长，而且对照组枇杷相对干瘪，不如实验组饱满。这个蛋白浓度与测定的半数抑菌浓度相近，对于实际应用于枇杷防治有重要意义。

本发明通过发酵培养解淀粉芽孢杆菌MG-3制备发酵液，从发酵液中分离纯化抗菌蛋白，建立抗菌蛋白的实验纯化方法并鉴定该抗菌蛋白，研究其稳定性，并应用在枇杷上研究其保鲜效果，为更好地研究利用该菌株及其抗菌物质防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。

附图说明

图1 DEAE-650C离子交换层析图。

图2 Sephacryl S-200凝胶层析图。

图3为纯化的抗菌蛋白的抑菌活性。

图4为纯化的抗菌蛋白的SDS-聚丙烯凝胶电泳图。

图5 为不同处理温度对抗菌蛋白的影响。

图6为不同pH处理对抗菌蛋白的影响。

图7 为紫外线不同处理时间对抗菌蛋白的影响。

图8 为有机溶剂对抗菌蛋白的影响。

图9 为蛋白酶K不同处理时间对抗菌蛋白的影响。

图10为抗菌蛋白对枇杷果实保鲜的应用。

具体实施方式

实施例1

从超低温冰箱取出甘油贮藏的解淀粉芽孢杆菌MG-3，快速解冻，涂布到LB平板，放置37℃的生化培养箱中培养24h。挑取平板上的菌落MG-3接种到种子培养基中，在37℃、170r/min的振荡培养箱中培养12h。取3%的种子液接种于发酵培养基中，在37℃、170r/min的振荡培养箱中培养72h，制备得到发酵液。

将制备得到的发酵液低温离心（4℃，10000g）10min,收集上清，弃菌体和残渣。将收集的上清液放入冰水中，边加固体硫酸铵边缓慢搅拌，直至硫酸铵达到20%饱和度，在4℃冰箱中静止2h后，低温高速离心（4℃，11000g）10min，分别收集上清和沉淀。再依次按照同样的方法调节到40%、60%的硫酸铵饱和度，低温高速离心（4℃，11000g）20min，分别收集每一饱和度对应沉淀和上清。用20mmol/L、pH8.4 Tris-盐酸缓冲液溶解收集到的沉淀。

将溶解在缓冲液中的样品分别倒入透析袋中，放入透析液(20mmol/L、pH8.4Tris-盐酸缓冲液)中，透析过夜、换三次缓冲液，去除硫酸铵，防止抗菌蛋白在硫酸中变性。透析后的样品通过抑菌实验测定各组分的抗菌活性，确定进一步纯化的样品。抑菌实验中使用的指示菌株是实验室保藏的葡萄座腔菌，将用打孔器做成菌饼的葡萄座腔菌接种到PDA固体培养基中央，在距离菌饼2cm等距的位置，放置牛津杯或者用10MM的打孔器打孔，取100ul待检样品加入牛津杯或者孔洞中，静止10min后，把平板放入28℃的生化培养箱中，孵育60h后，观察抑菌效果。

将处理好具有抑菌活性的样品过DEAE-650C层析柱，上样量不能超过填料的最大吸附能力。开始用20mmol/L、pH8.4 Tris-盐酸缓冲液洗脱未吸附的组分和杂质，待基线平稳，用20mmol/L、pH8.4 Tris-盐酸缓冲液和0mol/L至0.4mol/L NaCl（Tris-盐酸缓冲液中）线性梯度洗脱，最后用含有1mol/L NaCl的Tris-盐酸缓冲液洗脱，洗脱速度1mL/min，使吸附在层析柱填料的各组分都洗脱下来。用自动部分收集器收集洗脱的各组分（5min/管），再根据蛋白检测器（OD₂₈₀）记录的洗脱峰，将每一个洗脱峰对应收集器的管数汇成在一起，将收集的样品浓缩，透析，测定各组分的抗菌活性及纯度，确定进一步纯化的样品。

将离子交换层析收集具有活性的样品过Sephacryl S-200层析柱，上样量不超过4mL。待样品溶液全部流入填料中，根据凝胶层析原理，只需一种缓冲溶液，用20mmol/L、pH7.4 磷酸盐缓冲液洗脱，直至没有洗脱峰出现，流速0.5mL/min。用自动部分收集器收集洗脱的各组分（5min/管），再根据蛋白检测器（OD₂₈₀）记录的洗脱峰，将每一个洗脱峰对应收集器的管数汇成在一起。将收集的样品浓缩，透析，最后通过抑菌实验测定样品活性及通过SDS-PAGE检测样品纯度。结果由附图3可知，收集的峰4-1（图2）具有明显的抑菌活性，由附图4可知收集的具有抑菌活性的样品经SDS-PAGE达到单一条带的电泳纯，初步可以确定该活性蛋白的分子量为45KDa。

实施例2

（1）样品制备：将分离纯化后跑胶得到的单条带胶条切碎后转入EP 管中，加入400μL 100mmol/L NH₄HCO₃/30%ACN 脱色液，反复清洗，直至清洗脱色至透明，弃上清，加入100mM NH₄HCO₃，室温孵育15min；弃上清，冻干，之后加入5μL 10ng/μL 测序级Trypsin(Promega)溶液（酶与被分析蛋白质质量比一般为1∶20-1∶100），37℃反应过夜；吸出酶解液，转移至新EP 管中，原管加入100μL 60% ACN /0.1%TFA, 超声15 分钟，合并酶解液冻干；若有较多盐分，则用Ziptip（millipore）进行脱盐。

（2）质谱操作步骤：冻干后的酶解样品，取2μL 20%乙腈复溶。取1μL 溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥后，再取0.5μL 过饱和CHCA 基质溶液（溶剂为50%ACN、0.1% TFA）点至对应靶位上并自然干燥。样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪(5800 MALDI-TOF/TOF, AB SCIEX)进行测试分析，激光源为355 nm 波长的Nd:YAG 激光器，加速电压为2 kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据，一级质谱（MS）扫描范围为800–4000Da，选择信噪比大于50 的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析，每个样品点上选择8 个母离子，二级质谱（MS/MS）累计叠加2500 次，碰撞能量2 kV，CID关闭；质谱测试原始文件用Mascot 2.2 软件检索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。该纯化的蛋白质谱结果通过Mascot搜库，得到鉴定的蛋白质结果如表1，有10种芽孢杆菌具有相似同类蛋白，该类蛋白是Serine protease，其中最相似的一类就是解淀粉芽孢杆菌，与本发明所用的菌株是同一类，该解淀粉芽孢杆菌含有的丝氨酸蛋白酶分子量48147.1Da，本发明获得的抗菌蛋白经SDS-PAGE验证为45KDa左右很接近，本研究的抗菌蛋白与该蛋白的Protein Score C.I.%是100%，蛋白鉴定成功的标准是Protein Score C.I.%大于95%，所以本研究抗菌蛋白的鉴定结果是十分可靠的，因此根据抗菌蛋白质谱鉴定结果得到解淀粉芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列，序列见如SEQ ID NO.1所示。

表1

实施例3

（1）温度对抗菌蛋白抗菌效果的影响

将冷冻干燥成粉末的纯化的抗菌蛋白溶解于磷酸盐缓冲液（20mmol/L pH7.4），浓度为40ug/mL，分装于1.5mL的EP管中，每管装1mL，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、100℃温度下处理30min，未处理的同一批样品作对照，测定抗菌蛋白的抑菌活性。结果由附图5可知，0℃至30℃处理温度抗菌活性是逐渐增加，说明低温对抗菌蛋白有一定抑制作用，但是抗菌蛋白在低温时也能保持在70%以上的活性；随着处理温度的升高，抗菌蛋白的抗菌活性有一定失效，但基本保持在80%以上的活性，甚至在100℃处理温度，能保持在80%的活性，这些实验结果表明该抗菌蛋白有良好的温度稳定性，对该蛋白未来应用于果蔬病害防治具有重要意义。

（2）pH对抗菌蛋白抗菌效果的影响

将冷冻干燥成粉末的纯化的抗菌蛋白溶解于磷酸盐缓冲液（20mmol/L pH7.4），浓度为40ug/mL，分装于10mL的离心管中，每管装5mL，分别用盐酸和氢氧化钠溶液调节pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11、未处理的同一批样品作对照，将这些样品水浴4h，温度37℃，再分别调回pH7.4，终体积为10mL。测定抗菌蛋白的抑菌活性。结果由附图6可知，无论待测样品处理的pH大小，抗菌蛋白的活性都稳定在70%以上，说明该蛋白的结构稳定，活性不易失效；pH6处理的样品，与对照样品相比，依然能保持100%的活性。

（3）紫外线对抗菌蛋白抗菌效果的影响

将冷冻干燥成粉末的纯化的抗菌蛋白溶解于磷酸盐缓冲液（20mmol/L pH7.4），浓度为40ug/mL，分装于1.5mL的离心管中，每管装1mL。用紫外线照射样品，在垂直距离紫外灯下15cm放置样品，离心管管盖始终处于打开状态，紫外功率20W，分别照射15、30、45、60、75、90min，未处理的同一批样品作对照，测定抗菌蛋白的抑菌活性。结果由附图7可知，持续照射90min，抗菌蛋白仍有80%活性，说明该抗菌蛋白耐受紫外线照射，能保持较高抗菌活性，该特征有利于未来该抗菌蛋白的大规模使用。

（4）有机溶剂对抗菌蛋白抗菌效果的影响

将冷冻干燥成粉末的纯化的抗菌蛋白溶解于磷酸盐缓冲液（20mmol/L pH7.4），浓度为40ug/mL，分装于2mL的离心管中，每管装0.8mL，再分别等量添加甲醇、***、丙酮、氯仿等有机溶剂，上下颠倒混匀，置于4℃，30min。低温高速离心，11000g，4℃，10min，弃除有机层，未处理的同一批样品作对照，测定抗菌蛋白的抑菌活性。结果由附图8可知，经过有机溶剂处理，排除有机溶剂本身的影响，抗菌蛋白具有较高活性，保持在70%以上，表明有机溶剂对抗菌蛋白的结构或者抗菌蛋白的功能位点没有明显的影响。

（5）蛋白酶K对抗菌蛋白抗菌效果的影响

将冷冻干燥成粉末的纯化的抗菌蛋白溶解于磷酸盐缓冲液（20mmol/L pH7.4），浓度为40ug/mL，分装于1.5mL的离心管中，每管装1mL，将蛋白酶K酶液（20 mg/ml）与样品按1：200混合，即5ul酶液：1000ul样品。37℃水浴90min，每隔15min取出一个样品，直至最后一样品取出，未处理的同一批样品作对照，测定抗菌蛋白的抑菌活性。结果由附图9可知，可以清楚看出蛋白酶K对抗菌蛋白没有明显的降解效果，蛋白酶K处理时间的长短都不影响抗菌蛋白的抗菌效果，基本保持在100%，说明该抗菌蛋白对蛋白酶K不敏感，抗菌蛋白的结构稳定，对工业化生产和应用该抗菌蛋白提供理论基础。

实施例4

将新鲜采摘的枇杷称重，按重量分成4组，每组18个枇杷；提前制备浓度为40ug/mL的抗菌蛋白溶液直接喷洒在枇杷表面，对照组为无菌水；放置于恒温恒湿培养箱中，培养条件：20℃，湿度90%；每隔三天记录枇杷的表面状态，枇杷表面超过三分之一腐烂或者长满致病菌的状态属于坏果粒。结果由附图10可知，枇杷在放置保存15天后跟对照组比保存的较好，坏果粒少，外形与最初的状态相差不大，好果率可以达到99%以上；对照组枇杷不仅腐烂多，有致病菌生长，而且对照组枇杷相对干瘪，不如实验组饱满。而且40ug/mL的蛋白浓度与测定的半数抑菌浓度相近，对于实际应用于枇杷防治有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Phe Gly Tyr Ser Met Val Gln Met Val Arg Ser Asn Ala His Lys

1 5 10 15

Leu Asp Trp Pro Leu Arg Glu Asn Val Leu Gln Leu Tyr Lys Pro Phe

20 25 30

Lys Trp Thr Pro Cys Phe Leu His Asn Phe Phe Glu Lys Lys Val Lys

35 40 45

Asn Arg Lys Lys Met Ser Val Ile Ile Glu Phe Glu Glu Gly Cys His

50 55 60

Glu Ser Gly Phe His Ser Thr Gly Gln Val Leu Ser Lys Glu Lys Arg

65 70 75 80

Cys Thr Ile Lys Lys Gln Phe Gln Thr Ile Asn Cys Cys Ser Ala Glu

85 90 95

Val Thr Pro Ser Ala Leu His Met Leu Leu Ser Gln Cys Arg Asp Ile

100 105 110

Arg Lys Ile Tyr Leu Asn Arg Glu Val Lys Ala Leu Leu Asp Thr Ala

115 120 125

Thr Glu Ser Ser His Ala Lys Glu Val Thr Arg Asn Gly Thr Val Leu

130 135 140

Thr Gly Lys Gly Val Thr Val Ala Val Ile Asp Thr Gly Ile Tyr His

145 150 155 160

His Pro Asp Leu Glu Gly Arg Ile Ile Gly Phe Ala Asp Phe Val Asn

165 170 175

Gln Lys Thr Glu Pro Tyr Asp Asp Asn Gly His Gly Thr His Cys Ala

180 185 190

Gly Asp Ile Ala Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Gly Lys Tyr Gln Gly

195 200 205

Pro Ala Pro Glu Ala Asp Leu Ile Gly Val Lys Val Leu Asn Lys Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Leu Ala Asp Ile Ile Glu Gly Val Glu Trp Cys Ile

225 230 235 240

Gln Tyr Asn Lys Glu His Thr Lys Asn Pro Ile Arg Ile Ile Ser Met

245 250 255

Ser Leu Gly Gly Asp Ala Leu Lys Tyr Asp Lys Glu Thr Asp Asp Pro

260 265 270

Leu Val Lys Ala Val Glu Glu Ala Trp Asn Glu Gly Ile Val Val Cys

275 280 285

Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Glu Ala Gln Thr Ile Ser Ser Pro

290 295 300

Gly Val Ser Glu Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Tyr Asp Asp Asn Asp

305 310 315 320

Thr Ala Ser Asn Glu Asp Asp Thr Val Ala Ser Phe Ser Ser Arg Gly

325 330 335

Pro Thr Val Tyr Gly Lys Glu Lys Pro Asp Ile Leu Ala Pro Gly Val

340 345 350

Asp Ile Val Ser Leu Arg Ser Pro Arg Ser Tyr Leu Asp Lys Leu Gln

355 360 365

Lys Ser Asn Arg Val Gly Ser Leu Tyr Phe Ser Leu Ser Gly Thr Ser

370 375 380

Met Ala Thr Pro Ile Cys Ala Gly Ile Ala Ala Leu Ile Leu Gln Gln

385 390 395 400

Asn Pro Gln Leu Ser Pro Asp Glu Val Lys Thr Leu Ile Arg Gln Ser

405 410 415

Pro Asp Gln Trp Thr Asn Glu Asp Pro Asn Ile Tyr Gly Ala Gly Ala

420 425 430

Val Asn Ala Glu Asn Ala Val Pro Lys Glu

435 440

Claims

1.一种丝氨酸蛋白酶在枇杷保鲜上的应用，其特征在于：所述丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种丝氨酸蛋白酶在枇杷保鲜上的应用，其特征在于：所述丝氨酸蛋白酶是通过将解淀粉芽孢杆菌发酵培养，制备发酵液并通过硫酸铵沉淀获得抗菌蛋白粗提液；通过层析方法分离纯化获得所述丝氨酸蛋白酶。