CN109320363B - 一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥及其制备方法，属于农业微生物技术领域，以重量计，其组份配比如下：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM‑9菌液40‑60重量％、营养复合体20‑40重量％、硫酸锰为1‑3重量％、亚甲基双萘磺酸钠为4‑8重量％，余量为水。本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥中枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM‑9菌株来源于蚕沙，同时利用其发酵生产蚕沙液体生物菌肥，既能够给Bacillus subtilis SEM‑9菌株提供一个接近原生态的生长环境，提高活芽孢数量，也能更有利于蚕沙中各种营养物质的释放。本发明的复合微生物菌肥用于青瓜、小白菜等农作物，能够显著的提高作物的产量和对枯萎病的抵抗能力。

Description

一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥及其制备方法，特别涉及一种芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥及其制备方法，属于复合微生物菌肥领域。
背景技术
枯萎病是一种世界性的植物真菌土传性病害，是造成作物减产的主要微生物病害之一。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl)是其最主要的病原菌之一，寄主范围广。化学药物是防治枯萎病的有效快捷的方法，但化学药物使用导致土壤退化、破坏生态平衡，甚至危害人类健康。
随着社会发展及政府引导，可持续发展的生态农业已成为主流趋势，选育抗病品种、轮作和间作及生物防治等成了防治枯萎病的主要手段。缺乏抗性基因、耗时长、稳定性差是抗病品种选育的主要缺点；轮作和间作能够有效地防治枯萎病，但是经济效益低。
因此，开发既能保证作物连作又能防治枯萎病的生物防治方法是目前枯萎病防治的研究热点。
目前已有研究从蚕沙中筛选到具有解磷、钾等无机元素，并具有拮抗尖孢镰刀菌的微生物，例如2017年9月12号公布的专利号为2017104163586的中国发明专利公开了一株来源于蚕沙的枯草芽孢杆菌菌株(Bacillus subtilis SEM-9)。
复合微生物菌肥是指含有大量植物根际促生菌(PGPR)的生物肥料，植物根际促生菌(PGPR)能合成植物营养物质或激素、抑制植物病原菌生长、释放环境胁迫、改善微量元素的存在形式、促进肥料的吸收；因而能促进植物生长、提高农作物产量。
蚕粪便、桑叶残渣及蚕座中的垫料统称蚕沙，是蚕商产业的主要副产品，因其粗蛋白、碳水化合物等有机营养物质及磷、钾等无机元素含量丰富，是农作物基肥的首选，但直接将蚕沙作为基肥会导致对其营养利用不充分，例如磷、钾等无机元素的利用不充分，造成浪费。
因此，提供一种兼具高效防治作物枯萎病和促长增产的液体复合微生物菌肥就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一是以蚕沙作为发酵底物并利用枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilis SEM-9)开发出一种高效防治作物枯萎病、促长增产的液体复合微生物菌肥。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥，以重量计，其组份配比如下：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM-9菌液40％-60％、营养复合体20％-40％、硫酸锰为1％-3％、亚甲基双萘磺酸钠为4％-8％，余量为水；
所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM-9菌液通过发酵得到；其发酵配方如下，以质量浓度配比计，蚕沙10～90g/L、玉米淀粉20～30g/L、豆粕粉15～25g/L、(NH4)2SO4为0.5～1.5g/L、CaCO3为3～6g/L、K2HPO4为0.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O为0.15～0.25g/L、MnSO4·H2O为0.15～0.25g/L、NaCl2为10-30g/L、pH＝6.5～7.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；
所述营养复合体为氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素、氨基酸螯合钙或乙二胺四乙酸钠镁中的一种或两种以上任意比例的混合。
优选地，所述蚕沙的含量为30～70g/L。
优选地，所述蚕沙的含量为50～70g/L。
优选地，所述营养复合体中，黄腐酸占总菌肥量的7重量％、腐殖酸占总菌肥量的12重量％、乙二胺四乙酸二钠镁占总菌肥量的3重量％、磷酸氢二钾占总菌肥量的4重量％、磷酸二氢钾占总菌肥量的4重量％。
本发明的另一目的是提供上述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其步骤如下：
(1)菌种活化：
将4℃斜面保存的Bacillus subtilis SEM-9菌种(保藏号是GDMCC NO.60619，广东省微生物菌种保藏中心保藏)转接于LB培养基平板，32～37℃培养60～72h；
(2)一级种子制备：
挑选平板上具有固定形态的单菌落于含有50～100mL的LB液体培养基中(250mL三角瓶)，在32～37℃、150～200rpm/min条件下恒温培养14～20h，得到一级种子液；
(3)二级种子液制备：
将一级种子液按1～4％的接种量接入种子罐，发酵温度为32～37℃，400rpm/min，通气量按与发酵罐体积1:1的比值通气，罐压0.06～0.07Mpa，培养7～10h，得到二级种子液；
(4)Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液制备：
1)发酵液制备：采用发酵配方如下：蚕沙10～90g/L、玉米淀粉20～30g/L、豆粕粉15～25g/L、(NH4)2SO4为0.5～1.5g/L、CaCO3为3～6g/L、K2HPO4为0.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O为0.15～0.25g/L、MnSO4·H2O为0.15～0.25g/L、NaCL2为10-30g/L、pH＝6.5～7.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；
2)将步骤(3)制备的二级种子液按3～5％的接种量接入发酵罐，罐压0.06～0.07Mpa，通气量按与发酵体积1:1的比值通气，400rpm/min，32～37℃恒温发酵18～22h，得到Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液；
(5)营养复合体的制备
氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素、氨基酸螯合钙或乙二胺四乙酸钠镁中的一种或两种以上任意比例的混合，得到营养复合体；
(6)蚕沙复合微生物菌肥的制备
将步骤(4)得到的Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液40-60重量％与步骤(5)制备的营养复合体20-40重量％混合，再加入重量1-3％％的增效剂硫酸锰以及4-8％重量％的助剂亚甲基双萘磺酸钠或缩聚萘磺酸盐分散剂D-425，余量为水，得到蚕沙复合微生物菌肥。
优选地，所述Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液为50重量％、营养复合体30重量％、硫酸锰为2.5重量％、亚甲基双萘磺酸钠为5重量％，余量为水。
所述30重量％的营养复合体包括：占总菌肥量7重量％的黄腐酸、占总菌肥量12重量％的腐殖酸、占总菌肥量3重量％的乙二胺四乙酸二钠镁、分别占总菌肥量4重量％的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。
优选地，所述步骤(4)之步骤1)发酵液制备中，蚕沙的含量为30～70g/L。
优选地，所述步骤(4)之步骤1)发酵液制备中，蚕沙的含量为30～50g/L。
本发明的另一目的是提供上述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
上述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的应用，直接灌根。
具体的施用方法：将本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥稀释500～1000倍后，用于灌根，施用量为：1000～2000g/亩。
本发明的有益效果是：
本发明将发酵液中的Bacillus subtilis SEM-9活芽孢数量提高到9～15×109cfu/mL。
蚕沙中含有丰富的粗蛋白、碳水化合物和水溶性维生素等生物活性物质，同时蚕沙也含有丰富的P、K等无机元素，其常作为中药、饲料及农用基肥来使用；本发明将蚕沙作为液体发酵底物进行发酵，生产液体复合微生物菌肥，充分释放了蚕沙中的有机和无机营养物质。
本发明将Bacillus subtilis SEM-9菌株用于生产蚕沙液体生物菌肥，该菌株来源于蚕沙，同时利用其发酵生产蚕沙液体生物菌肥，既能够给Bacillus subtilis SEM-9菌株提供一个接近原生态的生长环境，提高活芽孢数量，也能更有利于蚕沙中各种营养物质的释放。
本发明的Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥用于青瓜、小白菜等农作物，能够显著的提高作物的产量和对枯萎病的抵抗能力。
下面通过附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅涉及本发明的优选实施方案，在不脱离本发明的精神和范围情况下，各种成分及含量的变化和改进都是可能的。
附图说明
图1中本发明应用实施例1中对照实验的照片。
图2为本发明应用实施例2开始用肥时的照片。
图3为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥和对照菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的长势照片。
图4-1为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
图4-2为本发明应用实施例2中施用对照菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
图4-3为本发明应用实施例2中空白对照的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
图5-1为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
图5-2为本发明应用实施例2中施用对照菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
具体实施方式
实施例1
一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃斜面保存的Bacillus subtilis SEM-9菌种转接于LB培养基平板，35℃培养66h；
(2)一级种子制备：挑选平板上具有固定形态的单菌落，加入含有75mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，在35℃、175rpm/min条件下，恒温培养17h，得到一级种子液；
(3)二级种子液制备：将步骤(2)得到的一级种子液，按2.5％的接种量接入种子罐，发酵温度为35℃，400rpm/min，通气量按与种子罐体积1:1的比值通气，罐压0.065Mpa，培养8.5h，得到二级种子液；
(4)Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液制备：
1)发酵液制备：采用发酵配方如下：蚕沙50g/L、豆粕粉20g/L、玉米淀粉27g/L、(NH4)2SO4为1g/L、CaCO3为4g/L、K2HPO4为0.3g/L、MgSO4·7H2O为0.25g/L、MnSO4·H2O为0.25g/L、NaCl2为20g/L、pH＝7.0、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。
2)将步骤(3)制备的二级种子液，按4％的接种量接入发酵罐，罐压0.065Mpa，通气量按与发酵体积1:1的比值通气，400rpm/min，37℃恒温发酵22h，得到Bacillus subtilisSEM-9发酵菌液；
(5)营养复合体的制备
将氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素、氨基酸螯合钙和乙二胺四乙酸钠镁混合，得到营养复合体，其中包括：占总菌肥量7重量％的黄腐酸、占总菌肥量12重量％的腐殖酸、占总菌肥量3重量％的乙二胺四乙酸二钠镁、分别占总菌肥量4重量％的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；
(6)芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备
将步骤(4)得到的Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液50重量％与步骤(5)制备的营养复合体30重量％、增效剂硫酸锰2.5重量％以及助剂亚甲基双萘磺酸钠为5重量％，混合，余量为水，得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥1。
实施例2
其它与实施例1相同，不同之处在于：步骤(4)之1)中，蚕沙含量为10g/L；得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥2。
实施例3
其它与实施例1相同，不同之处在于：步骤(4)之1)中，蚕沙含量为30g/L；得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥3。
实施例4
其它与实施例1相同，不同之处在于：步骤(4)之1)中，蚕沙含量为70g/L；得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥4。
实施例5
其它与实施例1相同，不同之处在于：步骤(4)之1)中，蚕沙含量为90g/L；得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥5。
实施例6
一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃斜面保存的Bacillus subtilis SEM-9菌种转接于LB培养基平板，32℃培养60h；
(2)一级种子制备：挑选平板上具有固定形态的单菌落，加入含有50mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，在32℃、150rpm/min条件下，恒温培养14h，得到一级种子液；
(3)二级种子液制备：将步骤(2)得到的一级种子液，按1％的接种量接入种子罐，发酵温度为32℃，400rpm/min，通气量按与种子罐体积1:1的比值通气，罐压0.06Mpa，培养7h，得到二级种子液；
(4)Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液制备：
1)发酵液制备：采用发酵配方如下：蚕沙10g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉15g/L、(NH4)2SO4为0.5g/L、CaCO3为3g/L、K2HPO4为0.2g/L、MgSO4·7H2O为0.15g/L、MnSO4·H2O为0.15g/L、NaCl2为10g/L、pH＝6.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水。
2)将步骤(3)制备的二级种子液，按3％的接种量接入发酵罐，罐压0.06Mpa，通气量按与发酵体积1:1的比值通气，400rpm/min，37℃恒温发酵22h，得到Bacillus subtilisSEM-9发酵菌液；
(5)营养复合体的制备
将氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素、氨基酸螯合钙和乙二胺四乙酸钠镁混合，得到营养复合体，其中包括：占总菌肥量7重量％的黄腐酸、占总菌肥量12重量％的腐殖酸、占总菌肥量3重量％的乙二胺四乙酸二钠镁、分别占总菌肥量4重量％的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；
(6)芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备
将步骤(4)得到的Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液40重量％与步骤(5)制备的营养复合体20重量％、增效剂硫酸锰1.5重量％以及助剂缩聚萘磺酸盐分散剂D-425为4重量％，混合，余量为水，得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥6。
实施例7
一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其步骤如下：
(1)菌种活化：将4℃斜面保存的Bacillus subtilis SEM-9菌种转接于LB培养基平板，37℃培养72h；
(2)一级种子制备：挑选平板上具有固定形态的单菌落，加入含有100mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，在37℃、200rpm/min条件下，恒温培养20h，得到一级种子液；
(3)二级种子液制备：将步骤(2)得到的一级种子液，按4％的接种量接入种子罐，发酵温度为37℃，400rpm/min，通气量按与种子罐体积1:1的比值通气，罐压0.07Mpa，培养10h，得到二级种子液；
(4)Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液制备：
1)发酵液制备：采用发酵配方如下：蚕沙90g/L、玉米淀粉30g/L、豆粕粉25g/L、(NH4)2SO4为1.5g/L、CaCO3为6g/L、K2HPO4为0.3g/L、MgSO4·7H2O为0.25g/L、MnSO4·H2O为0.25g/L、NaCl2为30g/L、pH＝7.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；
2)将步骤(3)制备的二级种子液，按5％的接种量接入发酵罐，罐压0.07Mpa，通气量按与发酵体积1:1的比值通气，400rpm/min，37℃恒温发酵22h，得到Bacillus subtilisSEM-9发酵菌液；
(5)营养复合体的制备
将氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素、氨基酸螯合钙和乙二胺四乙酸钠镁混合，得到营养复合体，其中包括：占总菌肥量7重量％的黄腐酸、占总菌肥量12重量％的腐殖酸、占总菌肥量3重量％的乙二胺四乙酸二钠镁、分别占总菌肥量4重量％的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；
(6)芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备
将步骤(4)得到的Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液60重量％与步骤(5)制备的营养复合体40重量％、增效剂硫酸锰3.0重量％以及助剂亚甲基双萘磺酸钠为6重量％，混合，余量为水，得到芽孢杆菌液体复合微生物菌肥7。
用平板活菌计数检测方法检测实施例1-5制备的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥中的Bacillus subtilis SEM-9芽孢数，结果见下表1：
表1蚕沙含量对Bacillus subtilis SEM-9芽孢数的影响
Figure GDA0003116273370000071
Figure GDA0003116273370000081
从表1可以看出：与对照组相比，发酵培养基中添加一定量的蚕沙有益于Bacillussubtilis SEM-9的高密度发酵；并且，当蚕沙含量处于50～70g/L时，其活芽孢数量可以达到145～152×109cfu/mL。
应用实施例1
本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥对青瓜的促进生长实验
实验材料：
青瓜种子通过当地农贸市场购买；Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥按照本发明实施例1配制；生根巨龙菌肥由广东植物龙生物技术股份有限公司制造销售；对照菌肥由德州元和农科技有限公司销售的多孢菌液产品。
实验场地：广东省植物龙生物技术股份有限公司作物栽培室；
实验方法：待瓜苗的真叶完全展开时，首次施肥；一周后进行第二次施肥；每个处理设12穴(平行)，每穴一颗苗，施肥灌胶量为每颗50～60mL/次；每种肥料具体稀释倍数如下表2；第二次施肥后，隔两天，对实验进行第一次验收，七天后分别统计试验组相对对照组的干重和湿重增长率；具体的生长情况见附图1。
表1
Figure GDA0003116273370000082
实验结果如图1所示，施用Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥的青瓜苗厚大浓绿，而施用其它菌肥和清水对照组，都存在明显缺素症状，叶子偏黄，子叶发皱下垂。
下面的表3和表4显示了使用不同生物菌肥对青瓜苗的促长程度，结果显示：使用菌肥都能不同程度上促进青瓜苗的生长，施用对照菌肥和生根巨龙菌肥的效果差距不大，但是施用Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥的青瓜苗的湿重和干重分别增加了6.17倍和11.2倍。
表2鲜重增长率
Figure GDA0003116273370000083
Figure GDA0003116273370000091
表3干重增长率
Figure GDA0003116273370000092
应用实施例2
本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥对比各菌肥间长势差异，同时观察对作物土传病害的预防效果。
试验时间：2018年3月23日至2018年4月10日。
试验材料：Bacillus subtilis SEM-9液体复合微生物菌肥，按照本发明实施例1配制；生根巨龙菌肥由广东植物龙生物技术股份有限公司制造销售；对照菌肥由德州元和农科技有限公司销售的多孢菌液产品。
试验地点：试验地点设在珠海市灯笼路口。
试验地概况：该试验地土质较差保水保肥能力弱，前期用肥前已有部分黄瓜苗枯萎。整体管理水平一般。
试验作物：黄瓜。无虫害，病害发生一般主要以霜霉为主。
小区安排：4个处理，每处理2次重复，共8个小区，每小区约15平米，小区处理采用随机排列。不同处理间设置至少50cm的隔离带。
处理时间和次数
本次试验所选择的黄瓜苗高度约为15cm时开始用肥(如图2所示，为本发明应用实施例2开始用肥时的照片)，每隔7天用一次，即2018年3月23日与2018年3月30日，共淋两次肥，于第二次用肥后10天(即2018年4月9日)进行验收，主要测量株高以及统计死苗情况。
试验期间的天气情况：试验期间温度13～27℃，日平均温度21度；相对湿度为34％～94％，日平均相对湿度75％。淋肥当天天气情况：2018年3月23日晴，2018年3月30日多云。
使用器械及施肥方式：采用清水稀释后浇灌方法。每棵苗浇水约400毫升/次，菌肥平均施用。
株高调查：施肥前定点调查20株黄瓜苗高度，两次用肥之后，于用后10天(即2018年4月9日)对株高进行测量。
死苗调查：第二次用肥后10天(即2018年4月9日)对死苗情况进行统计。
株高增长率计算方法：
Figure GDA0003116273370000101
死苗率计算方法：
Figure GDA0003116273370000102
结果与分析：
黄瓜苗株高增长率见表5：
表5
Figure GDA0003116273370000103
死苗率及防效见表6：
表6
Figure GDA0003116273370000104
如图3所示，为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥和对照菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的长势照片；
如图4-1、4-2、4-3所示，分别为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥、对照菌肥和空白对照的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片；
图5-1和5-2分别为本发明应用实施例2中施用SEM-9菌肥和对照菌肥的黄瓜苗在2018年4月10日验收时的局部放大长势照片。
从本次实验长势结果分析，本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥SEM-9菌肥的效果最好，使用SEM-9菌肥处理的黄瓜苗长势明显，施肥后10天增长率达238.96％，叶片厚大浓绿，茎杆粗壮，早开花结果。
而从抗病性分析，由于施菌肥前已经存在部分死苗，而用肥后SEM-9菌肥在一定程度上可以减缓死苗程度，死苗率12.38％，这比对照菌肥和生根巨龙死苗率低，抗病性更强。
应用实施例3
本发明的芽孢杆菌液体复合微生物菌肥对小白菜的促长增产作用
实验材料：小白菜苗：由惠东县梁化镇农业技术推广站提供；
实验场地：惠州市惠东县梁化镇光长村；
实验设计：如表7所示：
表7 SEM-9复合菌肥对乌叶小白菜促长实验设计
Figure GDA0003116273370000111
a：芭田复合肥(N:P:K＝15:6:8)分别在种苗第4、11、18天后追肥15kg/亩；
b：SEM-9生物复合菌肥灌溉时间与追肥时间相同，稀释倍数为400；此外，在小白菜全生育期另灌溉两次。
实验结果：如表8所示，不同处理对小白菜主要农艺形状的影响，对于处理一而言，淋施“SEM-9复合微生物菌肥”三次后，小白菜的株高分别增加了85.4％、97.8％和36.9％，叶宽分别增加了46.9％、42.6％和29.9％，叶长分别增加了88.9％、82.4％和37.4％。
对于处理二而言，淋施“灭活的SEM-9复合微生物菌肥”的三次后，小白菜的株高分别增加91.3％、96.6％和35.5％，叶宽分别增加了45.2％、42.2％和31.3％，叶长分别增加了95.3％、81.0％和36.8％。
对处理三而言，小白菜同期的株高增幅分别为73.5％、101.2％和33.3％，叶宽增幅分别为41.9％、38.6％和27.9％，叶长增幅分别为88.6％、81.9％和34.4％。
对于没有施加任何肥料的处理四，小白菜的同期株高增幅分别仅为49.0％、100.0％和12.5％，叶宽增幅分别为18.2％、41.0％和7.3％，叶长增幅分别为57.4％、59.5％和15.3％。
采收时，处理一相比处理二，株高、叶宽、叶长和叶数分别增加3.0％、3.6％、2.4％和3.6％；相比处理三，处理一的株高、叶宽、叶长和叶数分别增加了7.7％、11.5％、4.9％和9.6％；相比处理四，处理一的株高、叶宽、叶长和叶数分别增加了40.9％、47.5％、56.6％和33.9％。
表8不同处理对小白菜主要农艺形状的影响
Figure GDA0003116273370000121
如表9所示，不同处理对小白菜产量的影响，通过单因素显著性分析(p<0.05,SPSS22)发现，四个处理间的小白菜产量存在显著性差异，其中处理一产量最高，分别较处理二、三和四增幅5.04％、10.30％和190.94％。其次是处理二的产量较高，分别较处理三和四增幅5.01％和176.98％，而处理四产量最低，亩产仅为294.44±17.60Kg。
表9不同处理对小白菜产量的影响
Figure GDA0003116273370000122
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种芽孢杆菌液体复合微生物菌肥，以重量计，其组份配比如下：
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM-9菌液40-60重量％、营养复合体30重量％、硫酸锰为1-3重量％、亚甲基双萘磺酸钠为4-8重量％，余量为水；
所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SEM-9菌液通过发酵得到；其发酵配方如下，以质量浓度配比计，蚕沙50～70g/L、玉米淀粉20～30g/L、豆粕粉15～25g/L、(NH4)2SO40.5～1.5g/L、CaCO3 3～6g/L、K2HPO4 0.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.25g/L、MnSO4·H2O0.15～0.25g/L、NaCl2 10～30g/L、pH＝6.5～7.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；
所述营养复合体中，黄腐酸占总菌肥量的7重量％、腐殖酸占总菌肥量的12重量％、乙二胺四乙酸二钠镁占总菌肥量的3重量％、磷酸氢二钾占总菌肥量的4重量％、磷酸二氢钾占总菌肥量的4重量％。
2.权利要求1所述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其步骤如下：
(1)菌种活化：
将4℃斜面保存的Bacillus subtilis SEM-9菌种转接于LB培养基平板，32～37℃培养60～72h；
(2)一级种子制备：
挑选平板上具有固定形态的单菌落于含有50～100mL的LB液体培养基中，32～37℃、150～200rpm/min条件下恒温培养14～20h，得到一级种子液；
(3)二级种子液制备：
将一级种子液按1～4％的接种量接入种子罐，发酵温度为32～37℃，通气，罐压0.06～0.07Mpa，培养7～10h，得到二级种子液；
(4)Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液制备：
1)发酵液制备：采用发酵配方如下：蚕沙50～70g/L、玉米淀粉20～30g/L、豆粕粉15～25g/L、(NH4)2SO4为0.5～1.5g/L、CaCO3为3～6g/L、K2HPO4为0.2～0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.15～0.25g/L、MnSO4·H2O为0.15～0.25g/L、NaCL2为10-30g/L、pH＝6.5～7.5、聚硅氧烷消泡剂SXP-101适量，余量为水；
2)将步骤(3)制备的二级种子液按3～5％的接种量接入发酵罐，罐压0.06～0.07Mpa，通气，32～37℃恒温发酵18～22h，得到Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液；
(5)营养复合体的制备
氨基酸、黄腐酸、海藻酸、腐植酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、尿素氨基酸螯合钙或乙二胺四乙酸钠镁中的一种或两种以上任意比例的混合，得到营养复合体；
所述营养复合体包括：占总菌肥量7重量％的黄腐酸、占总菌肥量12重量％的腐殖酸、占总菌肥量3重量％的乙二胺四乙酸二钠镁、分别占总菌肥量4重量％的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；
(6)蚕沙复合微生物菌肥的制备
将步骤(4)得到的Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液40-60％与步骤(5)制备的营养复合体30重量％混合，再加入1-3重量％的增效剂硫酸锰以及4-8重量％的助剂亚甲基双萘磺酸钠或缩聚萘磺酸盐分散剂D-425，余量为水，得到蚕沙复合微生物菌肥。
3.根据权利要求2所述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的制备，其特征在于：所述步骤(6)中所述Bacillus subtilis SEM-9发酵菌液为50重量％、营养复合体30重量％、硫酸锰为2.5重量％、亚甲基双萘磺酸钠为5重量％，余量为水。
4.权利要求1所述芽孢杆菌液体复合微生物菌肥的应用。
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