CN109266646B - 利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用 - Google Patents

利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用，设计了两种特异性靶向甘蓝型油菜BnMAX1基因的sgRNA并制成oligo二聚体，与Cas9载体连接，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，剪切目标序列，每条sgRNA都能通过CRISPR‑cas9***介导A和C基因组上BnMAX1基因的剪切，达到基因敲除的目的。经过表型鉴定，发现纯合突变株系增加了分枝数、单株角果数，降低植株高度，同时也增加了产量。

Description

利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两种特异性靶向甘蓝型油菜 BnMAX1基因的sgRNA以及利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1 基因的方法，可用于培育抗倒伏、高产的油菜品种。
背景技术
甘蓝型油菜(Brassica napus L.)属于十字花科芸薹属，是全球总产量居于第二位的大宗油料作物，也是我国最重要的油料作物之一，其生产的菜籽油占我国食用植物油供给的一半，我国油菜种植面积和产量均居世界第一，然而单产低于加拿大、澳大利亚等国家。影响油菜产量的农艺性状主要有株高、有效分枝数、分枝部位以及开花时间等。分枝数是农作物产量相关的重要株型性状之一，在油菜中，增加单株分枝数可显著增加全株角果数，进而提高单株产量，同时研究发现油菜分枝数与种子产量呈极显著正相关。株高也是作物重要的株型性状，适当降低株高可以提高作物的抗倒伏能力，提高产量和利于机械化收获。矮秆基因已经在水稻和小麦种取得了“绿色革命”的巨大成功。油菜矮秆性状对于抗倒伏和提高产量具有极其重要的意义。
传统的杂交育种为我国油菜单位产量的提高起到关键作用，但是也存在着很多制约因素，如制种效率不高，育种耗时长，劳动强度大以及环境影响大等问题，而如今的植物基因组工程技术则为解决这些难题提供了更多更好的选择。
CRISPR-Cas9原是细菌和古细菌应对外源病毒入侵的防御***，现已经广泛的用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、水稻等的基因改造。它主要由导向序列sgRNA 和Cas9核酸酶两种元件组成，sgRNA可以通过碱基互补识别基因组中特定序列，引导Cas9核酸酶对其DNA双链进行切割，造成双链断裂(DSB)，当细胞通过同源重组(HR)或非同源重组(NHEJ)进行DNA修复，这种不精确的修复方式就可以产生基因的定点突变，造成基因沉默，完成打靶。由于对DNA的剪切依赖于sgRNA于基因组特定序列的配对，因而设计特异性的靶向sgRNA是避免脱靶效应的关键。
虽然CRISPR技术是基因功能研究的利器，也可用于基因编辑以改良农作物，但如在小麦，油菜等多倍体作物中，由于基因在各亚基因组中都有拷贝，这大大提高了CRISPR-Cas9打靶的难度，只有将这些同源拷贝一并沉默掉，才是一次成功的打靶。因而对sgRNA的设计提出了更高的要求：如必须在所有同源基因的保守区域设计或者设计串联的sgRNA靶标位点。
发明内容
本发明的目的在于提供了两种特异性靶向甘蓝型油菜BnMAX1基因的 sgRNA，两种sgRNA设计于该基因的第一外显子中，每条sgRNA都能通过 CRISPR-cas9***介导A和C基因组上BnMAX1基因的剪切，达到基因敲除的目的。
本发明的另一个目的在于提供了一种利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及其应用，通过设计oligo DNA序列和商业化 CRISPR-Cas9载体，能够快速构建BnMAX1基因敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化，筛选获得的BnMAX1基因敲除的突变株可用于油菜性状改良。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用CRISPR-Cas9***特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，该方法包括以下步骤：
(1)根据BnMAX1基因两个拷贝的保守区域设计了两个sgRNA的DNA序列，两个sgRNA都位于BnMAX1基因两个拷贝的第一外显子上，如SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2所示；
(2)根据sgRNA序列和商业化CRISPR-Cas9载体要求，设计合成两对单链oligo DNA序列，其序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6所示；
(3)将两对单链oligo DNA退火形成双链，分别制成Oligo二聚体；
(4)将制备好的Oligo二聚体与商业化CRISPR-Cas9载体连接，然后转化大肠杆菌DH5α，获得两种植物表达载体，分别命名为BnMAX1-Cas9-1和 BnMAX1-Cas9-2；
(5)使用农杆菌介导的方式将BnMAX1-Cas9-1或BnMAX1-Cas9-2载体转化到甘蓝型油菜(比如甘蓝型春油菜862、甘蓝型冬油菜中双6号)中，在转基因后代中筛选A染色体和C染色体均发生BnMAX1基因突变的植株；
分别用于检测BnMAX1基因在A和C染色体组上的两个拷贝的突变方式： A染色体拷贝的鉴定引物的上下游核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8 所示，C染色体拷贝的鉴定引物的上下游核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
(6)根据鉴定引物的扩增结果判定BnMAX1基因两个拷贝是否被成功敲除，选择BnMAX1蛋白功能缺失突变的植株。
采用上述方法在甘蓝型油菜中特异性敲除BnMAX1基因，获得BnMAX1 蛋白功能缺失突变的植株，在此基础上进一步筛选无筛选标记的单株，经表型鉴定与性状考察表明纯合突变株系分枝数显著增多，株高也明显降低，单株角果数、产量都明显增多，可用于改良油菜性状。
本发明利用CRISPR-Cas9***定点敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的两个拷贝，在甘蓝型油菜BnMAX1基因两个拷贝的第一个外显子保守区域选取2个靶标片段并分别构建BnMAX1-Cas9植物表达载体，通过农杆菌侵染的方法导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，在两种sgRNA分别和Cas9核酸酶的共同作用下，都对BnMAX1基因两个拷贝都进行了双链剪切，通过细胞自身修复功能，最终实现了靶标基因片段上的随机***或随机缺失，完成了基因敲除。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明通过根据sgRNA设计的oligo DNA序列和商业化CRISPR-Cas9载体能快速获得目标基因的CRISPR-Cas9敲除载体，简化构建步骤，加快了研究进程。
本发明获得的纯合突变甘蓝型油菜株系，表型鉴定与性状考察表明该株系分枝数显著增多，株高也明显降低，单株角果数、产量等产量性状都明显增多。本发明为培育高产、抗倒伏油菜品种提供了高效的育种方法、种质资源与理论技术支持。
附图说明
图1：BnMAX1-Cas9-1靶标位点
图2：BnMAX1-Cas9-2靶标位点
图3：BnMAX1-Cas9-1及BnMAX1-Cas9-2载体示意图
图4：BnMAX1-Cas9-1转化植株T0代突变单株A03位点核苷酸序列
图5：BnMAX1-Cas9-1T0代有突变单株A03位点测序峰图
图6：BnMAX1-Cas9-1T0代有突变单株C03位点核苷酸序列
图7：BnMAX1-Cas9-1T0代有突变单株C03位点测序峰图
图8：BnMAX1-Cas9-2T0代有突变单株A03位点核苷酸序列
图9：BnMAX1-Cas9-2T0代有突变单株A03位点测序峰图
图10：BnMAX1-Cas9-2T0代有突变单株C03位点核苷酸序列
图11：BnMAX1-Cas9-2T0代有突变单株C03位点测序峰图
图12：无潮霉素抗性BnMAX1-Cas9转化株系突变方式
图13：BnMAX1-Cas9-1-8转化株系表型
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细说明，但不用来限制本发明范围。在不背离本发明构思的前提下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明保护范围。
下述实验例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明均为现有技术中常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实验例中所涉及试验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规试验方法、检测方法等。
实验例1：甘蓝型油菜BnMAX1基因CRISPR-Cas9的sgRNA设计与载体 BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2的构建
1.sgRNA序列确定
甘蓝型油菜为四倍体作物，具有A和C两套基因组，BnMAX1基因在这两套基因组中各有一个拷贝。将这两个拷贝进行序列比对，在保守区域寻找PAM (proto adjacentmotif)基序(NGG)，在PAM位置5’端20bp的一段序列即为 sgRNA序列。本发明设计了两条sgRNA，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示，且均位于第一外显子中，靶标位点如图1、2所示。
2.Oligo DNA单链的合成
本发明使用的CRISPR-Cas9载体构建试剂盒购自杭州百格生物科技有限公司(Cat#BGK01)，因此在设计Oligo DNA单链时，按照试剂盒说明书要求合成：
UP oligo：5’-TGATTG+sgRNA序列-3’
LOW oligo：5’-AAAC+sgRNA反向互补序列+GA-3’
本发明的两对Oligo DNA单链序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，交由武汉擎科生物科技有限公司合成。
3.制备Oligo二聚体
将合成的两对Oligo DNA加水溶解至10μM，分别按下列反应体系混合后，使用PCR仪95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒的速度缓慢降至20℃。
Figure BDA0001814284250000051
4.将Oligo二聚体构建至CRISPR-Cas9载体
两组Oilgo二聚体分别按下列反应体系在冰上混合各个组分，混匀后室温 (20℃)反应1小时。
Figure BDA0001814284250000052
5.转化大肠杆菌
(1)将二组反应体系各取5μl反应液加到100μl的DH5α感受态细胞中，混匀；
(2)冰浴静置30分钟，期间避免晃动，严格保持静置；
(3)轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；
(4)加入600μl LB液体培养基，37℃200rpm复苏培养1小时；
(5)取适量菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。
6.阳性克隆鉴定与质粒提取
分别挑取两组反应长出来的单克隆，接种于LB液体+Kan的培养基，37℃， 200rpm培养过夜后，取一半送至武汉擎科生物技术有限公司，使用载体试剂盒提供的测序引物cas9-F:5’-CCCAGTCAC GACGTTGTAAA-3’进行测序鉴定。将测序鉴定正确的菌液提取质粒，获得目标载体BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1- Cas9-2，载体示意图如图3所示。
实验例2：BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2载体转化农杆菌GV3101
分别将5μl BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2DNA加入到100μl的 GV3101农杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴5分钟，液氮冷冻1分钟后，37℃水浴5分钟，加入700μl液体LB培养基，28℃，200rpm摇床复苏培养4小时。培养结束后，取适量菌液涂布于含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和 50mg/L利福平的LB固体平皿上；28℃培养2天，挑取单克隆，接种于含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基，28℃200rpm培养过夜，然后用 cas9-F引物和相应Low oligo进行PCR鉴定。
鉴定正确的BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2农杆菌菌液与50％甘油混合， -80℃保存。
实验例3：BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2农杆菌分别转化甘蓝型油菜下胚轴
1.外植体准备
以甘蓝型春油菜862(实验室收集的春油菜品系)种子和冬油菜栽培种中双 6号为材料进行种子表面消毒
(1)将种子加入到洁净的50毫升离心管中，用75％酒精浸泡种子5分钟；
(2)倒掉酒精，加入10ml 1.5％升汞，浸泡种子15分钟，期间隔几分钟摇动使液体与种子充分接触；
(3)倒掉升汞，用灭菌单蒸水清洗种子4次左右；
(4)用移液枪将剩余的水吸干，用事先灼烧灭菌的镊子将种子摆入M0培养基中，每瓶50粒种子，每个转化各设6瓶种子；
(5)24度，暗培养5-6天。
2.农杆菌侵染及共培养
(1)将-80℃保存的BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2农杆菌菌液各取 10μl，加入到1ml含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养进行活化；
(2)将暗培养好的苗子取出，放在灭菌的大皿中，用灼烧灭菌好的手术刀切取下胚轴，每段长0.8厘米左右，切时在大皿中倒入少量DM培养基保湿；
(3)将活化好的菌液接到20ml含有卡那霉素、庆大霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃200rpm培养至OD600值到0.4-0.8。用离心机2000 rpm收集菌体，然后加入20ml含有100μM AS的DM培养基，重悬， 28度摇床摇30分钟；
(4)将DM培养基培养了30分钟后的农杆菌菌液加入到切好的下胚轴中，侵染30分钟，期间每隔五分钟左右摇动一次；
(5)将外植体转至放有灭菌滤纸的空培养皿中，铺开，用小滤纸将菌液吸干；
(6)将外植体转到M1培养基中，24℃暗培养两天。
3.筛选及分化
将共培养两天的外植体转入含有5mg/L潮霉素的M2培养基，光照培养3 周左右，此时可以看到外植体染色变深，并开始膨胀变成愈伤组织，之后将外植体转入含有8mg/L潮霉素的M3培养基，光照培养箱培养，光照长度16h/d，每两周继代一次以保证营养充分，至能看到分化出小苗子。
4.生根
将长出小苗子的愈伤转入已灭菌的空皿中，用镊子和手术刀将苗子从愈伤上切下，转入M4培养基光照培养箱，光照长度16h/d。
5.驯化移栽
将生根良好的瓶苗打开封口，拿出光照培养箱，置于温室中3-4天，之后移栽到基质中，并套上干净塑料膜保持湿度。3天后逐渐开孔防风，使植株适应外界环境。
本实验用到的培养基配方如表1所示。
表1培养基配方
Figure BDA0001814284250000071
Figure BDA0001814284250000081
实验例4：转基因植株突变检测
1.转化植株筛选与检测
利用CTAB法提取得到的转基因T0代植株DNA，其中BnMAX1-Cas9-1共获得11株T0代植株，BnMAX1-Cas9-2共获得6株T0代植株，编号后PCR扩增检测转化植株，所用引物为：Hyg-120-F：5’-TGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’， Hyg-971-R：5’-ACTTCTACACAGCCATCGGT-3’，检测T0代转化植株是否含有潮霉素筛选标记。
2.BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2转化株系突变检测
由于BnMAX1基因的两个拷贝分别在A亚基因组第三染色体和C亚基因组第三染色体上，因此设计两对引物A03-JC-F：5’-AACACCCTTCATTACAAAC ACTCA-3’、A03-JC-R：5’-ACTACTATCAATGGTTGCCTCCC-3’和C03-JC-F：5’- GCTTCTCCAGATATTCAGATTT-3’、C03-JC-R：5’-CAGTTTCTGTCGTCTTTT CTTA-3’(如SEQ ID NO.7、8和SEQ ID NO.9、10所示)，PCR产物回收后连接T载体，送测检测BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2转化植株BnMAX1基因两拷贝的序列。测序结果显示11株BnMAX1-Cas9-1转化植株中有5株在A03 位点有***或者缺失 突变，4株在C03位点有***或者缺失 突变，其A03、C03 位点核苷酸序列图4、图6所示，测序峰图如图5、图7所示，6株BnMAX1-Cas9-2 转化植株中，A03位点有4株含有***或者缺失突变，3株在C03位点有***或者缺失 突变，其核苷酸序列图8、图10所示，测序峰图如图9图11所示。
实验例5：转基因T2代群体表型观察、性状统计与无潮霉素标记筛选
BnMAX1-Cas9-1和BnMAX1-Cas9-2的T0代收种后，继续播种种植T1代。在BnMAX1-Cas9-1各T1代株系中，发现BnMAX1-Cas9-1-8和BnMAX1-Cas9-1-11 两个株系分离出有表型植株。在BnMAX1-Cas9-2各T1代株系中，发现BnMAX1- Cas9-2-2、BnMAX1-Cas9-2-3和BnMAX1-Cas9-2-5三个株系分离出有表型植株：直观表型为转化株系底部分枝数增多。使用A03-JC-F/R和C03-JC-F/R引物进行 PCR检测，结果显示，有表型突变均为纯合突变，即BnMAX1基因在A和C基因组上的两个拷贝均被敲除。
同时，利用潮霉素鉴定引物Hyg-120-F：5’-TGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’ Hyg-971-R：5’-ACTTCTACACAGCCATCGGT-3’对BnMAX1-Cas9-1-8的T1代各单株和BnMAX1-Cas9-2-2的T1代各单株进行潮霉素分离鉴定，用于筛选 BnMAX1基因在A和C基因组上的两个拷贝均被敲除同时也没有潮霉素抗性的单株，这种单株由于没有筛选抗性标记，可直接用于生产。BnMAX1-Cas9-1-8的 T1代筛选出一株纯合突变同时无潮霉素抗性单株，BnMAX1-Cas9-2-2的T1代筛选出三株纯合突变同时无潮霉素抗性单株。BnMAX1-Cas9-1-8株系和BnMAX1-Cas9-2-2株系的突变方式如图12所示。
BnMAX1-Cas9-1-8纯合突变单株收种后继续种植T2代进行性状调查和统计：种植20株BnMAX1-Cas9-1-8纯合突变株系单株，同时种植其转化亲本862作为对照，表型如图13所示。在油菜顶端花序完全开完后统计性状如：分枝数、株高，在收获时统计性状如：单株角果数，角果长和角粒数，在种子烘干后统计性状如：单株产量和千粒重。计算平均值，统计结果如表2所示。
表2表性统计结果
Figure BDA0001814284250000091
根据以上拷种数据，可以看出，相对于其亲本，突变转化株BnMAX1-Cas9-1-8 的株高显著降低，分枝数显著增多，同时单株角果数和单株产量也显著提高。拷种结果证明了本发明通过利用CRISPR/Cas***定点敲除甘蓝型油菜 BnMAX1基因获得功能突变株，可以降低油菜的株高，同时提高产量，为油菜高产、抗倒伏育提供了优秀的种质资源和高效的育种方法与理论技术支持。
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 利用CRISPR-Cas9***敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccauagugc uuggcaagaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acuuagccag caugggcaag 20
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgattggcca tagtgcttgg caagaa 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacttcttg ccaagcacta tggcga 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgattgactt agccagcatg ggcaag 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaccttgcc catgctggct aagtga 26
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aacacccttc attacaaaca ctca 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actactatca atggttgcct ccc 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcttctccag atattcagat tt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagtttctgt cgtcttttct ta 22

Claims (6)

1.两种特异性靶向甘蓝型油菜BnMAX1基因的sgRNA，其特征在于，sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.利用CRISPR-Cas9***特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，包括如下步骤：
(1)以权利要求1所述的sgRNA为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火形成双链，分别制成Oligo二聚体；
(2)将Oligo二聚体分别与Cas9载体连接，获得两种植物表达载体；
(3)通过农杆菌介导的方式将任意一种植物表达载体转化甘蓝型油菜；
(4)在转基因后代中筛选A染色体和C染色体均发生BnMAX1基因突变的植株。
3.根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9***特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，其特征在于，根据sgRNA-1设计的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，根据sgRNA-2设计的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。
4.根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9***特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，其特征在于，步骤(4)中用于检测A染色体中BnMAX1基因突变的引物序列如SEQ IDNO.7-8所示，检测C染色体中BnMAX1基因突变的引物序列如SEQ ID NO.9-10所示。
5.根据权利要求2所述的利用CRISPR-Cas9***特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，其特征在于，进一步筛选无筛选标记的单株，作为种质资源直接用于育种生产。
6.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2所述的方法在改良油菜性状中的应用，包括增加油菜分枝数、增加单株角果数、降低油菜高度、增加产量。
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