CN109265541A - 流感中和药剂 - Google Patents

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维斯瓦纳坦·萨西赛哈兰
文卡塔拉曼·桑达拉拉詹
拉姆·萨西赛哈兰
维迪亚·苏布拉马尼亚安
卡纳安·塔拉卡拉曼
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Abstract

本申请涉及流感中和药剂。本发明提供结合至多种流感病毒株的抗体(例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体等等)。这些抗体适用于例如流感的预防、治疗、诊断和/或研究。

Description

流感中和药剂
本申请是申请日为2013年3月14日、申请号为201380024604.3、发明名称为 “流感中和药剂”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参照
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2012年5月10日提交的美国临时申请第 61/645,453号的权益，该申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本发明说明书引用序列表(2013年3月14日以名为“Sequence Listing.txt”的.txt 文件递交)。所述.txt文件是在2013年3月11日生成，并且大小为39.3kb。序列表的 全部內容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请涉及流感中和药剂。
背景技术
流感病毒是造成每年逾300,000例死亡的全球性健康威胁。所述病毒通过参与以下 各者的组合而逃避免疫识别：加快抗原性漂移、域再分类、遗传重组，及其表面糖蛋 白基于糖基化的遮蔽。病毒的此快速突变能力在当前H1N1‘猪流感’传染病威胁日益 增长以及震惊全世界的最近突然爆发高致病性禽H5N1‘禽流感’流感病毒株感染的背 景下尤甚。(克哈纳(Khanna)等人,生物科学杂志(Journal of Biosciences),33(4):475, 2008；松达拉简(Soundararajan)等人,自然生物技术(Nature Biotechnology)27:510, 2009)。此外，上个世纪主要流感传染病中的两种传染病来源于禽流感病毒，所述禽流 感病毒的遗传学组成已发生变化，导致人感染。
需要开发出有效的抗流感预防药及治疗剂。而且，鉴于这些流感病毒演变的高度不可预测性，因此特别需要开发对各种株系均有效(例如“通用”或“广谱”)的抗流 感预防药及治疗剂。这些有效抗流感药剂，尤其是这些通用或广谱抗流感药剂，可替 代或加强设计成靶向传播中的特定‘季节性’病毒株的疫苗(艾克特(Ekiert)等人,科学 (Science),324(5924):246,2009以及苏伊(Sui)等人,自然结构与分子生物学(Nat Struct MolBiol.)16(3):265,2009)。或者或另外，需要开发出可替代或加强现有抗病毒疗法的 有效抗流感预防药或治疗剂。针对现有抗病毒剂达菲/乐感清(Tamiflu/Relenza)(NA抑 制剂)及金刚烷胺/金刚烷乙胺(Amantadine/Rimantadine)(MP-2抑制剂)出现的抗药性强 调了这些药剂的重要性(考林(Collins)等人,自然(Nature)453:1258；斯特佛(Stouffer)等人,自然(Nature),451:596,2008；皮纳克(Pielak)等人,美国国立科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),106:7379,2009)。举例来说，在2011/2012流感季节中，逾98％及 100％的H1N1病毒株分别对达菲及金刚烷衍生物(金刚烷胺/金刚烷乙胺)具有抗药性。
发明内容
本发明提供新颍的流感结合剂。其中，本发明提供结合至多种流感病毒株的流感结合剂。本发明特别提供结合至流感红血球凝集素(HA)的结合剂。本发明尤其提供结 合至流感HA的某些抗体。在一些实施例中，这些抗体的特征为结合至来自群组1病 毒、群组2病毒或在一些实施例中来自两者的特定HA抗原決定基和/或HA。在一些实 施例中，所提供的抗体结合至选自由以下各亚型的HA多肽组成的群组的HA：亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 及其组合。在一些实施例中，所提供抗体的特征为能够中和群组1病毒、群组2病毒 的感染或在一些实施例中能够中和两者的感染。在一些这样的实施例中，这些所提供 抗体显示的中和IC50(ug/ml)在本文所述和/或所例示的范围内。在一些实施例中，这些 所提供抗体显示的中和IC50(ug/ml)的下限为约0.1ug/ml并且上限为约10ug/ml。在一 些实施例中，这些所提供抗体显示的中和IC50(ug/ml)的下限选自由以下组成的群组： 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、 1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ug/ml或更大，而其上限高于下 限并且选自由以下组成的群组：1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0ug/ml或更大。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以小于2000nM、小于1500nM、小于 1000nM、小于500nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM、小 于150nM、小于125nM、小于100nM、小于75nM或小于50nM的KD(nM)结合至 流感HA(例如群组1和/或群组2亚型)。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以下限为约0.01×105M-1s-1而上限为约1.0×106M-1s-1的Ka(M-1s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA， 其中Ka(M-1s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、 0.04×105、0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、 1.2×105、1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105M-1s-1或更大，而其上限高于下限并且选 自由以下组成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、 4.5×105、5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、 9.0×105、9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、 1.7×106、1.8×106、1.9×106M-1s-1或更大。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以下限为约0.01×105s-1而上限为约1.0×106 s-1的Kd(s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA，其中Ka(s-1)的下 限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、0.04×105、0.08×105、 0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、1.2×105、1.4×105、1.6×105、 1.8×105、2.0×105s-1或更大，而其上限高于下限并且选自由以下组成的群组： 1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、4.5×105、5.0×105、5.5×105、 6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、9.0×105、9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106s-1或更大。
本发明还对赋予特定功能属性(例如HA结合、中和、亚型特异性等)的某些所提供抗体的结构特征进行了定义。本发明因此提供与这些所提供抗体具有这些共同结构特 征并且在一些实施例中因此与这些所提供抗体还具有共同功能属性的结合剂。举例来 说，在一些实施例中，本发明提供与某些所提供抗体中的一或多者具有共同结构特征 以及功能属性的结合剂，这些抗体具有如本文表格2和/或表格3中所列的氨基酸序 列。
在一些实施例中，这些所提供特定抗体的这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中的对应CDR或FR(SEQ ID NO:1-60)至少80％一致的一或多个CDR或一或多个 FR。在一些实施例中，这些所提供特定抗体的这些结构特征包括序列与表格2以及表 格3中的对应CDR和/或FR(SEQ ID NO:1-60)一致的一和/或多个CDR和/或一和/或多 个FR。在一些实施例中，这些所提供特定抗体的这些结构特征包括序列与表格2以及 表格3中所列序列(SEQID NO:1-60)一致的CDR及FR。
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR及FR序列元件，这些序列元件各自与 表格2和/或表格3中所列的CDR或FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对 于所述参考序列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2和/或表3中的 对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，所包括的CDR以及FR序列元件 在CDR以及FR序列中总共含有不超过18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括CDR以及FR 序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO: 1-60)，这些序列元件总共含有不超过18个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括 CDR以及FR序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元 件(SEQ ID NO:1-60)，这些序列元件总共含有不超过15个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括FR序列元件，所述FR序列元件与表格2和/ 或表格3中所列的FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列元 件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应FR参考序列 元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的FR序列元件在FR序列中含有不超过18、17、16、 15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR序列元件，所述CDR序列元件与表格2 和/或表格3中所列的CDR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序 列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应CDR参 考序列元件(SEQID NO:1-60)，所包括的CDR序列元件在CDR序列中含有不超过 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH序列元件，所述VH序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VH序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VH-1、VH-2、VH-3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、 VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH-14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL序列元件，所述VL序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VL序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL-6、VL-7、VL-8、VL-9、VL- 10、VL-11或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括与以下对应的结构元件：VH-1、VH-2、VH- 3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH- 14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者，与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL- 6、VL-7、VL-8、VL-9、VL-10、VL-11或其片段中的任一者的组合。在一些实施例 中，VH-1(SEQ ID NO:1)与VL-1(SEQ ID NO:33)组合。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参 考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44- 54)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参 考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55- 58)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参 考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59- 60)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH框架区序列元件，其显示与表格2中的 VH参考框架区序列元件(SEQ ID NO:1-16)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL框架区序列元件，其显示与表格3中的 VL参考框架区序列元件(SEQ ID NO:33-43)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
在一些实施例中，本发明提供结合剂，所述结合剂包括这些所提供特定抗体的这些结构特征，使得所提供的结合剂与所提供的特定抗体具有共同的功能属性，从而使 其结合至选自由以下组成的群组的流感HA：群组1亚型、群组2亚型以及其组合。
在一些实施例中，所提供的结合剂显示的流感中和IC50(ug/ml)在本文针对所提供特定抗体所述的范围内。在一些实施例中，所提供的结合剂对于群组1亚型、群组2 亚型流感病毒或两者均显示这种IC50(ug/ml)。在一些实施例中，所提供结合剂的特征 为流感中和IC50(ug/ml)在本文所述和/或例示范围内之功能属性。在一些实施例中，这 些所提供结合剂显示下限为约0.1ug/ml而上限为约10ug/ml的中和IC50(ug/ml)。在一 些实施例中，这些所提供结合剂显示的中和IC50(ug/ml)的下限选自由以下组成的群 组：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、 1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ug/ml或更大，而上限高 于下限并且选自由以下组成的群组：1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0ug/ml或更大。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以小于2000nM、小于1500nM、小于1000nM、小于500nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM、小 于150nM、小于125nM、小于100nM、小于75nM或小于50nM的KD(nM)结合至 流感HA(例如群组1和/或群组2亚型)。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以下限为约0.01×105M-1s-1而上限为约1.0×106M-1s-1的Ka(M-1s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA， 其中Ka(M-1s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、 0.04×105、0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、 1.2×105、1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105M-1s-1或更大，而其上限高于下限并且选 自由以下组成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、 4.5×105、5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、 9.0×105、9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106M-1s-1或更大。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以下限为约0.01×105s-1而上限为约1.0×106s-1的Kd(s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA，其中Ka (s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、0.04×105、 0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、1.2×105、 1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105s-1或更大，而其上限高于下限并且选自由以下组 成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、4.5×105、 5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、9.0×105、 9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、 1.8×106、1.9×106s-1或更大。
在一些实施例中，本发明提供一种结合剂，其包括这些所提供特定抗体的这些结构特征，使得所提供的结合剂与所提供特定抗体具有共同的功能属性，从而使其与表 格2及表格3中所列的一或多种抗体(SEQ ID NO:1-60)竞争结合至至少一种HA多肽。 在一些实施例中，所提供的结合剂具有这些结构特征，以便其与表格2及表格3中所 列的一或多种抗体(SEQ ID NO:1-60)竞争结合至多种不同HA，所述多种不同HA多肽 包括以至少2种不同HA亚型基因型发现的HA多肽蛋白质。
在一些实施例中，所提供结合剂的特征为结合至亚型H1、H2、H3、H4、H5、 H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的HA多肽中的一或 多者的功能属性。在一些实施例中，所提供的结合剂结合至亚型H1、H3、H5、H7以 及H9中的至少两种HA多肽。
在一些实施例中，所提供结合剂的特征为结合至HA多肽的MPER区域中的一或 多个抗原表位的功能属性。在一些实施例中，所提供结合剂的特征为结合至HA多肽 的MPER区域中的一或多个与糖基化无关的抗原表位的功能属性。在一些实施例中， 所提供结合剂的特征为结合至HA多肽的HA-1(头)和/或HA-2(柄)域中的一或多个抗 原表位的功能属性。在一些实施例中，所提供结合剂的特征为结合至HA-1/HA-2界面 膜近侧抗原表位区域(membrane proximal epitope region，MPER)内的一或多个抗原表位 的功能属性。在一些实施例中，所提供结合剂的特征为结合至位于典型α螺旋和/或其 邻近残基内的一或多个抗原表位的功能属性。
在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含多肽。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含抗体或其片段。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含单克隆抗体 或其片段。在一些实施例中，结合剂是或包含“全长”抗体，原因在于其含有两条重 链以及两条轻链，所述两条重链以及两条轻链任选地经二硫键结合，如同天然产生的 抗体。在一些实施例中，结合剂是或包含全长抗体的片段，原因在于其含有全长抗体 中所发现的一些，而非全部的序列。举例来说，在一些实施例中，结合剂是或包含抗 体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双抗体以及Fd片段。 在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含抗体，所述抗体是选自由以下组成的群组 的抗体类别的成员：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或其片段。在一些实施例中，所提供 的结合剂是或包含通过化学合成产生的抗体。在一些实施例中，所提供的结合剂是或 包含通过细胞产生的抗体。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含具有人恒定域 和/或可变区域的嵌合抗体，例如来自小鼠、大鼠、马、猪或其它物种的嵌合抗体。
在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含具有抗体CDR的多肽。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含用于呈现一或多个CDR的支架域(scaffolding domain)， 比如蛋白质A、脂质运载蛋白(lipoclins)、锚蛋白(ankryin)共同重复域、硫氧还原蛋 白、纤连蛋白、抗运载蛋白、生替素(centyrin)、高亲和性多聚体域(avimer domain)、泛 素、锌指DNA结合蛋白(zinc finger DNA-binding proteins，ZEP)，或IgNAR。在一些 实施例中，所提供的结合剂是或包含胱氨酸结微型蛋白。在一些实施例中，所提供的 结合剂是或包含高亲和性抗体(双抗体、三抗体、四抗体)。在一些实施例中，所提供的 结合剂是或包含蝎子形结构(Scopion)，其中所述蝎子形结构包含两个通过免疫球蛋白 Fc域分隔的结合部分。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含仅包含重链的VHH (也就是抗原特异性VHH)抗体。在一些实施例中，VHH来源于美洲驼或其它骆驼科抗 体(例如骆驼科IgG2或IgG3，或来自这些骆驼科Ig的CDR呈现框)。在一些实施例 中，这种VHH来源于鲨鱼。
在一些实施例中，所提供结合剂是或包含一或多种“小型抗体”或“微型抗体”， 其是在C末端包括寡聚域的sFv多肽链，通过铰链区与sFv分隔。在一些实施例中， 铰链区包含自结合型α螺旋或白氨酸拉链，其可以或可不通过额外的二硫键进一步稳 定。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含肽模拟物。在一些实施例中，所提供 的结合剂是或包含模拟抗原表位。
在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含偶联物，其中含有结合剂部分(包含结合剂或其功能部分或由结合剂或其功能部分组成)与所偶联部分。在一些实施例中，这 种所偶联部分是实体。在一些实施例中，这种实体是选自由以下组成的群组的化学类 别：多肽、碳水化合物、脂质、小有机分子、有机聚合物、无机聚合物、金属、离 子、同位素或其组合。在一些实施例中，这种所偶联部分是或包含治疗性或诊断性负 载。在一些实施例中，这种所偶联部分是或包含可检测的负载。在一些实施例中，这 种所偶联部分是或包含可检测的实体。在一些实施例中，这种所偶联部分是或包含亲 和剂。在一些实施例中，这种所偶联部分是或包含靶向剂。在一些实施例中，这种所 偶联部分是或包含遮蔽剂和/或稳定剂。在一些实施例中，所提供的偶联物包含单一结 合剂部分以及多种偶联部分；在一些实施例中，这些多种偶联部分包含多种相同的偶 联部分；在一些实施例中，这些多种偶联部分包括两种或两种以上不同偶联部分，任 选地具有不同类型(例如治疗性负载、可检测负载、靶向剂、亲和剂等)。
在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含核酸，比如DNA或RNA。在一些实 施例中，核酸经设计可模拟血球凝集素(HA)多肽内的抗原表位。在一些实施例中，核 酸经设计可模拟一或多种流感HA多肽亚型内的保守抗原表位。在一些实施例中，所 提供的结合剂是或包含一或多种寡核苷酸。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包 含一或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含二级结构，比如环、发夹、折叠或其组合。 在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含一或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含高 阶(三阶或四阶)结构。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含适体。
在一些实施例中，本发明提供表达如本文所述的结合剂的细胞或细胞系。在一些实施例中，这种细胞或细胞系是哺乳动物细胞或细胞系。在某些实施例中，这种细胞 或细胞系是融合瘤。
在一些实施例中，本发明提供一种治疗患者的方法，所述方法包含根据疗法将包含本文所述结合剂的组合物以适于递送的单位剂型投予罹患或易受流感感染的患者的 步骤，所述疗法与发病率和/或严重度降低相关，且/或与流感感染的一或多种表现或影 响的发作延迟相关。
在一些实施例中，本发明提供一种试剂盒，其在包含一或多个容器的配置中包含经配制以便借助于投药装置投予、连同这种投药装置一起的如本文所述的至少一种结 合剂。在一些实施例中，适当的投药装置选自由以下组成的群组：针筒、针、施用器 以及其组合。在一些实施例中，所提供的试剂盒包括使用说明书。
所提供的结合剂、组合物以及方法适用于例如研究和/或医药中。在一些实施例中，所提供的结合剂、组合物以及方法适用于例如流感的预防、治疗、诊断和/或研 究。举例来说，在一些实施例中，所提供的结合剂或组合物投予罹患或易受流感感染 的个体。在一些实施例中，在已知暴露于流感或暴露于特定流感亚型或病毒株之前， 投予所提供的结合剂或组合物。在一些实施例中，在已知暴露于流感或暴露于特定流 感亚型或病毒株之后，投予所提供的结合剂。在一些实施例中，在流感感染的影响或 症状表现之前，或在流感感染(包括一或多种特定流感亚型或病毒株的流感感染)的一或 多种特定影响或症状表现之前，投予所提供的结合剂或组合物。在一些实施例中，在 流感感染的影响或症状表现之前，或在流感感染(包括一或多种特定流感亚型或病毒株 的流感感染)的一或多种特定影响或症状表现之前，投予所提供的结合剂或组合物。
在一些实施例中，所提供的结合剂或组合物与一或多种其它抗流感疗法和/或对流 感感染之症状(例如发炎、发烧、恶心、体重降低、食欲丧失、呼吸促迫、心率增加、 高血压、身体痛、肌肉疼痛、眼痛、疲劳、不适、干咳、流鼻涕和/或咽喉痛)有作用的 一或多种其它疗法组合投予个体。
附图说明
一起构成图式的下述诸图仅用于说明目的，而非限制。
图1描绘哺乳动物抗体的不同部分、区域以及域的示意结构。
图2A以及图2B描绘例示性抗体的HA结合亲和力。图2A(顶图)显示所描绘的特 定抗体以有差异的结合亲和力结合至群组1和群组2HA亚型；并且图2A(底图)以及 图2B显示抗体特异性结合至HA。
图3A至图3E描绘例示性抗体在一系列浓度下的HA结合亲和力以及动力学。特 定抗体以有差异结合亲和力以及动力学结合至群组1和群组2HA亚型。
图4描绘例示性抗体的HA结合亲和力以及中和作用。特定抗体在6种不同剂量 下抑制PR8病毒(H1N1)流感病毒诱导病毒斑产生。
图5呈现例示性抗体与PR8一起预培育对MDCK细胞感染性的影响。感染后， MDCK细胞和不同浓度的抗体一起在无病毒的培养基中生长48小时，随后使用病毒专 用的引子、通过实时PCR对病毒滴度进行量化，以计算IC50值。
图6呈现在H1N1攻击下经例示性抗体处理的小鼠的数据。在这种攻击下，经例 示性抗体处理的小鼠在感染后的体重降低百分比低于未处理对照组。
图7呈现小鼠的H1N1攻击数据。正如所见，相较于使用PBS对照物所观察的情 况，例示性抗体延迟小鼠中的H1N1感染发展。在例示性抗体存在下观察到的感染性 (也就是感染症状的发作速度)减弱可与使用抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)所见的情况 相比。
图8呈现在H1N1攻击下经例示性抗体处理的小鼠的数据。在这种攻击下，经例 示性抗体处理的小鼠在感染后显示体重恢复。
图9描绘在例示性抗体处理的小鼠中所观察到的药物动力学概况。用例示性抗体处理后，随着时间收集血清样品并且根据抗体浓度进行评价。
图10A至图10B显示例示性VH(图10A)与VL(图10B)序列的比对情况。每个例 示性序列也显示于表格2和/或表格3中。
具体实施方式
定义
亲和性：正如此项技术中所知，“亲和性”是特定配体(例如抗体)结合至其搭配物(例如抗原表位)的紧密性量度。亲和性可用不同方式测量。
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”就其广义来说，是指可合并成多肽链的任 何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通式结构H2N-C(H)(R)-COOH。在 一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基 酸；在一些实施例中，氨基酸是d型氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l型氨基酸。 “标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的二十种标准l型氨基酸中的任一种。 “非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，不管其是用合成方式制备，还 是获自天然来源。如本文所用，“合成氨基酸”包涵经化学修饰的氨基酸，包括(但不限 于)盐、氨基酸衍生物(比如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基末端和/或胺基末 端氨基酸)可通过以下方式修饰：甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基，和/或用可改变肽 循环半衰期而对其活性无不利影响的其它化学基团取代。氨基酸可以参与二硫键。氨 基酸可以包含一个或转译后修饰，比如与一或多个化学实体结合(例如甲基、乙酸酯 基、乙酰基、磷酸酯基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂 质部分、碳水化合物部分、生物素部分等等)。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互 换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。根据使用术语的背景，显而易 见其是指游离氨基酸，还是肽的残基。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动 物”是指任一性别并且处于任一发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”是指处于任 一发育阶段的非人动物。在某些实施例中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿动物、小 鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物 包括(但不限于)哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在某些实 施例中，动物易感染流感。在一些实施例中，动物可为转基因动物、经遗传工程改造 的动物和/或克隆。
抗体：如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白的结构特征的多肽，正如 此项技术中所了解。正如在本质上由哺乳动物细胞产生，免疫球蛋白具有图1中所描 绘的结构。典型的免疫球蛋白(抗体)结构单元已知包含四聚体。每个四聚体由两对相同 的多肽链组成，每对多肽链具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70 kD)。每条链的N末端界定具有约100至110或更多氨基酸的可变区，所述可变区主要 担负抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。 每个可变区进一步细分成高变区(HV)以及框架区(FR)。高变区包含三个超变序列区 域，称为互补决定区(CDR 1、CDR 2以及CDR3)，所述互补决定区被四个框架区 (FR1、FR2、FR2以及FR4)分隔，所述四个框架区形成β片状结构并且充当使HV区 保持在适当位置的支架。每条重链和轻链的C末端界定恒定区，所述恒定区由轻链 (CL)的一个域和重链的三个域(CH1、CH2以及CH3)组成。在许多实施例中，抗体是多 肽，其氨基酸序列包括所属领域的技术人员认定为互补决定区(CDR)的一或多个结构元 件。在一些实施例中，抗体是多肽，其氨基酸序列包括所述领域的技术人员认定为免 疫球蛋白可变域的结构元件。在一些实施例中，抗体是“全长”抗体，原因在于其含 有两条重链和两条轻链，这些重链和轻链任选地通过二硫键结合，如同天然产生的抗 体。在一些实施例中，抗体是全长抗体的片段，原因在于其含有全长抗体中所发现的 一些，而非全部的序列。举例来说，在一些实施例中，抗体片段的实例包括(但不限于) Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双抗体以及Fd片段。在一些实施例中，抗体是选 自由以下组成的群组的抗体类别中的成员：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。在一些实 施例中，抗体是通过化学合成产生。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实 施例中，抗体是多克隆抗体。在一些实施例中，抗体是由细胞产生。在一些实施例 中，抗体是通过化学合成产生。在一些实施例中，抗体来源于哺乳动物。在一些实施 例中，抗体来源于动物，比如(但不限于)小鼠、大鼠、马、猪或山羊。在一些实施例 中，抗体是使用重组细胞培养***产生。在一些实施例中，抗体是具有人恒定域和/或 可变区域的嵌合抗体，例如来自小鼠、大鼠、马、猪或其它物种的嵌合抗体。在一些 实施例中，抗体来源于人。在一些实施例中，抗体是多克隆抗体。在一些实施例中， 抗体是人源化抗体。
约：如本文所用，术语“约”或“大约”，如应用于一或多个所关注数值，是指数 值类似于所述参考数值。在某些实施例中，术语“约”或“大约”是指在任一方向上 (大于或小于)落入所述参考数值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、 13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或小于1％范围 内的数值范围，除非另有说明或根据背景显而易见(这种数字超过可能数值的100％的 情况除外)。
结合剂：如本文所用，术语“结合剂”是指能够结合至抗原或生物靶的药剂。在 一些实施例中，结合剂包含蛋白质。在一些实施例中，结合剂是或包含天然存在的蛋 白质。在一些实施例中，结合剂来源于细胞或病毒。在一些实施例中，结合剂是合成 蛋白质或化学合成的蛋白质。在一些实施例中，结合剂包含天然氨基酸。在其他实施 例中，结合剂包含一或多个非天然氨基酸。在一些实施例中，结合剂包含天然氨基酸 与非天然氨基酸的组合。在一些实施例中，结合剂包含一条、两条或两条以上共价或 非共价结合的多肽链。在一些实施例中，结合剂可连接到更长多肽链或可为更长多肽 链的一部分，只要结合剂保持其用于交互作用的三维结构以及排列。在一些实施例 中，结合剂可附接到作为或不为结合剂的另一个多肽序列的N末端或C末端。在一些 实施例中，结合剂可并入作为或不为结合剂的另一个多肽序列中，借此将多肽序列分 成两个或两个以上区段。
在一些实施例中，结合剂是一种蛋白质，所述蛋白质具有类似于抗体的功能并且能够结合至特异性抗原以形成复合物并且引发生物反应(例如促进或拮抗特定生物活性)。在一些实施例中，结合剂是抗体。在一些实施例中，结合剂是或包含“全长”抗 体，原因在于其含有两条重链以及两条轻链，所述两条重链以及两条轻链任选地经二 硫键结合，如同天然产生的抗体。在一些实施例中，结合剂是或包含全长抗体的片 段，原因在于其含有全长抗体中所发现的一些，而非全部的序列。举例来说，在一些 实施例中，结合剂是或包含抗体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、 Fv、dsFv双抗体以及Fd片段。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含仅包含重链 的VHH(也就是抗原特异性VHH)抗体。在一些实施例中，VHH来源于美洲驼或其它 骆驼科抗体(例如骆驼科IgG2或IgG3，或来自这些骆驼科Ig的CDR呈现框)。在一些 实施例中，VHH来源于鲨鱼。在一些实施例中，所提供结合剂是或包含一或多种“小 型抗体”或“微型抗体”，其是在C末端包括寡聚域的sFv多肽链，通过铰链区与sFv 分隔。在一些实施例中，铰链区包含自结合型α螺旋或白氨酸拉链，其可以或可不通 过额外的二硫键进一步稳定。
在一些实施例中，结合剂是支架蛋白，比如(但不限于)蛋白质A、脂质运载蛋白、锚蛋白共同重复域、硫氧还原蛋白、纤连蛋白、抗运载蛋白、生替素、高亲和性多聚 体域、泛素、锌指DNA结合蛋白(ZEP)或IgNAR。在一些实施例中，结合剂是支架蛋 白，其中支架蛋白经工程改造可呈现一或多个CDR。在一些实施例中，所提供的结合 剂是或包含胱氨酸结微型蛋白。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含高亲和性 抗体(双抗体、三抗体、四抗体)。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含 Scopion，其中所述Scorpion结构包含两个通过免疫球蛋白Fc域分隔的结合部分。在 一些实施例中，所提供的结合剂是或包含肽模拟物。在一些实施例中，所提供的结合 剂是或包含钩环肽。
在一些实施例中，结合剂包含能够结合至所选结合部位的药剂。在一些实施例中，结合剂能够结合至血球凝集素(HA)多肽中的所选结合部位。在一些特定实施例 中，结合剂能够结合至HA多肽的膜近侧抗原表位区域(MPER)中的所选结合部位。在 一些特定实施例中，结合剂能够结合至HA多肽的HA-1(头)和/或HA-2(柄)域中的所 选结合部位。在一些特定实施例中，结合剂能够结合至HA-1/HA-2界面膜近侧抗原表 位区域(MPER)中的所选结合部位。
在一些实施例中，结合剂是能够与结合靶通过与一或多个靶残基交互作用来结合的药剂。在一些实施例中，这些靶残基是氨基酸、醣类或其组合。在一些特定实施例 中，结合剂能够结合至经修饰的HA多肽，比如(但不限于)N连接型聚糖、唾液酸化聚 糖和/或其组合。
在一些实施例中，结合剂是一种药剂，其能够与流感病毒竞争结合至HA多肽， 使得流感病毒与HA多肽之间的结合减少至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4 倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11 倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少 18倍、至少19倍或至少20倍。在一些实施例中，结合剂是一种药剂，其能够与流感 病毒竞争结合至HA受体上的聚糖，使得流感病毒与HA受体上的聚糖之间的结合减少 至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少 8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少 15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍或至少20倍。
在一些实施例中，结合剂是或包含核酸，比如DNA或RNA。在一些实施例中， 结合剂包含一或多个寡核苷酸。在一些实施例中，结合剂是或包含一或多个寡核苷 酸，所述寡核苷酸包含二级结构，比如环、发夹、折叠或其组合。在一些实施例中， 结合剂是或包含一或多个寡核苷酸，所述寡核苷酸包含高阶(三阶或四阶)结构。在一些 实施例中，结合剂是核酸，其形成的结构经设计可模拟血球凝集素(HA)多肽内所发现 的抗原表位。在一些实施例中，结合剂是核酸，其形成的结构经设计可模拟一或多种 流感HA多肽亚型内所发现的保守性抗原表位。在一些实施例中，结合剂是或包含适 体。
生物学活性：如本文所用，习语“生物学活性”是指在生物***(例如细胞培养 物、生物体等等)中具有活性的任何物质的特性。举例来说，投予生物体时对所述生物 体具有生物学作用的物质视为生物学活性。在特定实施例中，在蛋白质或多肽具有生 物学活性的情况下，与蛋白质或多肽共有至少一种生物学活性的蛋白质或多肽的一部 分典型地称为“生物学活性”部分。
广谱：如本文所用，习语“广谱”是指药剂结合来自不同流感病毒株的各种HA 多肽。在一些实施例中，广谱药剂结合至多种不同HA多肽。这些例示性HA多肽包括 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或 H16多肽，或其组合。在一些实施例中，所提供的药剂是广谱药剂，原因在于其结合 至来自至少两种不同的病毒分化枝或群的HA多肽。在一些实施例中，所提供的药剂 是广谱药剂，原因在于其结合至来自所有已知病毒分化枝的HA多肽。在一些实施例 中，所提供的药剂是广谱药剂，原因在于其结合至来自群组1以及群组2流感病毒的 HA多肽。在一些实施例中，广谱是指药剂结合至一些或所有类型的HA多肽，所述 HA多肽介导特定宿主的感染，例如鸟禽、骆驼、犬、猫、麝猫、马、人、美洲豹、水 貂、小鼠、海豹、石貂、猪、虎、鲸等等。
特征部分：如本文所用，术语物质的“特征部分”就广义而言，是相对于完整物 质来说共有某种程度的序列或结构一致性的部分。在某些实施例中，特征部分与完整 物质共有至少一种功能特征。举例来说，蛋白质或多肽的“特征部分”是含有连续氨 基酸段或许多连续氨基酸段的部分，所述氨基酸段共同为蛋白质或多肽所特有的。在 一些实施例中，每个这种连续段一般含有至少2、5、10、15、20、50或更多个氨基 酸。总的来说，物质(例如蛋白质、抗体等等)的特征部分是除上文说明的序列和/或结 构一致性之外，与相关完整物质共有至少一种功能特征的部分。在一些实施例中，特 征部分可具生物学活性。
特征序列：“特征序列”是在多肽或核酸家族的所有成员中发现的序列，因此可供所述领域中的普通技术人员用于界定家族成员。
组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指那些情形，其中两种或两种以上 不同药剂在重叠方案中投予，以便受检者同时暴露于两种药剂。
剂型：如本文所用，术语“剂型”以及“单位剂型”是指用于治疗患者的治疗性 蛋白质(例如抗体)的实体离散单元。每个单元含有经计算可产生所想要治疗性作用的预 定量的活性物质。然而，应了解，组合物的总剂量将由主治医师在正确医疗判断的范 围内决定。
给药方案：“给药方案”(或“治疗方案”)，正如这个术语在本文中所用，是个别 投予受检者(典型地相隔一段时间)的一组单位剂量(典型地超过一个单位剂量)。在一些 实施例中，所给予的治疗剂有推荐的给药方案，其可以涉及一或多个剂量。在一些实 施例中，给药方案包含多个剂量，每个剂量彼此相隔相同的时间长度；在一些实施例 中，给药方案包含多个剂量并且个别剂量相隔至少两种不同时段。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指一或多个以下事件：(1)由DNA序列 产生RNA模板(例如通过转录来产生)；(2)加工RNA转录物(例如通过拼接、编辑、5' 帽形成，和/或3'端形成)；(3)RNA转译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的转译 后修饰。
功能：如本文所用，“功能”生物分子是一种生物分子，其所呈的形式展现其特性化的特性和/或活性。
基因：如本文所用，术语“基因”具有如此项技术中所了解的含义。所述领域中 的普通技术人员将了解，术语“基因”可包括基因调控序列(例如启动子、增强子等等) 和/或内含子序列。将进一步了解，基因定义包括提及不编码蛋白质、而是编码功能性 RNA分子(比如tRNA、RNAi诱导剂等等)的核酸。为了明晰起见，我们指出，如本申 请中所用，术语“基因”泛指编码蛋白质的核酸的一部分；所述术语可任选地涵盖调 控序列，正如所述领域中的普通技术人员根据上下文所明了。不希望这个定义排除术 语“基因”应用于编码非蛋白质的表达单元，而是阐明在大多数情况下，如本文件中 所用的术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物或表达产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”泛指由基 因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修 饰后)。
血球凝集素(HA)多肽：如本文所用，术语“血球凝集素多肽”(或“HA多肽”)是 指氨基酸序列包括HA的至少一种特征序列的多肽。来自流感分离株的多种HA序列在 所述领域中已为我们所知；实际上，国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information，NCBI)维护的数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)到本申请提交时为止包括9796种HA序列。所述领域中的普通技术人 员参考这个数据库可容易鉴别出一般HA多肽和/或特定HA多肽(例如H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16多肽)特有的 序列；或介导感染特定宿主(例如鸟禽、骆驼、犬、猫、麝猫、环境、马、人、美洲 豹、水貂、小鼠、海豹、石貂、猪、虎、鲸等等)的HA多肽特有的序列。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，聚 合物分子若其序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％一致，则视为彼此“同源”。在一些实施例 中，聚合物分子若其序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、 65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相似，则视为彼此“同源”。
一致性：如本文所用，术语“一致性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，计算两个 核酸序列的一致性百分比可通过根据最佳比较目的比对两个序列来执行(例如可将间隙 引入第一核酸序列与第二核酸序列之一或两者中用于最佳比对并且可不考虑将不一致 序列用于比较目的)。在某些实施例中，根据比较目的比对的序列长度为参考序列长度 的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至 少95％或实质上100％。接着比较相应核苷酸位置上的核苷酸。若占据第一序列中的位 置的核苷酸与第二序列中的相应位置相同，则所述位置处的分子相同。两个序列之间 的一致性百分比是序列所共有的相同位置数目的函数(考虑需要引入以实现两个序列最 佳比对的间隙数目以及每个间隙的长度)。序列比较以及测定两个序列之间的一致性百 分比可使用数学算法完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用已 并入ALIGN程序(2.0版)中的迈尔(Meyers)以及密勒(Miller)的算法(CABIOS,1989,4:11- 17)、使用PAM120权重残基表格、间隙长度罚分12以及间隙罚分4来测定。或者，两 个核苷酸序列之间的一致性百分比可使用采用NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包中 的GAP程序测定。
分离：如本文所用，术语“分离”是指(1)已与最初产生(不论在自然界中和/或在实验装置中)时结合的至少一些组分分离，和/或(2)已通过人工产生、制备和/或制造的物 质和/或实体。所分离的物质和/或实体可与和其最初结合的其他组分中的约10％、约 20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约 92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％分 离。在一些实施例中，所分离的药剂具有约80％、约85％、约90％、约91％、约 92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯 度。如本文所用，一种物质若其实质上不含其它组分，则为“纯的”。如本文所用，计 算所分离物质和/或实体的纯度百分比不应包括赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等等)。
模拟抗原表位：如本文所用，术语“模拟抗原表位”是指模拟抗原表位结构的巨 大分子。在一些实施例中，模拟抗原表位引发的抗体反应与其相应抗原表位所引发的 抗体反应相同或相似。在一些实施例中，识别抗原表位的抗体也识别模拟所述抗原表 位的模拟抗原表位。在一些实施例中，模拟抗原表位是肽。在一些实施例中，模拟抗 原表位是小分子、碳水化合物、脂质或核酸。在一些实施例中，模拟抗原表位是保守 性流感抗原表位的肽或非肽模拟抗原表位。在一些实施例中，通过模拟所定义的病毒 抗原表位的结构，模拟抗原表位干扰流感病毒颗粒结合至其天然结合搭配物的能力， 例如通过结合至天然结合搭配物本身来干扰。
核酸：如本文所用，术语“核酸”就其广义来说，是指合并成或可合并成寡核苷 酸链的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是借助于磷酸二酯键联合并成或 可合并成寡核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基 (例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸 链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用。在一些实施例中， “核酸”涵盖RNA以及单股和/或双股DNA和/或cDNA。而且，术语“核酸”、 “DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，也就是具有除磷酸二酯主链之外的 主链的类似物。举例来说，此项技术中已知并且主链中具有肽键而非磷酸二酯键的所 谓“肽核酸”视为属于本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括 彼此间呈简并型式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或 RNA的核苷酸序列可包括内含子。核酸可自天然来源提纯而得，使用重组表达***产 生并且任选地提纯，化学合成等等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可 包含核苷类似物，比如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰等等的类似物。除非另 外说明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。术语“核酸区段”在本文中用于指作为更长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3、4、5、6、 7、8、9、10或更多个残基。在一些实施例中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸 苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷以及脱氧胞苷)；核苷类似物 (例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙 炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5- 丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟 苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤以及2-硫胞苷)；经化学修饰的碱基； 经生物学修饰的碱基(例如甲基化碱基)；***的碱基；经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核 糖、2'-脱氧核糖、***糖以及己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯以及5'-N-氨基磷酸酯键联)。在一些实施例中，本发明特别针对“未修饰的核酸”，意思指 核酸(例如多核苷酸以及残基，包括核苷酸和/或核苷)尚未经化学修饰以便促进或实现 递送。
患者：如本文所用，术语“患者”或“受检者”是指所提供组合物可投予的任何 生物体，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如 哺乳动物，比如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物，和/或人)。在一些实施例中，患者 是人。
医药学上可接受：如本文所用，术语“医药学上可接受”是指在正确医疗判断的 范围内，适合与人以及动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激过敏反应或其它问题 或併发症并且与合理的益处/风险比率相称的物质。
多肽：如本文所用，“多肽”一般来说是彼此通过肽键连接的一串至少两个氨基酸。在一些实施例中，多肽可包括至少3到5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽 键与其它氨基酸连接。所述领域的普通技术人员将了解，多肽有时包括“非天然”氨 基酸或其它实体，尽管如此，所述“非天然”氨基酸或其它实体仍能够任选地并入多 肽链中。
蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(也就是，彼此间通过肽键连接的 一串至少两个氨基酸)。蛋白质可包括除氨基酸之外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白聚糖 等等)且/或可以其它方式加工或修饰。所述领域的普通技术人员将了解，“蛋白质”可 以是如细胞所产生的完整的多肽链(具有或无信号序列)，或可以是其特征部分。普通技 术人员将了解，蛋白质有时可包括超过一个多肽链，例如通过一或多个二硫键连接或 用其它方式结合而成。多肽可含有l-氨基酸、d-氨基酸，或两者，并且可含有此项技术 中已知的任何各种各样的氨基酸修饰或类似物。有用修饰包括例如末端乙酰化、酰胺 化、甲基化等等。在一些实施例中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成 氨基酸以及其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨 基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，蛋白质是抗 体、抗体片段、其生物学活性部分，和/或其特征部分。
参考结构元件：如本文所用，术语“参考结构元件”是供与另一个元件比较的化 学结构的元件。在一些实施例中，参考结构元件是或包含原子或部分彼此间相对和/或 在三维空间中的排列。在一些这样的实施例中，相关原子或部分通过化学身份(例如特 定氨基酸或化学基团或结构等等)和/或通过功能(例如氢键供体或受体、自由基等等)来 定义。在一些特定实施例中，在参考聚合物中发现参考结构元件的情况下，参考结构 元件可为或包含存在于参考聚合物中的单体序列。举例来说，在一些这样的实施例 中，参考结构元件可为或包含多肽中的特定氨基酸序列元件、聚核苷酸中的特定核苷 酸序列元件，与/或多醣中的特定聚糖结构。
小分子：一般来说，“小分子”是尺寸小于约5千道尔顿(kD)的分子。在一些实施 例中，小分子小于约4kD、3kD、约2kD或约1kD。在一些实施例中，小分子小于 约800道尔顿(D)、约600D、约500D、约400D、约300D、约200D或约100D。 在一些实施例中，小分子小于约2000g/mol、小于约1500g/mol、小于约1000g/mol、 小于约800g/mol，或小于约500g/mol。在一些实施例中，小分子是非聚合物小分子。 在一些实施例中，根据本发明，小分子不是蛋白质、多肽、寡肽、肽、聚核苷酸、寡 核苷酸、多醣、糖蛋白、蛋白聚糖等等。
实质上：如本文所用，术语“实质上”是指展现所关注特征或特性的总范围或程 度或近似总范围或程度的定性条件。生物学领域中的普通技术人员将了解，生物学以 及化学现象，如果发生过的话，也很少进行到底和/或进行至完全或达到或避免绝对结 果。术语“实质上”因此在本文中用于找准许多生物学以及化学现象中所固有的完全 性潜在缺乏。
实质上同源：习语“实质上同源”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比 较。正如所述领域的普通技术人员将了解，两个序列若其在相应位置中含有同源残 基，则一般视为“实质上同源”。同源残基可为一致残基。或者，同源残基可为具有适 当类似结构和/或功能特征的非一致残基。举例来说，正如所述领域的普通技术人员所 熟知，某些氨基酸典型地归类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性” 或“非极性”侧链。用一种氨基酸取代另一相同类型通常可视为“同源”取代。
正如此项技术中所熟知，氨基酸或核酸序列可使用任何各种各样的算法比较，包括可以商用电脑程序获得的算法，商用电脑程序比如BLASTN(用于核苷酸序列)以及BLASTP、间隙化BLAST以及PSI-BLAST(用于氨基酸序列)。这些例示性程序描述于 艾尔兹储(Altschul)等人,基本局部比对检索工具(Basic local alignment search tool),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),215(3):403-410,1990；艾尔兹储等人,酶学中的方法(Methods in Enzymology)；艾尔兹储等人，“间隙化BLAST以及PSI-BLAST：新的一代 蛋白质数据库检索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs)”，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402,1997；巴克瓦力 斯(Baxevanis)等人,生物信息学：分析基因以及蛋白质的实用性指南(Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins),Wiley,1998；及米森勒(Misener)等 人,(编),生物信息学方法及方案(BioinformaticsMethods and Protocols)(分子生物学中的 方法(Methods in Molecular Biology),第132卷),忽麻纳出版社(Humana Press),1999。 除鉴别同源序列之外，上述程序典型地提供同源程度的示值。在一些实施例中，两个 序列若其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大在相关残基段上同源， 则视为实质上同源。在一些实施例中，相关段是完整序列。在一些实施例中，相关段 为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、 450、475、500或更多个残基。
实质上一致：习语“实质上一致”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比 较。正如所述领域的普通技术人员将了解，两个序列若其在相应位置中含有一致残 基，则一般视为“实质上一致”。正如此项技术中所熟知，氨基酸或核酸序列可使用任 何各种各样的算法比较，包括可以商用电脑程序获得的算法，商用电脑程序比如 BLASTN(用于核苷酸序列)以及BLASTP、间隙化BLAST以及PSI-BLAST(用于氨基 酸序列)。这些例示性程序描述于艾尔兹储(Altschul)等人,基本局部比对检索工具(Basic local alignment search tool),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),215(3):403-410,1990；艾尔 兹储等人,酶学中的方法(Methods in Enzymology)；艾尔兹储等人，“间隙化BLAST以 及PSI-BLAST：新的一代蛋白质数据库检索程序(Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs)”，核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389- 3402,1997；巴克瓦力斯(Baxevanis)等人,生物信息学：分析基因以及蛋白质的实用性 指南(Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins),Wiley, 1998；及米森勒(Misener)等人,(编),生物信息学方法及方案(BioinformaticsMethods and Protocols)(分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology),第132卷),忽麻纳出版 社(Humana Press),1999。除鉴别一致序列之外，上述程序典型地提供一致程度的示 值。在一些实施例中，两个序列若其相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更 大在相关残基段上一致，则视为实质上一致。在一些实施例中，相关段是完整序列。 在一些实施例中，相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、 325、350、375、400、425、450、475、500或更多个残基。
罹患：“罹患”疾病、病症或病状(例如流感)的个体已经确诊且/或展现所述疾病、病症或病状的一或多种症状。
易感染：“易感染”疾病、病症或病状(例如流感)的个体面临发展所述疾病、病症或病状的风险。在一些实施例中，易感染疾病、病症或病状的个体不呈现所述疾病、 病症或病状的任何症状。在一些实施例中，易感染疾病、病症或病状的个体尚未诊断 有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易感染疾病、病症或病状的个体是已 经暴露于与所述疾病、病症或病状发展相关的条件的个体(例如个体已经暴露于流感)。
症状减少：根据本发明，当特定疾病、病症或病状的一或多种症状的量值(例如强度、严重程度等等)或频率减少时，“症状减少”。为了清晰起见，特定症状发作的延迟 视为所述症状的频率减少的一种形式。不希望本发明仅限于症状消除的情况。本发明 特别涵盖使得一或多种症状即使不能完全消除、但也能减少(并且受检者的状况借此 “改善”)的治疗。
治疗剂：如本文所用，习语“治疗剂”是指当投予受检者时，具有治疗作用且/或 引发所要生物学和/或药理学效应的任何药剂。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗剂(例如蛋白质，特定来说，例如抗体)的量，这种量在统计学上与按照适用于任何医疗处理的益处/风险比投予 受检者群体时的特定治疗作用相关。治疗作用可为客观的(也就是可通过一些检验或标 记来测量)或主观的(也就是受检者指出或感受作用)。具体来说，“治疗有效量”是指治 疗剂有效减少疾病、病症或病状的一或多种特点、症状或特征的发生率和/或严重程度 和/或延迟其发作。治疗有效量通常按照可包含多个单元剂量的给药方案投予。对于任 何特定的治疗性蛋白质来说，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单元剂量)可根 据例如投药途径、与其它医药剂的组合来改变。还有，任何特定患者的特定治疗有效 量(和/或单元剂量)可根据各种各样的因素而定，包括所治疗的病症以及病症严重程 度；所用特定医药剂的活性；所用特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、 性别及饮食；投药时间、投药途径，和/或所用特定融合蛋白的排出或代谢速度；治疗 持续时间；以及医疗领域中熟知的类似因素。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟特定疾病、病症和/或病状 (例如流感)的一或多种症状、特征和/或病因的发作、降低其严重程度和/或降低其发生 率的物质(例如所提供的组合物)的任何投予。这种治疗可给予未展现相关疾病、病症和 /或病状的病征的受检者和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期病征的受检者。或者或 另外，这种治疗可给予展现相关疾病、病症和/或病状的一或多种已确立病征的受检 者。在一些实施例中，治疗可给予已确诊罹患相关疾病、病症和/或病状的受检者。在 一些实施例中，治疗可给予已知具有一或多种易感染因素的受检者，这些因素在统计 学上与相关疾病、病症和/或病状的发展风险增大相关。
通用抗流感药剂：如本文所用，术语“通用抗流感药剂”是指对于各种流感病毒株、群组、分化枝以及群集均有广谱中和作用的药剂。
非天然氨基酸：如本文所用，术语“非天然氨基酸”是指不为20种天然存在的氨 基酸之一的任何氨基酸、经修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。参看美国专利第 7,045,337号、美国专利第7,385,028号以及美国专利第7,332,571号，这些专利的整个 公开内容以引用的方式并入本文中。如本文所用，“非天然氨基酸”还包涵经化学修饰 的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(比如酰胺)和/或取代。氨基酸(包括肽中 的羧基末端和/或胺基末端氨基酸)可通过聚乙二醇化、甲基化、酰胺化、乙酰化和/或 用对结合剂活性无不利影响的其它化学基团取代来修饰。氨基酸可以参与二硫键。术 语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸 残基。根据使用术语的背景，显而易见其是指游离氨基酸，还是肽的残基。
接种疫苗：如本文所用，术语“接种疫苗”是指投予旨在产生免疫反应(例如针对致病原(disease-causing agent))的组合物。为了本发明的目的，接种疫苗可在暴露于致病 原之前、期间和/或之后投予，并且在某些实施例中，在暴露于致病原之前、期间和/或之后不久投予。在一些实施例中，接种疫苗包括以间隔适当的时间多次投予接种组合 物。
载体：如本文所用，“载体”是指一种核酸分子，其能够转运与其结合的另一种核酸。在一些实施例中，载体能够在染色体外复制和/或表达与其在宿主细胞(比如真核和 /或原核细胞)中连接的核酸。能够直接表达操作地连接基因的载体在本文中称为“表达 载体”。
如本文所述，本发明提供结合至多种流感病毒株的新颍流感结合剂。本发明尤其提供结合至流感HA的特定抗体，以及与所提供抗体共有特定结构和/或功能特征的结 合剂。
流感抗原
血球凝集素(HA)多肽
流感病毒是RNA病毒，其特征为脂膜被膜含有嵌入病毒独有膜内的两种糖蛋白：血球凝集素(HA)多肽以及神经胺糖酸苷酶(NA)多肽。存在16种已知的HA多肽亚型 (H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16)以及9种NA多肽亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9)，并且不同 的流感病毒株是根据病毒株的HA多肽及NA多肽亚型的个数来命名，其中一种HA多 肽亚型与一种NA多肽亚型(例如H1N1、H1N2、H1N3、H1N4、H1N5等等)的组合存 在不同组合。
根据氨基酸序列一致性及晶体结构的比较，HA多肽亚型已经分成两个主要群组及四个较小分化枝，其进一步分成五个群集。不同的HA多肽亚型不一定共有很大的氨 基酸序列一致性，但不同HA多肽亚型的总体三维结构彼此相似，其中的若干细微差 异可用于分级目的。举例来说，膜远侧子域相对于中心α螺旋的特定取向是一种结构 特征，这个特征通常用于确定HA多肽亚型(拉塞尔(Russell)等人,病毒学(Virology), 325:287,2004)。
HA，正如其在自然界中存在的那样，是三个相同单体的三聚物，每个单体作为前驱物合成，所述前驱物经蛋白水解加工成两个经二硫化物键结的多肽链。成熟HA多 肽包含两个域：(1)核心HA-1域，称为唾液酸结合域；及(2)HA的跨膜柄，称为HA-2 域。HA-1含有聚糖的结合部位并且人们认为HA-1负责介导HA结合至HA受体。HA- 2负责呈现HA-1域。典型地，HA单体柄的三个长HAα螺旋之间的极性以及非极*** 互作用提供使HA三聚物稳定的主要力量。将了解，根据本发明的HA多肽可含有来自 任何HA域(例如核心HA-1、跨膜HA-2和/或其组合)的氨基酸残基和/或序列。
在一些实施例中，根据本发明的HA多肽含有超过一种流感亚型中皆保守的序 列。举例来说，分析所有流感亚型的HA序列显示，HA-1(头)与HA-2(柄)域的界面中 的一组氨基酸非常保守并且能让有远景的治疗性分子可及。研究还观察到，包括典型α 螺旋以及其邻近残基的HA-1/HA-2界面膜近侧抗原表位区域(MPER)存在优良的广谱保 守性(艾克特(Ekiert)等人,科学(Science),324(5924):246,2009；苏伊(Sui)等人,自然结构 与分子生物学(Nat Struct Mol Biol.)16(3):265,2009)。
HA受体
如本文所述的HA多肽通过结合至糖蛋白受体(称为HA受体)而与细胞表面交互作用。HA多肽结合至HA受体主要由HA受体上的N连接型聚糖介导。具体来说，流感 病毒颗粒表面上的HA多肽识别与细胞宿主表面上的HA受体结合的唾液酸化聚糖。识 别并且结合之后，宿主细胞吞没病毒细胞并且病毒能够复制并产生很多的病毒颗粒以 分配给相邻细胞。
天然HA(在许多实施例中，HA多肽)与16种亚型(称为H1至H16)之一的同三聚 体一样存在于病毒膜中。这些亚型中仅三种(H1、H2以及H3)到目前为止已变得适宜于 人感染。已适于感染人的HA多肽(例如来自传染病H1N1(1918)以及H3N2(1967-68)流 感亚型的HA多肽)的一个已报导特征是，相较于其优先结合至α2,3唾液酸化聚糖的鸟 禽祖先，其能够优先结合至α2,6唾液酸化聚糖(斯科豪(Skehel)及瓦雷(Wiley),生物化 学年评(Annu RevBiochem),69:531,2000；罗杰斯(Rogers)及鲍尔森(Paulson),病毒学 (Virology),127:361,1983；罗杰斯等人,自然(Nature),304:76,1983；索特(Sauter)等人, 生物化学(Biochemistry),31:9609,1992；康诺(Connor)等人,病毒学(Virology),205:17, 1994；汤培(Tumpey)等人,科学(Science),310:77,2005)。
不希望受任何特定理论限制，人们已经提出，感染人宿主的能力较少与结合至特定键联的聚糖相关，而更多与结合至特定拓扑结构的聚糖相关。我们已经特别说明， 介导感染人的HA多肽结合至伞形拓扑结构聚糖，通常显示伞形拓扑结构聚糖优于锥 形拓扑结构聚糖(即使锥形拓扑结构聚糖可为α2,6唾液酸化聚糖)(参见例如2009年1 月2日提交的USSN 12/348,266；2008年11月17日提交的USSN 12/301,126；2008年 1月3日提交的USSN61/018,783；2008年1月3日提交的USSN 11/969,040；2007年 8月14日提交的USSN 11/893,171；2006年8月14日提交的USSN 60/837,868；8月 14日提交的USSN 60/837,869；以及2007年8月14日提交的PCT申请案 PCT/US07/18160，各文献以引用的方式并入本文中)。
可获得来自结合至(α2,3键联与α2,6键联两者的)唾液酸化寡糖的H1(人以及猪)、H3(鸟禽)以及H5(鸟禽)亚型的若干晶体结构并且对涉及HA多肽和这些聚糖的不同交 互作用的特定氨基酸进行分子层面的了解(埃森(Eisen)等人,病毒学(Virology),232:19,1997；哈(Ha)等人,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),98:11181,2001；哈(Ha)等人,病毒学(Virology),309:209,2003；甘伯林(Gamblin)等人,科学(Science),303:1838,2004；斯蒂文(Stevens)等人,科学(Science),303:1866,2004；拉塞尔(Russell)等人,糖偶联物杂志(Glycoconj J)23:85,2006；斯蒂文(Stevens)等人,科学(Science),312:404,2006)。例示性HA-聚糖交互作用的一些晶体结构已经鉴别并且呈现于下文表 格1中。
表格1.HA-聚糖复合物的晶体结构
HA-α2-6唾液酸化聚糖复合物是通过将ADU63_H3以及ADS97_H5以及 Viet04_H5的HA1亚单元的CA迹线叠置于ASI30_H1_26以及APR34_H1_26(H1)上来 产生。虽然人A/爱知/2/68(H3N2)与α2-6唾液酸化聚糖的结构复合物已公开(埃森 (Eisen)等人,1997,病毒学(Virology),232:19；以引用的方式并入本文中)，但其配位价 在蛋白质数据库中不可获得。利用SARF2程序获得用于叠置的不同HA1亚单元的结 构性比对。
举例来说，单独或结合至α2,3或α2,6唾液酸化寡糖的H5(A/鸭/新加坡/3/97)的晶体结构鉴别出与所结合聚糖直接交互作用的某些氨基酸，还有一或多种程度的分离除 去的氨基酸(斯蒂文(Stevens)等人,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA) 98:11181,2001)。在一些情况下，这些残基的构形在结合状态下相对于在未结合状态下 是不同的。举例来说，Glu190、Lys193以及Gln226全部参与直接结合的交互作用并且 在结合状态下相对于在未结合状态下具有不同构形。邻近Glu190的Asn186的构形在 结合状态下相对于在未结合状态下也是明显不同的。
不希望被任何特定理论束缚，人们认为HA受体是由靠近受体HA多肽结合部位的 α2,3或α2,6唾液酸化聚糖修饰，并且结合受体的聚糖的键联类型可影响受体的HA多 肽结合部位的构形，由此影响受体对于不同HA多肽的特异性。举例来说，鸟禽HA受 体的聚糖结合袋囊狭窄。不希望被任何特定理论束缚，人们已经提出这种袋囊结合至 α2,3唾液酸化聚糖的反式构形，且/或结合至锥形拓扑结构聚糖，不论是α2,3，还是 α2,6连接。
鸟禽组织中以及还有人深处肺及胃肠(GI)道组织中的HA受体以a2,3唾液酸化聚糖 键联为特征，并且更以主要采纳锥形拓扑结构的聚糖(包括α2,3唾液酸化聚糖和/或 α2,6唾液酸化聚糖)为特征。具有这些锥形拓扑结构聚糖的HA受体在本文中可称为 CTHAr。
对比之下，人上呼吸道的支气管及气管中的HA受体是由α2,6唾液酸化聚糖修 饰。不同于α2,3基元，α2,6基元由于C6-C5键而具有额外的构形自由度(拉塞尔 (Russell)等人,糖偶联物杂志(Glycoconj J)23:85,2006)。结合至这些α2,6唾液酸化聚糖 的HA多肽具有容纳由此构形自由度所产生之结构多样性的更开放结合袋囊。此外， 根据本发明，HA多肽可能需要以伞形拓扑结构结合至聚糖(例如α2,6唾液酸化聚糖)， 并且尤其可能需要以强亲和性和/或特异性结合至这些伞形拓扑结构聚糖，以便有效地 介导感染人上呼吸道组织。具有伞形拓扑结构聚糖的HA受体在本文中可称为 UTHAr。
由于这些在空间上受限制的糖基化概况，因此人通常不会被含有多种野生型鸟禽HA多肽(例如鸟禽H5)的病毒感染。具体来说，由于很可能遇到病毒的人呼吸道部分 (也就是气管及支气管)缺乏具有锥形聚糖(例如α2,3唾液酸化聚糖，和/或短聚糖)的受 体并且野生型鸟禽HA多肽典型地主要或只结合至与锥形聚糖(例如α2,3唾液酸化聚 糖，和/或短聚糖)相关的受体，因此人很少被鸟禽病毒感染。只有当与病毒充分紧密地 接触、以致其可接近具有伞形聚糖(例如长α2,6唾液酸化聚糖)的深处肺和/或胃肠道受 体时，人才被感染。
流感感染的症状以及影响
流感感染或“流感”主要是人体的鼻、咽喉以及支气管的病毒感染。如上文所 述，鉴于存在若干种不同流感病毒株以及亚型，因此根据感染类型，可改变与流感感 染相关的症状严重程度。在患有慢性潜在疾病(比如癌症、肺气肿或糖尿病)的那些个体 或免疫能力受损的那些人中，症状还有可能危急生命。虽然症状的严重程度可改变， 但流感感染存在若干种标志症状，比如(但不限于)发炎、发烧、恶心、体重降低、食欲 丧失、呼吸促迫、心率增加、高血压、身体痛、肌肉疼痛、眼疼痛、疲劳、不适、干 咳、流鼻涕和/或咽喉痛。因此，在一些实施例中，患者体内症状的表现可作为预后性 或诊断性手段用于确定流感感染的存在。在一些实施例中，症状的严重程度和/或变化 可用于确定流感治疗的给药方案，比如投予结合剂。在一些实施例中，患者所呈现的 症状的发作、严重程度和/或变化可用于指示使用结合剂预防性治疗患者的必要。在一 些实施例中，症状的严重程度、变化和/或改善可用于评价患者对流感治疗的特定类型 或方法的反应。
抗体
如本文所述，本发明提供抗体(例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体等等)，其结合至HA多肽，并且在一些实施例中，结合至多种流感病毒株。在一些实施例中，这 些抗体适用于预防、治疗、诊断和/或研究流感。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白的结构特征的多肽，正如此项技 术中所了解。在许多实施例中，抗体是多肽，其氨基酸序列包括所属领域的技术人员 认定为互补决定区(CDR)的一或多个结构元件。在一些实施例中，抗体是多肽，其氨基 酸序列包括所述领域的技术人员认定为免疫球蛋白可变域的结构元件。在一些实施例 中，抗体是“全长”抗体，原因在于其含有两条重链和两条轻链，这些重链和轻链任 选地通过二硫键结合，如同天然产生的抗体。在一些实施例中，抗体是全长抗体的片 段，原因在于其含有全长抗体中所发现的一些，而非全部的序列。举例来说，在一些 实施例中，抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双抗 体以及Fd片段。在一些实施例中，抗体可包含单链抗体片段。在一些实施例中，抗体 可包含例如通过二硫键连接在一起的多个链。在一些实施例中，抗体可包含多分子复 合物。在一些实施例中，抗体可包含至少约50个氨基酸并且更典型地包含至少约200 个氨基酸。
在一些实施例中，抗体是选自由以下组成的群组的抗体类别中的成员：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。在一些实施例中，抗体是由细胞产生。在一些实施例中，抗 体是使用重组细胞培养***产生。在一些实施例中，抗体是通过化学合成产生。在一 些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体是多克隆抗体。在一些实施 例中，抗体是通过化学合成产生。在一些实施例中，抗体来源于哺乳动物。在一些实 施例中，抗体由动物产生，比如(但不限于)小鼠、大鼠、马、猪或山羊。在一些实施例 中，抗体来源于人。在一些实施例中，抗体是具有人恒定域和/或可变区域的嵌合抗 体，例如来自小鼠、大鼠、马、猪或其它物种的嵌合抗体。在一些实施例中，抗体是 人源化抗体。如本文所用，术语“人源化”抗体是指包含人框架区和来自非人(例如小 鼠或大鼠)免疫球蛋白的一或多种CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称 作“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白称作“受体”。“人源化抗体”是包含人源化 轻链以及人源化免疫球蛋白重链的抗体。
抗体修饰
在一些实施例中，所提供抗体中的一或多个序列已经工程改造(例如通过亲和力成 熟或其它优化方法)，以改进一或多种特征或活性(例如增强稳定性、减少聚集、降低免疫原性等等)，正如此项技术中所知。在一些实施例中，抗体是通过聚乙二醇化、甲基 化、唾液酸化、胺化或硫酸化来修饰。在一些实施例中，抗体与两性型核心/壳偶联而 产生聚合物胶束。在一些实施例中，抗体与超分支巨大分子(也就是树枝状聚合物)偶 联。在一些实施例中，抗体与选自由以下组成的群组的天然聚合物偶联：白蛋白、几 丁聚糖、肝素、太平洋紫杉醇、聚(L-谷氨酸盐)、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺 (HPMA)、聚(L-交酯)(PLA)、聚(酰胺基胺)(PAMAM)、叶酸盐和/或其组合。在一些实 施例中，抗体包含亲水性氨基酸(rPEG)的一或多个非结构化长尾。在一些实施例中， 考虑通过使用不改变抗体结合部位的反应条件将硫氢基选择性引入免疫球蛋白的Fc区 中来使免疫球蛋白衍生化。根据这种方法产生的抗体偶联物可展现改进的寿命、特异 性以及敏感性(美国专利第5,196,066号，所述专利以引用的方式并入本文中)。文献中 还公开效应子或报道分子的部位特异性连接，其中报道分子或效应分子与Fc区中的碳 水化合物残基偶联(奥夏勒斯(O'Shannessy)等人,1987)。
所提供的抗HA抗体
本发明提供结合至流感HA的某些抗体。本发明尤其提供特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至来自一或多个流感群组之HA的某些抗体。在一些实施例中，这些 抗体的特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至来自群组1病毒的HA。在一些实施 例中，这些抗体的特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至来自群组2病毒的HA。 在一些实施例中，这些抗体的特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至来自群组1 病毒以及群组2病毒的HA。在一些实施例中，这些结合剂结合至亚型H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的HA多 肽。特定来说，在一些实施例中，这些抗体结合至具有H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16HA多肽中的一或多者的 序列元件特征的HA多肽。在一些实施例中，这些抗体结合至H1、H2、H3、H4、 H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16HA多肽中的一 或多者，其中亲和力为其针对不同H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、 H11、H12、H13、H14、H15以及H16HA多肽中的一或多者的亲和力的至少5％、 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％或更大。在一些实施例中，这些抗体针对不同HA多肽(例如来 自不同群组、分化枝或群集和/或来自不同病毒株的HA多肽)显示的结合亲和力在5倍的彼此间结合亲和力范围内。在一些实施例中，这些抗体针对不同HA多肽显示的结 合亲和力在彼此间2倍的范围内。在一些实施例中，这些抗体针对不同HA多肽(例如 来自不同群组、分化枝或群集和/或来自不同病毒株的HA多肽)显示的结合亲和力在 150倍的彼此间结合亲和力范围内(例如100倍范围内、50倍范围内、25倍范围内、10 倍范围内或5倍范围内)。
在一些实施例中，这些抗体结合至H1、H3、H5、H7和/或H9HA多肽中的至少 两者。在一些实施例中，这些抗体结合至H1、H3、H5、H7和/或H9HA多肽中的至 少三、四或五者。
在一些实施例中，这些抗体结合至亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16中的至少一者的HA多肽，而不结 合至亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、 H15和/或H16中的至少一种HA多肽。在一些实施例中，这些抗体结合至亚型H1的 HA多肽。在一些实施例中，这些抗体结合至亚型H1的HA多肽的亲和力为其结合至 至少一种亚型H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、 H15和/或H16的HA多肽的亲和力的至少100％、至少125％、至少150％、至少200％ 或更大。在一些实施例中，这些抗体结合至亚型H3的HA多肽。在一些实施例中，这 些抗体结合至亚型H3的HA多肽的亲和力为其结合至至少一种亚型H1、H2、H4、 H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的HA多肽的 亲和力的至少100％、至少125％、至少150％、至少200％或更大。
在一些实施例中，这些抗体显示的中和IC50(ug/ml)在如本文所述和/或例示的范围 内。在一些实施例中，这些所提供抗体显示下限为约0.1ug/ml而上限为约10ug/ml的 中和IC50(ug/ml)。在一些实施例中，这些所提供抗体显示的中和IC50(ug/ml)的下限选 自由以下组成的群组：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、 1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0ug/ml或更 大，而上限高于下限并且选自由以下组成的群组：1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0ug/ml或 更大。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以小于2000nM、小于1500nM、小于 1000nM、小于500nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM、小 于150nM、小于125nM、小于100nM、小于75nM或小于50nM的KD(nM)结合至 流感HA(例如群组1和/或群组2亚型)。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以下限为约0.01×105M-1s-1而上限为约1.0×106M-1s-1的Ka(M-1s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA， 其中Ka(M-1s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、 0.04×105、0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、 1.2×105、1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105M-1s-1或更大，而其上限高于下限并且选 自由以下组成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、 4.5×105、5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、 9.0×105、9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、 1.7×106、1.8×106、1.9×106M-1s-1或更大。
在一些实施例中，这些所提供抗体显示以下限为约0.01×105s-1而上限为约1.0×106 s-1的Kd(s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA，其中Ka(s-1)的下 限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、0.04×105、0.08×105、 0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、1.2×105、1.4×105、1.6×105、 1.8×105、2.0×105s-1或更大，而其上限高于下限并且选自由以下组成的群组： 1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、4.5×105、5.0×105、5.5×105、 6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、9.0×105、9.5×105、1.0×106、 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106s-1或更大。
在一些实施例中，这些所提供抗体的特征为特定的结构特征。在一些实施例中，这些所提供特定抗体的这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中的相应CDR或 FR(SEQID NO:1-60)至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的一或多个CDR 或一或多个FR。在一些实施例中，这些所提供特定抗体的这些结构特征包括与表格2 以及表格3中的相应CDR或FR(SEQID NO:1-60)至少65％、70％、75％、80％、 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％同源的一或多个CDR或一或多个FR。在一些实施例中，这些所提供特定抗 体的这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中的相应CDR或FR(SEQ ID NO:1- 60)一致的一或多个CDR和/或一或多个FR。在一些实施例中，这些所提供特定抗体的 这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中所列(SEQ ID NO:1-60)一致的CDR以及 FR。
表格2.VH链的例示性氨基酸序列(CDR序列为粗体)
表格3.VL链的例示性氨基酸序列(CDR序列为粗体)
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR及FR序列元件，这些序列元件各自与 表格2和/或表格3中所列的CDR或FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对 于所述参考序列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2和/或表3中的 对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，所包括的CDR以及FR序列元件 在CDR以及FR序列中总共含有不超过18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括CDR以及FR 序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO: 1-60)，这些序列元件总共含有不超过18个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括 CDR以及FR序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元 件(SEQ ID NO:1-60)，这些序列元件总共含有不超过15个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括FR序列元件，所述FR序列元件与表格2和/ 或表格3中所列的FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列元 件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应FR参考序列 元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的FR序列元件在FR序列中含有不超过18、17、16、 15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR序列元件，所述CDR序列元件与表格2 和/或表格3中所列的CDR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序 列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应CDR参 考序列元件(SEQID NO:1-60)，所包括的CDR序列元件在CDR序列中含有不超过 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH序列元件，所述VH序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VH序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VH-1、VH-2、VH-3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、 VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH-14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL序列元件，所述VL序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VL序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL-6、VL-7、VL-8、VL-9、VL- 10、VL-11或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括与以下对应的结构元件：VH-1、VH-2、VH- 3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH- 14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者，与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL- 6、VL-7、VL-8、VL-9、VL-10、VL-11或其片段中的任一者的组合。在一些实施例 中，VH-1(SEQ ID NO:1)与VL-1(SEQ ID NO:33)组合。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参 考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44- 54)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参 考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55- 58)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参 考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59- 60)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH框架区序列元件，其显示与表格2中的VH参考框架区序列元件(SEQ ID NO:1-16)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL框架区序列元件，其显示与表格3中的 VL参考框架区序列元件(SEQ ID NO:33-43)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
结合剂
结构以及特征
本发明提供流感结合剂。本发明尤其提供包括这些所提供特定抗体的这些结构特征的结合剂，使得所提供的结合剂与所提供特定流感抗体具有共同的功能属性，以便 其结合至特定的HA抗原表位和/或结合至来自特定流感群组的HA。在一些实施例中， 这些结合剂的特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至来自群组1病毒的HA的功 能属性。在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至特定HA抗原表位和/或结合至 来自群组2病毒的HA的功能属性。在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至特 定HA抗原表位和/或结合至来自群组1病毒以及群组2病毒的HA的功能属性。在一 些实施例中，这些结合剂的特征为结合至亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、 H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的HA多肽的功能属性。特定 来说，在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至具有H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16HA多肽中的一或多 者的序列元件特征的HA多肽的功能属性。在一些实施例中，这些结合剂的特征为结 合至H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 以及H16HA多肽中的一或多者的功能属性，其中亲和力为其针对不同H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16HA多肽中 的一或多者的亲和力的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更大。
在一些实施例中，这些结合剂针对不同HA多肽(例如来自不同群组、分化枝或群集和/或来自不同病毒株的HA多肽)显示的结合亲和力在5倍的彼此间结合亲和力范围 内。在一些实施例中，这些结合剂针对不同HA多肽显示的结合亲和力在彼此间2倍 的范围内。在一些实施例中，这些结合剂针对不同HA多肽(例如来自不同群组、分化 枝或群集和/或来自不同病毒株的HA多肽)显示的结合亲和力在150倍的彼此间结合亲 和力范围内(例如100倍范围内、50倍范围内、25倍范围内、10倍范围内或5倍范围 内)。
在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至H1、H3、H5、H7和/或H9HA多 肽中的至少两者的功能属性。在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至H1、H3、 H5、H7和/或H9HA多肽中的至少三者、四者或五者的功能属性。
在一些实施例中，这些结合剂的特征为结合至亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16中的至少一者，而不结合 至亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、 H15和/或H16中的至少一种HA多肽的功能属性。在一些实施例中，这些结合剂结合 至亚型H1的HA多肽。在一些实施例中，这些结合剂结合至亚型H1的HA多肽的亲 和力为其结合至至少一种亚型H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16的HA多肽的亲和力的至少100％、至少125％、至少 150％、至少200％或更大。在一些实施例中，这些结合剂结合至亚型H3的HA多肽。 在一些实施例中，这些结合剂结合至亚型H3的HA多肽的亲和力为其结合至至少一种 亚型H1、H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或 H16的HA多肽的亲和力的至少100％、至少125％、至少150％、至少200％或更大。
在一些实施例中，这些结合剂的特征为所示中和IC50(ug/ml)在本文所述和/或例示 范围内的功能属性。在一些实施例中，这些结合剂显示下限为约0.1ug/ml而上限为约10ug/ml的中和IC50(ug/ml)。在一些实施例中，这些结合剂显示的中和IC50(ug/ml)的 下限选自由以下组成的群组：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 ug/ml或更大，而上限高于下限并且选自由以下组成的群组：1.5、1.6、1.7、1.8、 1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、 9.5、10.0ug/ml或更大。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以小于2000nM、小于1500nM、小于1000nM、小于500nM、小于250nM、小于225nM、小于200nM、小于175nM、小 于150nM、小于125nM、小于100nM、小于75nM或小于50nM的KD(nM)结合至 流感HA(例如群组1和/或群组2亚型)。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以下限为约0.01×105M-1s-1而上限为约1.0×106M-1s-1的Ka(M-1s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA， 其中Ka(M-1s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、 0.04×105、0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、 1.2×105、1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105M-1s-1或更大，而其上限高于下限并且选 自由以下组成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、 4.5×105、5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、 9.0×105、9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、 1.7×106、1.8×106、1.9×106M-1s-1或更大。
在一些实施例中，这些所提供结合剂显示以下限为约0.01×105s-1而上限为约1.0×106s-1的Kd(s-1)结合至流感HA。这些所提供的抗体显示结合至流感HA，其中Ka (s-1)的下限选自由以下组成的群组：0.01×105、0.02×105、0.04×105、0.04×105、 0.08×105、0.1×105、0.2×105、0.4×105、0.6×105、0.8×105、1.0×105、1.2×105、 1.4×105、1.6×105、1.8×105、2.0×105s-1或更大，而其上限高于下限并且选自由以下组 成的群组：1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、3.5×105、4.5×105、 5.0×105、5.5×105、6.0×105、6.5×105、7.0×105、7.5×105、8.0×105、8.5×105、9.0×105、 9.5×105、1.0×106 1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、 1.8×106、1.9×106s-1或更大。
在一些实施例中，这些特定结合剂的这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中的相应CDR或FR(SEQ ID NO:1-60)至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致 的一或多个CDR或一或多个FR。在一些实施例中，这些结合剂的这些结构特征包括 与表格2以及表格3中的相应CDR或FR(SEQ ID NO:1-60)至少65％、70％、75％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同源的一或多个CDR或一或多个FR。在一些实施例中，这些结合剂 的这些结构特征包括序列与表格2以及表格3中的相应CDR或FR(SEQ ID NO:1-60) 一致的一或多个CDR和/或一或多个FR。在一些实施例中，这些结合剂的这些结构特 征包括序列与表格2以及表格3中所列(SEQ ID NO:1-60)一致的CDR以及FR。
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR及FR序列元件，这些序列元件各自与 表格2和/或表格3中所列的CDR或FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对 于所述参考序列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2和/或表3中的 对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，所包括的CDR以及FR序列元件 在CDR以及FR序列中总共含有不超过18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括CDR以及FR 序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元件(SEQ ID NO: 1-60)，这些序列元件总共含有不超过18个取代。在一些实施例中，这些结构特征包括CDR以及FR序列元件，相较于表格2以及表格3中的对应CDR以及FR参考序列元 件(SEQ ID NO:1-60)，这些序列元件总共含有不超过15个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括FR序列元件，所述FR序列元件与表格2和/ 或表格3中所列的FR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列元 件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应FR参考序列 元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的FR序列元件在FR序列中含有不超过18、17、16、 15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括CDR序列元件，所述CDR序列元件与表格2 和/或表格3中所列的CDR参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序 列元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应CDR参 考序列元件(SEQID NO:1-60)，所包括的CDR序列元件在CDR序列中含有不超过 18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH序列元件，所述VH序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VH序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VH参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VH-1、VH-2、VH-3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、 VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH-14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL序列元件，所述VL序列元件与表格2和 /或表格3中所列的VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)一致，但相对于所述参考序列 元件，其包括一或多个氨基酸取代，其中相较于表格2以及表格3中的对应VH参考 序列元件(SEQ IDNO:1-60)，所包括的VL序列元件在CDR序列中含有不超过18、 17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。在一些实 施例中，相较于表格2以及表格3中的对应VL参考序列元件(SEQ ID NO:1-60)，这些 结构特征包括与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL-6、VL-7、VL-8、VL-9、VL- 10、VL-11或其片段中的任一者对应的结构元件。
在一些实施例中，这些结构特征包括与以下对应的结构元件：VH-1、VH-2、VH- 3、VH-4、VH-5、VH-6、VH-7、VH-8、VH-9、VH-10、VH-11、VH-12、VH-13、VH- 14、VH-15、VH-16或其片段中的任一者，与VL-1、VL-2、VL-3、VL-4、VL-5、VL- 6、VL-7、VL-8、VL-9、VL-10、VL-11或其片段中的任一者的组合。在一些实施例 中，VH-1(SEQ ID NO:1)与VL-1(SEQ ID NO:33)组合。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参 考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44- 54)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)1序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ ID NO:44-54)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)1序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR1参考序列元件(SEQ ID NO:17-18和/或SEQ IDNO:44-54)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参 考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55- 58)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)2序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ ID NO:55-58)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)2序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR2参考序列元件(SEQ ID NO:19-20和/或SEQ IDNO:55-58)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件显示与表格2和/或表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)至少65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过 95％或超过99％一致。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元 件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有两个或两个以上氨基酸取代。在一些实施例中，这 些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参 考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)，所述序列元件具有一或多个 氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，相较 于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59- 60)，所述序列元件具有至少两个氨基酸取代。在一些实施例中，这些结构特征包括互 补决定区(CDR)3序列元件，相较于表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ ID NO:59-60)，所述序列元件具有少于两个氨基酸取代。在一 些实施例中，这些结构特征包括互补决定区(CDR)3序列元件，所述序列元件的氨基酸 序列与表格2以及表格3中的CDR3参考序列元件(SEQ ID NO:21-32和/或SEQ IDNO:59-60)之一的氨基酸序列一致。
在一些实施例中，这些结构特征包括VH框架区序列元件，其显示与表格2中的 VH参考框架区序列元件(SEQ ID NO:1-16)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
在一些实施例中，这些结构特征包括VL框架区序列元件，其显示与表格3中的 VL参考框架区序列元件(SEQ ID NO:33-43)超过65％、超过70％、超过75％、超过 80％、超过85％、超过90％、超过95％或超过99％的百分比一致性。
例示性结合剂
抗体和/或抗体片段
如本文所用，结合剂是指能够结合至抗原或生物靶的药剂。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含多肽。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含抗体或其片 段。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含单克隆抗体或其片段。在一些实施例 中，所提供的结合剂是或包含多克隆抗体或其片段。在一些实施例中，结合剂是或包 含“全长”抗体，原因在于其含有两条重链以及两条轻链，所述两条重链以及两条轻 链任选地经二硫键结合，如同天然产生的抗体。在一些实施例中，结合剂是或包含全 长抗体的片段，原因在于其含有全长抗体中所发现的一些，而非全部的序列。举例来 说，在一些实施例中，结合剂是或包含抗体片段，其包括(但不限于)Fab、Fab'、 F(ab')2、scFv、Fv、dsFv双抗体以及Fd片段。在一些实施例中，所提供的结合剂是或 包含抗体，所述抗体是选自由以下组成的群组的抗体类别的成员：IgG、IgM、IgA、 IgD、IgE或其片段。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含通过化学合成产生的 抗体。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含通过细胞产生的抗体。在一些实施 例中，所提供的结合剂是或包含使用重组细胞培养***产生的抗体。在一些实施例 中，所提供的结合剂是或包含具有人恒定域和/或可变区域的嵌合抗体，例如来自小 鼠、大鼠、马、猪或其它物种的嵌合抗体。
在一些实施例中，结合剂包括一或多个抗体片段，包括(但不限于)Fab'、Fab、 F(ab')2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)、具有抗体CDR的多肽、呈现CDR的 支架域(例如抗运载蛋白)，或纳米抗体。举例来说，所提供的抗体可能是仅包含重链的 VHH(也就是抗原特异性VHH)抗体。这些抗体分子可来源于美洲驼或其它骆驼科抗体 (例如骆驼科IgG2或IgG3，或来自这种骆驼科Ig的CDR呈现框)或来源于鲨鱼抗体。 在一些实施例中，结合剂是或包含高亲和性抗体(双抗体、三抗体、四抗体)。制备以及 使用基于各种抗体的构筑体以及片段的技术在所述领域中已众所周知。用于制备以及 表征抗体的方式在所述领域中也众所周知(参见例如抗体：实验室手册，冷泉港实验室 (Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory),1988；所述文献以引 用的方式并入本文中)。
在一些实施例中，所提供的结合剂包括一或多个“小型抗体”或“微型抗体”。微 型抗体是sFv多肽链，在其C末端包括通过铰链区与sFv分隔的寡聚域。帕克(Pack)等 人,(1992)生物化学(Biochem)31:1579-1584。寡聚域包含可通过额外二硫键进一步稳定 化的自结合α螺旋，例如白氨酸拉链。寡聚域设计成和横越膜的矢量性折叠(一种被认 为可促进多肽折叠成功能性结合蛋白)的过程相容。一般来说，微型抗体是使用所述领 域中众所周知的重组方法产生。参见例如帕克(Pack)等人,(1992)生物化学(Biochem) 31:1579-1584；康博(Cumber)等人,(1992)免疫学杂志(J Immunology)149B:120-126。
肽模拟物
在一些实施例中，所提供的结合剂包括一或多种抗体样结合肽模拟物。刘(Liu)等人,分子细胞生物学杂志(Cell Mol Biol)(诺伊斯·勒·格兰德(Noisy-le-grand)).2003年3 月；49(2):209-16描述“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，所述肽模拟物是充当精简抗体并 且具有较长血清半衰期并且合成方法不太麻烦的肽。同样，在一些方面，抗体样分子 是环状或双环肽。举例来说，用于分离抗原结合双环肽(例如通过噬菌体呈现法)以及使 用这些肽的方法提供于美国专利公开第20100317547号，这个专利公开以引用的方式 并入本文中。
支架蛋白
在一些实施例中，所提供的结合剂包括一或多种抗体样结合支架蛋白。举例来说，在一些实施例中，源自抗体的一或多个CDR可移植于蛋白支架上。一般来说，蛋 白支架可满足最多数目个以下准则(斯凯纳A(Skerra A.)，分子识别杂志(J.Mol. Recogn.),2000,13:167-187)：良好的演化发展保守性；已知的三维结构(通过例如结晶 学、核磁共振光谱学(NMR spectroscopy)或所述领域中的技术人员已知的任何其它技 术)；小尺寸；很少或没有转录后修饰；和/或容易产生、表达以及纯化。这些蛋白支架 的来源可以是(但不限于)纤维结合蛋白(例如III型纤维结合蛋白域10)、脂质运载蛋 白、抗运载蛋白(斯凯纳A(Skerra A.)，分子识别杂志(J.Mol.Recogn.),2001,74(4):257- 75)、源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白质A的域B的蛋白质Z、具有 重复基元(比如“锚蛋白重复”、“犰狳重复”、“富含白氨酸的重复”以及“三十四 肽重复”)的硫氧还原蛋白A或蛋白质(考伊(Kohl)等人,PNAS,2003,第100卷,第4 期,1700-1705)。举例来说，抗运载蛋白或脂质运载蛋白衍生物描述于美国专利公开号 20100285564、20060058510、20060088908、20050106660以及PCT公开号 WO2006/056464中，所述文献以引用的方式并入本文中。根据本发明，还可使用来源 于毒素(比如来源于蝎子、昆虫、植物、软体动物等等的毒素)以及神经元NO合成酶 (PIN)的蛋白质抑制剂的支架。
模拟抗原表位
在一些实施例中，所提供的结合剂包括模拟抗原表位，其可用于干扰流感病毒与HA多肽受体之间的交互作用。在一些实施例中，模拟抗原表位用于引发与其相应靶抗 原表位所引发相同或相似的抗体反应。在一些实施例中，靶抗原表位是在超过一种流 感亚型当中均具有保守性的序列。在一些实施例中，保守性抗原表位是在1型以及2 型流感当中均具有保守性的序列。举例来说，来自所有流感亚型的HA序列位于HA-1 (头)以及HA-2(柄)域中。在一些实施例中，抗原表位是位于HA-1/HA-2界面膜邻近抗 原表位区域(MPER)内的保守性序列。在一些实施例中，抗原表位是位于典型α螺旋和/ 或其邻近残基内的保守性序列。在一些实施例中，模拟抗原表位是肽。在一些实施例 中，模拟抗原表位是小分子、碳水化合物、脂质或核酸。在一些实施例中，模拟抗原 表位是保守性流感抗原表位的肽或非肽模拟抗原表位。在一些实施例中，通过模拟所 定义病毒抗原表位的结构，模拟抗原表位干扰流感病毒颗粒结合至其天然结合搭配物 的能力，例如通过结合至天然结合搭配物自身来干扰。
钩环肽
在一些实施例中，所提供的结合剂是钩环肽。在一些实施例中，钩环肽包含编码一或多个CDR和/或FR的氨基酸序列，所述CDR和/或FR与如下文论述的表格2以 及表格3中的抗HA抗体的相应CDR和/或FR具有至少大于65％、70％、75％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同源性和/或一致性。在一些实施例中，钩环肽包含编码一或多个VH 和/或VL链序列的氨基酸序列，所述VH和/或VL链序列与如下文论述的表格2以及 表格3中的抗HA抗体的相应VH及VL链序列具有至少大于65％、70％、75％、 80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％同源性和/或一致性。
核酸
在某些实施例中，结合剂是或包含核酸，比如DNA或RNA。在某些实施例中， 核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单股的或双股的。在一些实施例中，核酸可包 括一或多个非天然核苷酸；在一些实施例中，核酸仅包括天然核苷酸。在一些实施例 中，核酸经设计可模拟血球凝集素(HA)多肽内的抗原表位。在一些实施例中，核酸经 设计可模拟一或多种流感HA多肽亚型内的保守抗原表位。在一些实施例中，所提供 的结合剂是或包含一或多种寡核苷酸。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含一 或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含二级结构，比如环、发夹、折叠或其组合。在一 些实施例中，所提供的结合剂是或包含一或多种寡核苷酸，所述寡核苷酸包含高阶(三 阶或四阶)结构。在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含适体。
靶向结合
在一些实施例中，结合剂是或包含能够结合至所选结合部位的药剂。在一些实施例中，这种结合剂是经工程改造或设计的多肽。在一些实施例中，这种所选结合部位 位于血球凝集素(HA)多肽内。在一些实施例中，这个所选结合部位位于HA多肽的 MPER区域内。在一些实施例中，这种所选结合剂能够结合至HA多肽MPER区域内 的所选结合部位。举例来说，在一些实施例中，结合剂设计成具有适当尺寸，以便其 糖基化不会阻止其结合至MPER区域。在一些实施例中，结合剂结合至糖基化MPER 区域的亲和力为其对于否则相同的非糖基化MPER区域的亲和力的至少5％、10％、 15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或更大。在一些实施例中，结合剂结合至位于HA-1(头)和/或HA-2 (柄)域内的HA多肽序列。在一些实施例中，结合剂结合至位于HA-1/HA-2界面膜邻 近抗原表位区域(MPER)内的HA多肽序列。在一些实施例中，结合剂结合至位于典型 α螺旋和/或其邻近残基内的HA多肽序列。
在一些实施例中，结合剂通过与一或多个靶残基交互作用而结合至其所选结合部位。在一些实施例中，这些靶残基是氨基酸、醣类、脂质或其组合。在一些实施例 中，本发明提供结合剂，所述结合剂结合至HA多肽、HA多肽上的N连接型聚糖、 HA受体、HA受体上的唾液酸化聚糖，或其不同组合。在一些实施例中，结合至HA 受体的结合剂与HA受体上的一或多个聚糖交互作用。在一些实施例中，结合剂结合 唾液酸化聚糖。在一些实施例中，结合剂与流感病毒竞争结合至HA受体。在一些实 施例中，结合剂与流感病毒竞争结合，使得流感病毒与HA受体之间的结合减少至少 1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8 倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍或至少20倍。在一些实施例中， 结合剂与流感病毒竞争结合至HA受体上的聚糖。
在许多实施例中，结合剂具有小于约1000个氨基酸的长度。在一些实施例中，结合剂的长度小于约1000、975、950、925、900、875、850、825、800、775、750、 725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、 350、325、300、275、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、 140、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、 55、50、45、40、35、30、25或20个氨基酸长度的最大长度。在一些实施例中，结合 剂的长度大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79或更多个氨基酸长度的最小长度。在一些实施例中，结合剂的长 度介于这些最小长度中的任一者与这些最大长度中的任一者之间，只要最大长度比最 小长度长。在一些特定实施例中，结合剂的长度介于约20个与500个氨基酸之间，或 介于30个与400个氨基酸之间，或介于40个与300个氨基酸之间，或介于80个与 250个氨基酸之间。在一些实施例中，结合剂的长度为约84、88、93、95、98、104、 106、110、111、116、119、123、124、132、212、215、244或245个。
结合剂修饰
在一些实施例中，结合剂包含天然氨基酸。在其他实施例中，结合剂包含一或多个非天然氨基酸。在一些实施例中，结合剂包含天然氨基酸与非天然氨基酸的组合。 在一些实施例中，结合剂包含一个、两个或两个以上共价或非共价结合的多肽链。在 一些实施例中，结合剂可连接到更长多肽链或可为更长多肽链的一部分，只要结合剂 保持其用于交互作用的三维结构以及排列。在一些实施例中，结合剂可附接到作为或 不为结合剂的另一个多肽序列的N末端或C末端。在一些实施例中，结合剂并入作为 或不为结合剂的另一个多肽序列中，借此将多肽序列分成两个或两个以上区段。
在一些实施例中，将结合剂附接到作为或不作为结合剂的另一多肽序列的N末端或C末端或内部可实现以下至少一者或多者：免疫原性降低、循环寿命延长、活体内 降解减慢、激发局部免疫反应、与免疫***分子交互作用、体积增加、对结合剂靶的 亲和力增加、对结合靶的特异性增加，或使用其它常用治疗性/预防性递送方案。在一 些实施例中，将结合剂附接到作为或不作为结合剂的另一多肽序列的N末端或C末端 或内部对于结合剂结合至标靶(例如HA多肽、HA多肽中的MPER区域、HA多肽上的 N聚糖、HA受体或HA受体上的唾液酸化聚糖)不具有直接影响。
结合剂偶联物
在一些实施例中，所提供的结合剂是或包含偶联物，其中含有结合剂部分(包含结合剂或其功能部分或由结合剂或其功能部分组成)与所偶联部分。在一些特定实施例 中，如本文所述的结合剂是与一或多种活性剂或“负载”(比如治疗剂或检测剂)结合而 提供和/或使用。在一些这样的实施例中，结合剂与活性剂和/或负载之间的结合包含至 少一种共价交互作用，以便提供结合剂偶联物。
在一些实施例中，治疗性负载药剂是效应实体，其具有所要活性，例如抗病毒活性、消炎活性、细胞毒性活性等等。治疗剂可以是或包含任何类别的化学实体，包括 例如蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸、小有机分子、非生物聚合物、金属、离子、 放射性同位素等等。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂可具有与治疗流感感 染的一或多种症状或病因有关的生物活性(例如抗病毒、疼痛缓解、消炎、免疫调节、 睡眠诱导活性等等)。在一些实施例中，根据本发明使用的治疗剂具有一或多种其它活 性。
在一些实施例中，负载检测剂是或包含可使用化验检测的任何部分，例如由于其特定功能特性和/或化学特征而可检测出。这些药剂的非限制实例包括酶、放射性标 记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和性分 子、有色颗粒或配体，比如生物素。
许多适当的负载检测剂，以及用于其连接到结合剂的***，在所属领域中已为我们所知(参见例如美国专利第5,021,236号、第4,938,948号以及第4,472,509号，各专 利以引用的方式并入本文中)。这些负载检测剂的实例尤其包括顺磁性离子、放射性同 位素、荧光染料、NMR可检测物质、X射线成像剂。举例来说，在一些实施例中，顺 磁离子是以下一或多者：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕 (III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金 (III)、铅(II)和/或铋(III)。
在一些实施例中，放射性同位素是以下一或多者：砹211、14碳、51铬、36氯、 57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、 32磷、镭223、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m、钍227和/或钇90。放射性标 记抗体可根据所述领域中众所周知的方法产生。举例来说，单克隆抗体可以通过与碘 化钠和/或碘化钾以及化学氧化剂(比如次氯酸钠)或酶促氧化剂(比如乳过氧化物酶)接触 来进行碘化。所提供的结合剂可通过配体交换方法(例如用亚锡溶液使过锝酸盐还原、 使所还原的锝螯合至交联葡聚糖凝胶管柱(Sephadex column)上并且将抗体施加到这个管 柱上)、用锝99m标记。在一些实施例中，所提供的结合剂是使用直接标记技术来标 记，例如通过将过锝酸盐、还原剂(比如SNCl2)、缓冲溶液(比如邻苯二甲酸钠钾溶液) 和抗体一起培养。常用于使作为金属离子存在的放射性同位素结合至抗体的中间体官 能基是二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
在一些实施例中，荧光标记尤其是或包含以下一或多者：Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY- TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3、Cy5,6-FAM、异硫氰酸荧光素、 HEX、6-JOE、俄勒冈绿488(Oregon Green 488)、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平 洋蓝(Pacific Blue)、REG、若丹明绿(Rhodamine Green)、若丹明红、肾造影剂 (Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基若丹明和/或得克萨斯红(Texas Red)。
使结合剂连接或结合至负载的若干方法在所属领域中已为我们所知。一些连接方法涉及使用金属螯合物络合物，其使用例如有机螯合剂，比如二乙三胺五乙酸酐 (DTPA)；乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3连接至 抗体(美国专利第4,472,509号以及第4,938,948号，各以引用的方式并入本文中)。所提 供的结合剂也可与酶在偶合剂(比如戊二醛或过碘酸盐)存在下反应。具有荧光素标记的 偶联物是在这些偶合剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应来制备。
产生抗流感抗体
所提供的抗体和/或其特征部分，或编码其的核酸，可以通过任何可利用的手段产生。产生抗体(例如单克隆抗体和/或多克隆抗体)的方法在所述领域中已众所周知。应 了解，各种各样的动物物种可用于产生抗血清，包括兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或 山羊。正如所述领域中的技术人员所知，选择动物可根据操作简易性、血清成本或需 要量决定。应了解，抗体还可以利用转基因方式产生，这是通过产生针对所关注的免 疫球蛋白重链和轻链序列进行转基因的哺乳动物或植物以及由其以可回收形式产生抗 体。就转基因产生的哺乳动物来说，可从山羊、牛或其它哺乳动物的乳液中产生并且 回收抗体。参见例如美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号以及第 5,741,957号。
所提供的抗体(或特征部分)可例如通过经工程改造以表达本发明的编码抗体的核酸 的宿主细胞***来产生。或者或另外，所提供的抗体可部分或完全地通过化学合成(例 如使用自动化肽合成仪)制备。
适于本发明的抗体制剂的例示性来源包括(但不限于)条件培养基，其来源于培养表 达所关注蛋白质的重组细胞系，或来源于例如产生抗体的细胞、细菌、真菌细胞、昆 虫细胞、转基因植物或植物细胞、转基因动物或动物细胞、或动物血清、腹水液、融 合瘤或骨髓瘤上层清液的细胞提取物。适合的细菌细胞包括(但不限于)大肠杆菌 (Escherichiacoli)细胞。适合的大肠杆菌菌株实例包括：HB101、DH5α、GM2929、 JM109、KW251、NM538、NM539，以及不能使外来DNA裂解的大肠杆菌菌株。可使 用的适合真菌宿主细胞包括(但不限于)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤 氏酵母(Pichia pastoris)以及曲霉属(Aspergillus)细胞。适合的昆虫细胞包括(但不限于) S2Schneider细胞、D.Mel-2细胞、SF9、SF21、High-5TM、Mimic TM-SF9、MG1及 KC1细胞。适合的例示性重组细胞系包括(但不限于)BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系、人成 视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾细胞系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中国仓鼠 卵巢细胞(CHO)、小鼠足细胞、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人***细胞(HeLa)、犬 肾细胞、布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞、人肺细胞、人肝脏细胞、小鼠***肿瘤细 胞、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞以及人肝癌细胞系(HepG2)。
所关注的抗体可以使用所述领域中已知的各种载体(例如病毒载体)表达并且可在所 述领域中已知的各种条件下培养(例如分批馈入)。对细胞进行遗传工程改造以产生抗体 的各种方法在所述领域中已众所周知。参见例如奥萨贝尔(Ausabel)编(1990),最新分子 生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)(威利，纽约(Wiley,New York))。
所提供的抗体可以在必要时使用过滤、离心和/或各种色谱方法(比如HPLC或亲和色谱)来提纯。在一些实施例中，所提供抗体的片段是通过包括使用酶(比如胃蛋白酶或 木瓜蛋白酶)消化的方法和/或通过化学还原使二硫键裂解而获得。
还有，所属领域中的普通技术人员将了解，多肽以及尤其本文所述的抗体可以通过将产生抗体(不论是单独，还是作为复合物的一部分，包括作为病毒颗粒或病毒的一 部分)的细胞或生物体在备好筛选和/或选择能够结合至流感抗原(例如流感HA)的条件 下培养来产生、鉴别、分离和/或制备。仅举一例而言，在一些实施例中，其可适用于 在展现和/或有利于那些变异体结合至HA多肽(例如以特定特异性和/或亲和力结合至 HA多肽)的条件下制备和/或研究许多抗体。在一些实施例中，这些许多抗体是在自然 界中演化而产生。在一些实施例中，这些许多抗体是由工程改造而产生。在一些实施 例中，这些许多抗体是由工程改造与自然演化组合而产生。
将了解，所提供的抗体可按照改进抗体特征和/或活性的方式进行工程改造、制备和/或提纯。举例来说，所提供抗体的改进特征尤其包括(但不限于)稳定性增强、结合 亲和力和/或亲合力提高、结合特异性增强、产量增加、聚集减少、非特异性结合减 少。
核酸
在某些实施例中，本发明提供编码抗体或抗体的特征部分或生物学活性部分的核酸。在一些实施例中，本发明提供与编码抗体或抗体的特征或生物学活性部分的核酸 互补的核酸。
在一些实施例中，本发明提供与编码抗体或抗体的特征部分或生物学活性部分的核酸杂交的核酸分子。这些核酸可以用作例如引物或探针。仅举几个实例，这些核酸 可以用作聚合酶链反应(PCR)中的引物、用于杂交(包括原位杂交)的探针，和/或用于逆 转录-PCR(RT-PCR)的引物。
在某些实施例中，核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单股的或双股的。在一 些实施例中，核酸可包括一或多个非天然核苷酸；在一些实施例中，核酸仅包括天然 核苷酸。
用于鉴别和/或表征结合剂的***
本发明提供用于检验、表征和/或鉴别流感结合剂(例如抗HA抗体)的多种***。在一些实施例中，所提供的结合剂用于鉴别和/或表征其它流感药剂(例如抗体、多肽、 小分子等等)。
在一些实施例中，所提供结合剂通过涉及使结合剂与一或多种候选底物接触的这些***和方法表征，所述候选底物比如HA多肽的区域、HA多肽上的N聚糖、HA受 体、唾液酸化HA受体、唾液酸化HA受体上的聚糖，和/或唾液酸化HA受体上的伞 形拓扑结构聚糖。
在一些实施例中，药剂和/或候选底物可游离于溶液中、固定到载体上，和/或在细胞中表达和/或在细胞表面上表达。候选底物和/或药剂可经标记，从而对结合进行检 测。药剂或候选底物是经标记的物质。竞争性结合形式可如下完成：其中一种物质加 以标记，并且一种物质可以测量游离标记相对于所结合标记的量以测定对结合的作 用。
在一些实施例中，结合化验涉及例如使候选底物暴露于药剂以及检测候选底物与药剂之间的结合。结合化验可以在体外进行(例如在实质上仅包含所提及组分的候选试 管中；在无细胞提取物中；和/或在实质上提纯的组分中)。或者或另外，结合化验可在 细胞内和/或活体内(例如在细胞、组织、器官和/或生物体内；进一步详细描述于下文 中)进行。
在某些实施例中，至少一种药剂是与至少一种候选底物接触并且检测到有作用。在一些实施例中，例如，药剂与候选底物接触，并且监测到两种实体之间的结合。在 一些实施例中，化验可涉及使候选底物与药剂的特征部分接触。检测到药剂结合至候 选底物。应了解，可以使用药剂的片段、一部分、同源物、变异体和/或衍生物，条件 是其包含结合一或多种候选底物的能力。
药剂与候选底物的结合可以通过所述领域中众所周知的多种方法测定。本发明提供涉及固相结合剂以及检测其与一或多种候选底物交互作用的化验。因此，药剂可包 含可检测标记，比如放射性标记、荧光标记和/或发光标记。而且，候选底物可偶连到 允许间接检测(例如借助于使用采用发色底物的酶和/或借助于结合可检测抗体)的物 质。药剂构形因与候选底物交互作用所致的变化可例如根据可检测标记的发射变化来 检测。或者或另外，可借助于质谱法分析固相结合的蛋白质复合物。
在一些实施例中，药剂可以是不固定的。在一些实施例中，非固定组分可加以标记(使用例如放射性标记、抗原表位标记、酶-抗体偶联物等等)。或者或另外，可通过 免疫检测技术对结合进行测定。举例来说，可对反应混合物进行西方印迹法(Westernblotting)并且使用检测非固定组分的抗体探测印迹。或者或另外，可使用酶联免疫吸附化验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)对结合进行化验。
在某些实施例中，可直接对细胞进行化验以测得药剂与候选底物之间的结合。免疫组织化学技术、共焦技术和/或评估结合的其它技术已为所属领域中的技术人员所熟知。这些筛选化验中可以使用各种细胞株，包括为这个目的而专门加以工程改造的细 胞。筛选化验中所用的细胞实例包括哺乳动物细胞、真菌细胞、细菌细胞或病毒细 胞。细胞可以是经刺激的细胞，比如经生长因子刺激的细胞。所属领域中的技术人员 会了解，本文公开的本发明考虑了多种细胞内化验用于测量药剂结合至候选底物的能 力。
根据化验而定，可能需要细胞和/或组织培养。可使用很多不同生理学化验中的任一种来检查细胞。或者或另外，可执行分子分析，包括(但不限于)监测蛋白质表达和/ 或检验蛋白质-蛋白质交互作用的西方印迹法；监测其它化学修饰的质谱法等等。
在一些实施例中，可使用一系列浓度的药剂和/或候选底物执行本文所述的结合化 验。在一些实施例中，本文所述的结合化验用于在抗体浓度范围(例如大于约100 μg/ml、约100μg/ml、约50μg/ml、约40μg/ml、约30μg/ml、约20μg/ml、约10 μg/ml、约5μg/ml、约4μg/ml、约3μg/ml、约2μg/ml、约1.75μg/ml、约1.5μg/ml、 约1.25μg/ml、约1.0μg/ml、约0.9μg/ml、约0.8μg/ml、约0.7μg/ml、约0.6μg/ml、 约0.5μg/ml、约0.4μg/ml、约0.3μg/ml、约0.2μg/ml、约0.1μg/ml、约0.05μg/ml、 约0.01μg/ml，和/或小于约0.01μg/ml)内评估候选底物结合至药剂的能力。
在一些实施例中，本文所述的任何结合研究均可以高处理量方式执行。使用高处理量化验，有可能在一天内筛选多达数千种药剂。在一些实施例中，微量滴定盘的每 个孔可用于针对所选候选底物进行单独化验，或者，若想观察浓度和/或培育时间的影 响，则可以每5到10个孔检验单一候选底物。因此，单个标准微量滴定盘便可以对药 剂与候选底物之间的96种结合交互作用进行化验；若使用1536孔盘，则单个盘便可 对药剂与候选底物之间的多达1536种结合交互作用进行化验；比如此类。有可能每天 化验多个盘。举例来说，使用根据本发明的高处理量***，可以对抗体与候选底物之 间的结合交互作用执行多达约6,000次、约20,000次、约50,000次或超过约100,000 个化验筛选。
在一些实施例中，这些方法使用动物宿主。如本文所用，“动物宿主”包括适合于流感研究的任何动物模型。举例来说，适合于本发明的动物宿主可以是任何哺乳动物 宿主，包括灵长类动物、白鼬、猫、犬、牛、马、啮齿动物，比如小鼠、仓鼠、兔及 大鼠。在某些实施例中，本发明所用的动物宿主是白鼬。特定而言，在一些实施例 中，动物宿主在投予药剂(任选地投予本发明组合物)之前，未发生病毒暴露或感染。在 一些实施例中，动物宿主在投予药剂之前或同时，接种、感染或以其它方式暴露于病 毒。实施本发明时所用的动物宿主可通过所属领域中已知的任何方法接种、感染或以 其他方式暴露于病毒。在一些实施例中，动物宿主可鼻内接种、感染或暴露于病毒。
在一些实施例中，相对于人呼吸道中所发现的分布，适合的动物宿主可具有类似的伞形拓扑结构聚糖对于锥形拓扑结构聚糖和/或α2,6聚糖对于α2,3聚糖的分布。举例 来说，在此考虑了白鼬作为动物宿主当用作因流感病毒所致的人疾病模型时，比小鼠 可更具代表性(汤培(Tumpey)等人,科学(Science)(2007)315；655-659)。不希望受任何理 论束缚，本发明包涵如下思想：聚糖在白鼬呼吸道中的分布与在人呼吸道中的分布的 相似度比聚糖在小鼠呼吸道中的分布与在人呼吸道中的分布的相似度更大。
在多种研究的任一种研究中可以使用未处理动物和/或接种动物。举例来说，正如所属领域中所知，病毒传导研究中可使用这些动物模型。在此考虑了在病毒传导研究 中使用白鼬可以充当病毒在人中传导的可靠预测物。举例来说，病毒流感从接种动物 (例如白鼬)经空气传导到未处理动物在所属领域中已为我们所知(汤培(Tumpey)等人,科 学(Science)(2007)315；655-659)。病毒传导研究可用于检验药剂。举例来说，可以在病 毒传导研究之前、期间或之后，将药剂投予适合的动物宿主，以便测定所述药剂在动 物宿主中阻断病毒结合和/或感染性的功效。使用动物宿主病毒传导研究中所收集到的 信息，便可以预测药剂在人宿主中阻断病毒结合和/或感染性的功效。
医药组合物
本发明提供包含一或多种所提供结合剂的组合物。在一些实施例中，本发明提供至少一种结合剂及至少一种医药学上可接受的赋形剂。这些医药组合物可任选地包含 且/或与一或多种额外的治疗活性物质组合投予。在一些实施例中，所提供的医药组合 物适用于医药。在一些实施例中，所提供的医药组合物适用作预防性药剂(也就是疫苗) 来治疗或预防阴性分支的流感感染和/或与流感感染有关或相关的症状。在一些实施例 中，所提供的医药组合物适用于治疗性应用中，例如适用于罹患或易受流感感染的个 体。在一些实施例中，医药组合物是针对投予人而配制。
举例来说，本文提供的医药组合物可以无菌可注射形式(例如适合于皮下注射或静 脉内输注的形式)提供。举例来说，在一些实施例中，医药组合物是以适合于注射的液体剂型提供。在一些实施例中，医药组合物是以粉末形式(例如冻干和/或灭菌)，任选 地在真空下提供，其在注射之前用含水稀释剂(例如水、缓冲液、盐溶液等等)复水。在 一些实施例中，医药组合物是在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐 缓冲盐水等等中稀释且/或复水。在一些实施例中，应轻缓地将粉末与含水稀释剂混合 (例如不振荡)。
在一些实施例中，所提供的医药组合物包含一或多种医药学上可接受的赋形剂(例 如防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等等)。在一些实施例中，医药组合物包含一或多种防腐剂。在一些实施例中，医药组合物不包含防腐 剂。
在一些实施例中，医药组合物是以可冷冻和/或冻结的形式提供。在一些实施例中，医药组合物是以不可冷冻和/或冻结的形式提供。在一些实施例中，复水溶液和/或 液体剂型可在复水之后储存一定时段(例如2小时、12小时、24小时、2天、5天、7 天、10天、2周、一个月、两个月或更长)。
液体剂型和/或复水溶液在投予之前可能包含微粒物质和/或变色。在一些实施例中，若变色或混浊，且/或若过滤之后，微粒物质仍保留，则不应使用溶液。
本文所述的医药组合物的配方可通过药理学领域中已知或此后研发的任何方法制 备。在一些实施例中，这些制备方法包括使活性成分与一或多种赋形剂和/或一或多种其它辅助成分合并，接着必要和/或需要时将产物成形和/或包装成所要单剂量或多剂量单元的步骤。
根据本发明的医药组合物可按照单一单位剂量和/或多个单一单位剂量的形式制备、包装和/或批量出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的医药组 合物的离散量。活性成分的量一般等于投予受检者的剂量和/或这种剂量的适宜分率， 比如这种剂量的二分之一或三分之一。
活性成分、医药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分在根据本发明的医药组合 物中的相对量可根据所治疗的受检者的身份、体型和/或状况和/或根据组合物将投予的 途径来改变。举例来说，组合物可包含0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
本发明的医药组合物可另外包含医药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其可以是或包含适于所要特定剂型的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮 助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、滑润剂等等。 雷明顿的科学和药学实践(Remington's The Science and Practice of Pharmacy),第21版, A.R.耿纳诺(A.R.Gennaro),(利平科特，威廉姆斯及威尔金斯，巴尔的摩，MD (Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006))揭露用于配制医药组合物的各种 赋形剂以及用于其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相 容，比如按照有害方式与医药组合物中的任何其它组分产生任何不良的生物学效应或 以其他方式交互作用，否则其使用涵盖于本发明的范围内。
疫苗
在一些实施例中，本发明提供在罹患或易受流感感染的受检者的被动免疫(也就是 将结合剂投予受检者的免疫)中使用和/或检验的疫苗组合物。在一些实施例中，在怀孕期间，当抗体自母亲转移到胎儿时，发生被动免疫。在一些实施例中，被动免疫包括 将抗体直接投予个体(例如通过注射、口服、鼻等等)。
在一些实施例中，预防性应用可包括投予疫苗。在一些实施例中，接种疫苗适合于个别患者。举例来说，如下文所述，可自患者收集血清并且检验流感的存在，并且 在一些实施例中，检验一或多种特定流感亚型的存在。在一些实施例中，所提供疫苗 的适当接受者是罹患或易受一或多种流感亚型感染的个体，所述流感亚型可被所提供 的抗体结合和/或中和。
在一些实施例中，疫苗组合物包含至少一种佐剂。可以根据本发明使用任何佐剂。很多佐剂已为我们所知；许多这些化合物的有用纲要已由国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)制定并且可以在其网站上发现。亦可参见阿里森(Allison)(1998,生 物学标准化的发展(Dev.Biol.Stand.),92:3-11；以引用的方式并入本文中)；安凯勒斯(Unkeless)等人(1998,免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.),6:251-281；以引用的方式并入本文中)，以及菲利浦斯(Phillips)等人(1992,疫苗(Vaccine),10:151-158；以引用的方式并入本文中)。数百种不同佐剂在所属领域中已为我们所知且可以用于实施本发明。可 根据本发明使用的例示性佐剂包括(但不限于)细胞激素、凝胶型佐剂(例如氢氧化铝、 磷酸铝、磷酸钙等等)；微生物佐剂(例如包括CpG基元的免疫调节性DNA序列；内毒 素，比如单磷酰基脂质A；外毒素，比如霍乱菌毒素、大肠杆菌不耐热性毒素以及百 日咳毒素；胞壁酰二肽等等)；油乳液以及基于乳化剂的佐剂(例如弗氏佐剂(Freund's Adjuvant)、MF59[诺华(Novartis)]、SAF等等)；微粒佐剂(例如微脂粒、生物降解性微 球体、皂角苷等等)；合成佐剂(例如非离子型嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈、 合成聚核苷酸等等)；和/或其组合。其它例示性佐剂包括一些聚合物(例如聚磷腈；描 述于美国专利5,500,161中，其以引用的方式并入本文中)、Q57、QS21、角鯊烯、四氯 十氧化物等等。医药学上可接受的赋形剂预先已进一步详细描述于称为“医药组合 物”的上文章节中。
组合疗法
本发明的医药组合物可单独或与一或多种其它治疗剂(包括(但不限于)疫苗和/或抗 体)组合投予。“组合”并非旨在暗示药剂必须同时投予或配制在一起递送，但是这些递 送方法属于本发明的范围内。一般来说，每种药剂按照针对所述药剂确定的剂量以及时间表来投予。另外，本发明包涵将医药组合物与可改进其生物利用度、减少或改变 其代谢、抑制其排出或改变其在体内分布的药剂组合递送。虽然本发明的医药组合物 可用于治疗有需要的任何受检者(例如任何动物)，但是其最优选地用于治疗人。
在一些实施例中，本发明的医药组合物可与一或多种其它药剂组合投予。在一些实施例中，本发明的医药组合物可与一或多种其它医药剂(例如抗流感疫苗、抗病毒 剂、止痛药、消炎药、抗生素、甾类药剂、抗体、唾液酸酶等等)组合投予。在一些实 施例中，本发明的医药组合物和/或药剂(例如抗体)可与佐剂组合投予。
在一些实施例中，本发明的医药组合物可与一或多种抗病毒剂组合投予。在一些实施例中，这些抗病毒剂包括(但不限于)阿昔洛韦(acyclovir)、利巴韦林(ribavirin)、金刚烷胺、金刚乙胺(remantidine)、扎那米韦(zanamivir)(乐感清(Relenza))、奥司他韦(oseltamivir)(达菲(Tamiflu))、金刚烷胺、金刚烷乙胺(rimantadine)和/或其组合。
在一些实施例中，本发明的医药组合物可与一或多种疫苗组合投予。在一些实施例中，疫苗是抗病毒疫苗。在一些实施例中，疫苗是抗流感疫苗。在一些实施例中， 抗流感疫苗将治疗季节性流感(例如通常称为“流感”)。在一些实施例中，抗流感疫苗 是流感疫苗针(flu shot)和/或喷雾流感疫苗(FluMist)。在一些实施例中，抗流感疫苗靶 向一或多种HA多肽(例如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、 H12、H13、H14、H15或H16多肽)的特定组合。在一些实施例中，抗流感疫苗对于 H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7病毒的 一或多种组合具有特异性。在一些实施例中，抗流感疫苗对于H1N1病毒具有特异 性。在一些实施例中，抗流感疫苗对于H3N2病毒具有特异性。在一些实施例中，抗 流感疫苗对于H1N1以及H3N2病毒具有特异性。
在一些实施例中，医药组合物可与用于治疗与流感病毒感染相关的一或多种其它医药剂组合投予。在一些实施例中，用于治疗与流感感染相关的症状的医药剂是止痛 药、消炎药、抗生素和/或其组合。在一些实施例中，用于治疗与流感感染相关的发炎 症状的医药剂选自由以下组成的群组：NSAID、类固醇、糖皮质激素和/或其组合。在 一些实施例中，用于治疗与流感感染相关的流感症状的NSAID医药剂选自由以下组成 的群组：退热净(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、阿司匹灵(aspirin)、萘普生 (naproxen)和/或其组合。
投药方法
本发明的医药组合物可通过多种途径投予，包括口服、静脉内、肌肉内、动脉 内、皮下、心室内、透皮、皮内、直肠、***内、腹膜内、局部(如粉末、软膏、乳膏 或滴剂)、粘膜、鼻、颊内、肠内、舌下；气管内滴注、支气管滴注、和/或吸入；和/ 或口服喷雾、鼻喷雾和/或气雾剂。一般来说，最适当的投药途径将根据多种因素而 定，包括药剂性质(例如其在胃肠道环境中的稳定性)、患者的状况(例如患者是否能够 耐受口服投药)等等。
目前，口服或鼻喷雾或气雾剂途径(例如通过吸入)最常用于将治疗剂直接递送到肺 以及呼吸***。然而，本发明包涵通过任何适当途径递送本发明医药组合物(考虑药物递送科学的可能进展)。
在一些实施例中，用于吸入或气雾剂递送的制剂包含多个颗粒。在一些实施例中，这些制剂具有4、5、6、7、8、9、10、11、12或13微米的平均粒径。在一些实 施例中，用于吸入或气雾剂递送的制剂配制成干燥粉末。在一些实施例中，用于吸入 或气雾剂递送的制剂配制成湿粉末，例如通过包含润湿剂。在一些实施例中，润湿剂 选自由水、生理盐水或具有生理性pH的其它液体组成的群组。
在一些实施例中，本发明组合物以滴剂的形式投予鼻腔或口腔。在一些实施例中，一个剂量可包含多个滴剂(例如1-100、1-50、1-20、1-10、1-5等等)。
在一些实施例中，本发明组合物是使用递送计量剂量的组合物的装置投予。
适用于递送本文所述的皮内医药组合物的装置包括短针装置，比如以下专利中所述的那些装置：美国专利第4,886,499号、美国专利第5,190,521号、美国专利第 5,328,483号、美国专利第5,527,288号、美国专利第4,270,537号、美国专利第 5,015,235号、美国专利第5,141,496号、美国专利第5,417,662号。皮内组合物还可以 通过限制针刺入皮肤内的有效刺入长度的装置投予，比如WO99/34850(以引用的方式 并入本文中)中所述的那些装置，以及其功能等效物。还适合的是射流注射装置，其借 助于液体射流注射器或借助于针刺入角质层内并且产生到达真皮的射流来将液体组合 物递送到真皮。射流注射装置描述于例如美国专利第5,480,381号、美国专利第 5,599,302号、美国专利第5,334,144号、美国专利第5,993,412号、美国专利第 5,649,912号、美国专利第5,569,189号、美国专利第5,704,911号、美国专利第 5,383,851号、美国专利第5,893,397号、美国专利第5,466,220号、美国专利第 5,339,163号、美国专利第5,312,335号、美国专利第5,503,627号、美国专利第5,064,413号、美国专利第5,520,639号、美国专利第4,596,556号、美国专利第 4,790,824号、美国专利第4,941,880号、美国专利第4,940,460、WO 97/37705以及WO 97/13537。还适合的是弹道式粉末/颗粒递送装置，其使用压缩气体将粉末形式的 组合物加速通过皮肤外层而到达真皮。另外，在皮内投药的经典曼托方法(mantoux method)中可使用常规注射器。
诊断性应用
在一些实施例中，根据本发明的流感结合剂用于诊断性应用。举例来说，根据结合剂的各种结合概况，可采用诊断性化验来检测多个流感基因型和/或亚型，以便提供 泛流感结合剂(也就是泛流感抗体)，同时能够通过减法分析来剖析个别基因型和/或亚 型。
为了诊断性目的，结合剂可在多种格式中用于检测HA蛋白、辨别流感基因型和/或亚型、检测病毒粒子以及抗体。为了诊断性目的，可采用各种各样的标记，其中大 部分标记已在上文提及。这些标记包括(但不限于)荧光团、化学发光部分、放射性同位 素、酶、颗粒(例如胶态碳颗粒、金颗粒、胶乳颗粒等等)、存在高亲和力受体的配体， 以及可经活化而提供可检测信号的前标记(prolabels)。
在一些实施例中，表面涂有蛋白质，所述蛋白质可作为游离蛋白质(例如循环蛋白质)或作为完整或部分完整病毒粒子的一部分结合至流感抗原。人们可以使用本发明所 提供的结合剂结合至多种流感基因型和/或亚型。在一些实施例中，根据本发明的结合 剂结合至至少一种、两种、三种、四种、五种或超过五种不同基因型和/或亚型。
在一些实施例中，化验可涉及使表面与可含有游离蛋白质或流感结合性蛋白质的介质接触，其中所述介质可以是一或多种基因型和/或亚型的已知HA的样品或溶液。 培育并且洗涤以除去非特异性结合的蛋白质之后，可根据正化验的东西、按照各种方 式进行化验。如果正化验的血液样品怀疑呈血清阳性，则可将样品涂覆于HA蛋白质 层上，培育并且洗涤，并且确定结合至蛋白质层的人抗体的存在。人们可以使用经标 记的α人抗体(不同于针对受检者抗体的同型，其中受检者抗体在最初就已经使用)。在 针对血清阳性受检者的抗体的化验中，受检者抗体可用作对照，其中使用相同试剂检 测这些受检者血清中的任何人抗流感抗体。样品中抗体的特异性可以通过使用标记方 式不同于抗人抗体的的受检者抗体并且确定其是否被样品中的抗体阻断来证明。
如果化验样品中的流感HA蛋白，则检测是采用经标记的受检者抗体，选择是根 据人们对HA蛋白的基因分型、还是对检测感兴趣而定。洗去非特异性结合的抗体之 后，通过根据已知技术检测标记的存在来确定所标记抗体的存在。或者或另外，如果 受检者抗体结合至表面，则可使用针对HA的所标记凝集素来检测HA蛋白的存在。
可利用根据本发明的结合剂来测量其它结合剂(包括血清中的抗体、单克隆抗体、作为遗传工程的结果所表达的抗体等等)的反应性。在一些实施例中，使用完整病毒粒 子。在一些实施例中，使用构形保守性被膜蛋白。
经标记的受检者抗体可用于化验活组织检查材料中流感的存在。经标记的抗体可与固定的活检材料(比如肺切片)、与一或多种受检者标记抗体一起培育。洗去非特异性 结合的抗体之后，可根据标记的性质检测结合至活检组织细胞的抗体的存在。
在一些实施例中，根据本发明的流感结合剂可用于鉴别流感受体。所述领域的技术人员将了解，此可通过多种方式实现(桑博鲁J.(Sambrook J.)，里兹E.(Fritsch E.)及曼 尼亚提斯T.(Maniatis T.)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，纽约，1989；以及奥苏贝(Ausubel)等人编，最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)，1987； 两个文献均以引用的方式并入本文中)。典型地，蛋白质以及肽受体可以通过确定结合 剂是否能够结合HA、可抑制流感病毒粒子连接至易受流感感染的细胞来鉴别。因此， 可以此方式鉴别流感HA蛋白以及肽的受体。可将易感染细胞在流感以及抗流感HA结 合剂存在下培育，并且可使用细胞结合化验来确定在结合剂存在下连接是否减少。
可根据结合流感的能力来对筛选表达假定流感受体和/或假定流感受体文库的细胞。举例来说，可使表达假定流感受体(例如流感HA的受体)的细胞与流感蛋白质或肽 在抗体存在下接触一段时间，接触的时间以及条件足以允许流感蛋白质或肽结合至细 胞表面上的假定受体。或者或另外，在接触细胞表面上的假定受体之前，可将流感蛋 白质、肽或病毒粒子与抗体一起预培育。可通过所属领域中已知的任何手段来检测结 合，例如流式细胞术等等(参见奥苏贝(Ausubel)等人或桑博鲁(Sambrook)，同上)。相较 于不存在细胞时、不存在抗体时的结合，存在抗体时与细胞表面的结合减少指明鉴别 出流感受体。
在一些实施例中，鉴别流感受体(例如HA受体)的方法包括使用固体载体，比如珠粒、管柱等等。举例来说，流感蛋白质以及肽(例如HA蛋白和/或其片段)和/或流感病 毒粒子的受体可以通过使流感抗体连接至固体载体、接着使抗体与流感蛋白质或肽接 触足以使流感蛋白质或肽结合至抗体的时间来鉴别。由此得到假定流感受体的流感蛋 白质配体，所述假定流感受体可与固体载体上的抗体:配体复合物接触，接触的时间的 条件足以允许受体结合至流感蛋白质或肽。蛋白质可文库表达而得，或以来自天然或 重组细胞的细胞提取物或提纯的蛋白质制剂形式提供。流感蛋白质肽之间的特定结合 复合物一旦形成，便通过例如标准洗涤步骤除去未结合的流感蛋白质或肽，例如不能 特异性结合至流感蛋白质或肽的文库蛋白质或肽。接着洗提所结合的蛋白质并且通过 例如凝胶电泳进行鉴别。
试剂盒
本发明提供方便和/或有效执行本发明方法的各种各样的试剂盒。试剂盒典型地包 含根据本发明的一或多种流感结合剂。在一些实施例中，试剂盒包含用于不同目的(例如诊断、治疗和/或预防)的许多不同流感结合剂。典型地，试剂盒将包含足量的流感结 合剂以允许使用者对受检者执行多次投药和/或执行多次实验。在一些实施例中，试剂 盒供应有或包括已由购买人指定的一或多种流感抗体。
在某些实施例中，根据本发明使用的试剂盒可包括一或多个参考样品；说明书(例如用于处理样品、用于执行检验、用于解释结果、用于溶解流感结合剂的说明书)；缓 冲液；和/或执行检验所需的其它试剂。在某些实施例中，试剂盒可包含一组抗体。试 剂盒中的其它组分可包括细胞、细胞培养基、组织和/或组织培养基。
试剂盒可包含使用说明书。举例来说，说明书可告知使用者借以制备包含流感结合剂的医药组合物的正确程序，和/或将医药组合物投予受检者的正确程序。
在一些实施例中，试剂盒包括许多单位剂量的包含流感结合剂的医药组合物。可提供记忆辅助工具，例如呈数字、字母和/或其它标志形式，和/或可提供有插页表，指 明治疗日程表中投予剂量的天数/时间。为了提供其中剂量每天服用的试剂盒，可包括 形式类似于或不同于医药组合物剂量的安慰剂剂量和/或钙营养增补剂。
试剂盒可包含一或多个贮器或容器，以便可分别容纳一定的个别组分或试剂。试剂盒可包含用于将个别容器封闭于相对紧密外壳(例如塑料盆，其中可封闭说明书、包 装材料，比如发泡苯乙稀等等)中用于商业销售的构件。
在一些实施例中，试剂盒用于治疗、诊断和/或预防罹患和/或易受流感感染的受检 者。在一些实施例中，本发明试剂盒包含递送装置中的至少一种组件，例如针筒、 针、施用器、吸入器等等。在一些这样的实施例中，本发明提供的试剂盒包含递送装 置中的至少一种组件(例如吸入器和/或针筒)以及一定剂量的药剂。在一些实施例中， 试剂盒包含(i)至少一种流感结合剂；(ii)针筒、针、施用器、吸入器等等，用于将至少 一种流感结合剂投予受检者；以及(iii)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于治疗、诊断和/或预防罹患和/或易受流感感染的受检 者。在一些实施例中，这些试剂盒包含(i)至少一种流感结合剂(也就是泛流感抗体)，以冻干粉末形式提供；以及(ii)用于将冻干粉末复水的稀释剂。这些试剂盒可任选地包含 针筒、针、施用器等等，用于将至少一种流感结合剂投予受检者；和/或使用说明书。
本发明提供的试剂盒含有用于产生包含至少一种流感结合剂的疫苗的试剂。在一些实施例中，这些试剂盒可包括(i)表达流感结合剂、其特征部分和/或其生物学活性部 分的细胞；(ii)供细胞生长的培养基；以及(iii)适用于提纯抗体的管柱、树脂、缓冲液、 试管及其他工具。在一些实施例中，这些试剂盒可包括(i)含有编码流感结合剂、其特 征部分和/或其生物学活性部分的核苷酸的质粒；(ii)能够用质粒转化的细胞，比如哺乳 动物细胞系，包括(但不限于)Vero以及MDCK细胞系；(iii)供细胞生长的培养基；(iv) 不含编码流感结合剂的核苷酸的表达质粒作为阴性对照；(v)适用于提纯抗体的管柱、 树脂、缓冲液、试管及其他工具；以及(vi)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于检测一或多种样品中的流感的存在。这些样品可以是病理学样品，包括(但不限于)血液、血清/血浆、末梢血液单核细胞/末梢血液淋巴细 胞(PBMC/PBL)、痰、尿、粪便、咽拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓液、宫颈刮片、脓液 样品、食物基质，以及身体各部分(比如脑、脾脏以及肝脏)的组织。这些样品可以是环 境样品，包括(但不限于)土壤、水以及植物群。尚未列举的其它样品也可适用。在一些 实施例中，这些试剂盒包含(i)至少一种流感结合剂；(ii)已知含有流感的样品，作为阳 性对照；以及(iii)已知不含有流感的样品，作为阴性对照；以及(iv)使用说明书。
在一些实施例中，试剂盒用于中和一或多种样品中的流感。这些试剂盒可提供用至少一种流感结合剂处理含流感样品以及相对于未处理样品检验所处理样品感染培养 细胞的能力所需的材料。这些试剂盒可包括(i)至少一种流感结合剂；(ii)能够培养并且 被流感感染的细胞；(iii)不能结合至流感并中和流感的结合剂，作为阴性对照；(iv)能 够结合至流感并中和流感的结合剂，作为阳性对照；(v)已知不含有流感的样品，作为 阴性对照；(vi)已知含有流感的样品，作为阳性对照；以及(vii)使用说明书。
考虑以下实例后会进一步了解本发明的这些及其它方面，这些实例希望说明本发明的某些特定实施例，但不希望限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书限 定。
范例
实例1：鉴别以及表征流感抗体
本实例描述根据本发明所提供的各种抗体的产生和/或检验。
产生抗HA单克隆抗体并且确定框架(FR)序列。表格2描绘抗HA抗体的VH域的 例示性氨基酸序列。表格3描绘抗HA抗体的VL域的例示性氨基酸序列。重链以及轻 链中的每一者的互补决定区(CDR)用粗体描绘并且列举于表格2以及表格3的CDR1 栏、CDR2栏以及CDR3栏中。
表征例示性抗体与不同流感亚型的HA的结合。例示性抗体框架以及互补决定区的序列指明于下文表格4中。例示性抗体以有差异的结合亲和力结合至群组1和群组2 HA亚型。
表格4.例示性抗体的VH以及VL链的氨基酸序列
在体外结合化验中测试例示性抗体与HA多肽的结合。用0.2μg不同亚型(H1、 H3、H5、H7以及H9)HA多肽涂布Maxisorp 96孔盘的各孔并在4℃搁置整夜。涂有 HA多肽的盘用PBS洗涤三次并用含有1％BSA的PBST阻断。将不同浓度的例示性抗 体随C179抗体(对照)一起加入涂有HA多肽的孔中并将盘在室温下培育2小时。用 PBST洗涤盘三次并在室温下将含有药剂的孔与小鼠抗6xHis抗体(1:1000稀释度)培育 1小时。用PBST洗涤盘三次并在室温下将所有孔与山羊抗小鼠HRP抗体一起培育1 小时。培育后，用PBST洗涤孔并使用TMB底物测量所结合的HRP。将TMB底物加 入孔中，培育3分钟，随后添加1N硫酸。测量450nm吸光度。
正如图2A(底图)以及图2B中所见，我们的结果显示例示性抗体结合至各种HA 多肽(H1、H3、H5、H7以及H9)。
实例2.例示性流感抗体与流感抗体靶之间的结合亲和力
本实例显示实例流感抗体与抗体靶之间的结合亲和力(以平衡解离常数(KD)表示)的 计算。在这个实例中，抗体是实例1的抗体并且抗体靶是不同流感病毒株的HA多 肽。
例示性抗体与HA多肽之间的结合亲和力是抗体和HA多肽两者的浓度的函数。在本实例中，结合亲和力是使用平衡解离速率常数(KD)来定量地描述。如何测量解离常数 的实例描述如下。
使用如上文所述的例示性抗体、使用涂有HA多肽的盘执行ELISA化验。使用在450nm测量的吸光度计算受体的分级饱和度。依据抗体的摩尔浓度对分级饱和度作 图。将数据与以下等式拟合：
其中y是分级饱和度，I0是抗体浓度并且KD是平衡解离速率常数。
使用上文提及的计算，并且应用回归分析，我们已观察到不同流感亚型的HA多 肽的有差异KD数值(图2A，顶图)。在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚 型来说，我们已观察到例示性抗体的KD数值在0.01nM至100nM范围内。在一些实 施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性抗体的KD数值 在0.1nM至500nM范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至HA多肽亚型来说， 我们已观察到KD数值在10nM至100nM范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至 HA多肽亚型来说，我们已观察到KD数值在50nM至100nM范围内。
实例3.流感抗体的动力学速度评价
本实例说明例示性流感抗体在体外结合化验中降低病毒感染性的能力。本实例显示计算实例流感抗体与抗体靶之间的结合亲和力(以结合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)以及平衡解离常数KD表示)的替代方法。在这个实例中，抗体是实例1的抗体并且 抗体靶是不同流感病毒株的HA多肽。
例示性抗体与HA多肽之间的结合亲和力是抗体和HA多肽两者的浓度的函数。在本实例中，结合亲和力是使用结合常数(ka)、解离常数(kd)以及平衡常数(KD)进行定量描述。如何测量并且计算这些常数的实例描述如下。
在实验中，使用BiacoreTM***实时监测例示性抗体与各种HA多肽之间的动力学速率交互作用。Biacore***是根据表面等离子体共振(SPR)的原理工作，其能够准确地 测量表面折射率的变化。简短来说，将一种交互作用物(配体)固定在感应芯片表面上。 使含有潜在结合搭配物的溶液通过所固定表面，并且结合以表面折射率随时间的变化 (响应单位(RU))直观化。表面等离子体共振允许交互作用以无标记方式快速直观化，从 而减少标记对所关注交互作用的潜在影响。
使以下生物素化多肽各自结合至单独Biacore感应芯片的表面上：H1(A/所罗门群岛(Solomon Islands)/03/06)、H3(A/怀俄明州(Wyoming)/3/2003)、H5(A/越南 /1203/2004)、H7(A/荷兰/219/03)以及H9(A/香港/1073/99)。使不同浓度的抗体通过芯 片用于SPR结合分析。依据以RU度量的响应差异相对于时间对数据作图。使用以下 等式计算不同的动力学速率值：
其中d[AB]是RU，其中[A]是抗体浓度，[B]是[Rmax-R]，ka是结合常数，kd是解离 常数并且KD是平衡解离常数。
使用上文提及的计算法，我们已观察到抗体与不同流感亚型的HA多肽之间第动力学结合速率(图3A至3E)。在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来 说，我们已观察到例示性抗体的KD数值在0.01nM至100nM范围内。在一些实施例 中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性抗体的KD数值在 0.1nM至500nM范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至HA多肽亚型来说，我们 已观察到KD数值在10nM至100nM范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至HA 多肽亚型来说，我们已观察到KD数值在50nM至100nM范围内。
在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性 抗体的ka数值在0.01×105M-1s-1至0.1×105M-1s-1范围内。在一些实施例中，对于抗体 结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性抗体的ka数值在0.1×105M-1s-1至 1.0×105M- 1s-1范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我 们已观察到例示性抗体的ka数值在1.0×105M-1s-1至1.0×106M-1s-1范围内。
在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性 抗体的kd数值在0.01×10-5至0.1×10-5s-1范围内。在一些实施例中，对于抗体结合至不 同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示性抗体的kd数值在0.1×10-5至1.0×10-5s-1范 围内。在一些实施例中，对于抗体结合至不同HA多肽亚型来说，我们已观察到例示 性抗体的kd数值在1.0×10-5至10.0×10-6s-1范围内。
实例4.抗体在体外抑制病毒感染性
本实例说明例示性流感抗体在体外结合化验中防止病毒感染性的能力。
使用MDCK(马丁-达比犬肾(Madin-Darby Canine Kidney))细胞(通常用于繁殖以及 检验流感病毒株的上皮细胞系)，评价实例1的例示性流感抗体在体外抑制流感感染的能力。抗体对感染性的抑制作用是通过测量病毒产量和流感诱导宿主细胞发生细胞病 变效应(CPE)的程度来测定。采用病毒斑化验以及qRT-PCR来量化病毒产生。使用细胞 存活率化验来测量CPE程度。实验配置成允许抗体在一小时预培育期间首先结合至其 病毒靶，随后引入宿主细胞。在低含量的胰蛋白酶(1μM)存在下进行感染。病毒斑化验 是通过用汇合的单细胞层接种试样的连续稀释液并用聚合物艾维素(Avicel)(FMC生物 聚合物公司(FMCBiopolymers))覆盖来进行。使病毒斑在35℃滋长48个小时，用福马 林(formalin)固定，用结晶紫染色并目测(图4)。利用病毒斑计数来计算试样的感染病毒 滴度。感染后的活细胞相对数目用作CPE的度量。使次汇合细胞培养物在35℃暴露于 化合物/病毒混合物(moi＝1.0)一小时。接着除去未结合的以及药物并且用病毒生长培养 基置换。培育48小时之后，使用普洛麦格(Promega)的CellTiter Blue试剂(刃天青 (resazurin))测定细胞存活率，以及非荧光刃天青代谢转化为荧光试卤灵(resorufin)读数 的程度(555/585nm激发/发射；SpectraMax M2；分子探针公司(Molecular Probes))。
从这些研究中，我们已发现例示性抗体抑制病毒诱导病毒斑产生。
实例5.流感抗体的IC50评价
本实例说明例示性流感抗体在体外结合化验中防止病毒感染性的能力。
靶向HA的抗流感药剂的IC50预先已量化。研究已利用H1N1流感病毒株PR8(A/ 波多黎各/8/34)。简短来说，汇合的MDCK细胞用PR8[4E3PFU/mL]感染并与不同浓 度的抗流感药剂一起预培育40分钟。感染一小时之后，除去培养基并用无病毒的含药 物培养基或无病毒无药物的培养基置换，此根据实验而定。在37℃、5％CO2培育48 小时之后，收集上层清液。分离病毒RNA，并且使用专门用于病毒M蛋白质的引物、 通过实时PCR量化病毒滴度。
对实例1例示性抗体的IC50值的初始评估是通过微量中和化验、随后通过定量 PCR(qPCR)来确定。病毒(PR8)与靶向流感的抗体分别在不同滴度以及浓度下的混合物 在35℃预培育1小时，随后施加于96孔组织培养盘(约10,000个细胞/孔)的MDCK细 胞培养物中。培育额外48小时之后，自每个孔收集培养基以获得病毒产量。
将来自三份样品的培养基合并，接着通过qPCR来直接量化病毒产量。借助于内标曲线、利用PCR Ct值计算病毒滴度，并且通过对所计算的滴度相对于抗体浓度作图 (图5)来测定IC50值。结果显示0.5μg/ml实例1抗体将PR8病毒颗粒抑制50％(IC50)。 这些结果表明，实例1的抗体能够抑制流感病毒感染性。在一些实施例中，我们已观 察到抑制不同流感病毒株的流感感染性的IC50值在0.01μg/ml至10μg/ml范围内。在 一些实施例中，我们已观察到抑制不同流感病毒株的流感感染性的IC50值在0.1μg/ml 至100μg/ml范围内。
实例6.流感抗体活体内结合HA多肽
本实例说明流感抗体活体内结合HA多肽的能力。
评价实例1的例示性流感抗体活体内抑制流感感染的能力。更特定而言，进行化验以评价感染之前在不同浓度下投予的抗体在减少流感感染性方面是否可以起到预防 的作用。
自查尔斯河实验室(Charles River Labs)获得BALB/c小鼠(4到6周龄)。将小鼠称重 并分成四组，每组6只，用于实验。群组由以下组成：第1组-无治疗对照组；第2组- 在第-1、0及1天用抗病毒药物治疗；第3组-用6mg/kg单剂量抗体治疗；及第4组- 用10mg/kg单剂量抗体治疗。在感染前的第一天(第-1天)，每个组投予异氟烷，并且 服用对照物、75mg/kg抗病毒药物利巴韦林以及流感抗体(6mg/kg或10mg/kg)并且允 许恢复(<2min)。次日(第0天)，每个组再投予异氟烷并且用致死剂量的H1N1PR8病 毒进行鼻内攻击。如上所指出，第2组还在实验第0天及第1天投予75mg/kg。每天 监测小鼠的与病毒感染相关的体重降低变化历时14天，并且每天记录存活率。小鼠流 感感染的临床征象包括蜷缩姿势、毛皮起皱、呼吸促迫、食欲丧失、体重降低及死 亡。图6说明经抗体预防性处理的那些小鼠相较于对照组显示很小的体重降低至无体 重降低。
除体重降低之外，在感染后的支气管肺泡灌洗化验中测量病毒产量。第3天，收 集第1、2及4组每一组三只动物的鼻洗涤液，并且收获其肺后，将其处死。将三只小 鼠的支气管肺泡灌洗液合并并且通过qPCR直接量化病毒产量。分离病毒RNA，并且 使用专门用于病毒M蛋白质的引物、通过实时PCR量化病毒滴度。借助于内标曲线、 利用PCR Ct值计算病毒滴度。图7中呈现的数据表明，流感感染之前的单一预防性抗 体处理使得感染降低的水平(如通过病毒负荷所说明)类似于抗病毒药物利巴韦林。
这些研究的结果尤其显示，所提供的抗体在感染之前投予时，可成功地延迟和/或预防H1N1感染在小鼠中的发作。
实例7.评价流感抗体活体内疗法
本实例说明用于治疗的流感抗体活体内结合HA多肽的能力。
评价实例1的例示性流感抗体活体内抑制流感感染的能力。进行化验以评价感染后在不同浓度下投予的抗体在减少流感感染性方面是否可以起到治疗性疗法的作用。
自查尔斯河实验室获得BALB/c小鼠(4到6周龄)。将小鼠称重并分成三组，每组 6只，用于实验。群组由以下组成：第1组-无治疗对照组；第2组-用5mg/kg单剂量 抗体治疗；以及第3组-用10mg/kg单剂量抗体治疗。实验开始时(第0天)，每个组再 投予异氟烷并且用致死剂量的H1N1PR8病毒进行鼻内攻击。感染后两天(第2天)，每 个组再投予异氟烷，并且服用对照物、5mg/kg流感抗体或10mg/kg流感抗体并且允许 恢复(<2min)。每天监测小鼠的与病毒感染相关的体重降低变化历时14天，并且每天 记录存活率。小鼠流感感染的临床征象包括蜷缩姿势、毛皮起皱、呼吸促迫、食欲丧 失、体重降低及死亡。图8说明经抗体疗法处理的那些小鼠显示一或多种感染症状的 逆转。举例来说，相较于对照组，与病毒相关的体重降低逆转，引起存活率提高。这 些结果指明，抗体疗法可逆转与流感感染相关的疾病状态以及症状。
实例8.抗体活体内药物动力学评价
本实例描述流感抗体活体内的药物动力学特性。
自查尔斯河实验室获得BALB/c小鼠(4到6周龄)并且单组6只小鼠置放用于实 验。每个小鼠接受5mg/mL抗体的单一快速注射。在180小时期间内的预定时间点收 集血清样品。使用如本文所述的方法、通过ELISA评价所收集的样品。简短来说，用 0.2μg人IgG涂布maxisorp 96孔盘的各孔并且在4℃搁置整夜。涂有人IgG的盘用 PBS洗涤三次并用含有1％BSA的PBST阻断。抗体注射之后的180小时期间收集血 清样品，添加至涂有人IgG的孔并且在室温下培育盘2小时。用PBST洗涤盘三次并 在室温下将所有孔与山羊抗小鼠HRP抗体一起培育1小时。培育后，用PBST洗涤孔 并使用TMB底物测量所结合的HRP。将TMB底物加入孔中，培育3分钟，随后添加 1N硫酸。测量450nm吸光度。图9中的数据说明0到30个小时的快速分布阶段，其 中在约30小时时出现峰值血清浓度。图9还说明30到160个小时的逐步排除阶段， 显示血清抗体浓度降低，表明抗体的可能廓清或分配于小鼠身体的不同代谢区中。
实例9.结合剂用于诊断
本实例说明例示性流感抗体能够为以下提供快速方式：(a)鉴别生物样品中流感病 毒的存在以及(b)根据亚型表征病毒。
为了鉴别流感病毒的存在以及表征病毒亚型的目的，使用夹心ELISA(病毒分型ELISA化验)。在病毒分型ELISA化验中，用2μg流感抗体涂布96孔盘并且在4℃培 育整夜。接着用PBS充分地洗涤盘并且用含有1％BSA的PBST阻断1小时。阻断 后，用PBST洗涤盘并且在4℃储存直到进一步使用。
怀疑含有流感病毒的生物样品直接或在处理后在样品缓冲液(PBS)中稀释。将所稀 释的样品施加于涂有流感抗体的孔中并且在室温(RT)下培育2小时，随后充分洗涤。 样品中的病毒因此被流感抗体捕捉并且其本身供进一步分析。在室温下将亚型特异性 抗体施加于不同孔中维持1小时。用PBST进一步洗涤之后，将与HRP偶联的二次抗 体施加于孔中。培育后，洗涤孔，并用TMB底物以及1N硫酸处理。使用分光光度计 测量450nm吸光度。包括适当的阴性以及阳性对照物。
病毒分型ELISA化验的结果产生关于样品中流感病毒的存在以及病毒亚型的信息。
实例10.抗体用于流感病毒聚糖表征
本实例说明例示性流感抗体作为富集和标记流感病毒的手段以便使用聚糖分型化 验进行聚糖表征的能力。
在聚糖分型化验中，使用EDC化学技术、根据厂家说明书使流感抗体与Qdot 525羧基量子点(Qdot 525Carboxyl Quantum Dots)偶联。将Qdot-流感抗体复合物加入经处理的生物样品中并且充分搅拌2小时。接着将样品离心并且用PBST洗涤Qdot-流感抗 体复合物三次。接着将这一复合物涂覆于聚糖阵列(含有伞形与锥形拓扑结构聚糖)上。 在室温下培育2小时之后，用PBST洗涤孔三次。使用SpectraMax M2e分光光度计、 使用底阅读模式测量所结合的荧光。
这个化验的结果产生关于流感病毒聚糖表征的信息。
实例11.最小抑制活性化验
使用测定流感抗体针对流感A的最小抑制浓度(MIC)的方法。为了在这个化验中具有活性，流感抗体必须结合至病毒并且中和病毒形成斑块的能力。简短来说，将流感 抗体在PBS中连续两倍增量稀释，以在多个孔中形成浓度梯度。间已知数量的病毒斑 形成单位加入每个孔中并且培育1小时之后，将混合物加入MDCK单层中以允许病毒 结合。艾维素覆盖层促进病毒斑形成并且通过免疫染色来使病毒斑直观化。防止病毒 斑形成的最低药剂浓度是以MIC报道。这些研究是利用H1N1病毒株PR8(A/波多黎各 /8/34)。测定代表性流感抗体在化验中相对于H1N1的活性。
等效例
所属领域中的技术人员将认识到，或仅使用常规实验便能够判明本文所述的本发明特定实施例的许多等效例。不希望本发明的范围限于上述说明，而是如下文权利要 求书中所阐明。
序列表
<110> 麻省理工学院
<120> 流感中和药剂
<130> 0492612-0931
<150> US 61/645,453
<151> 2012-05-10
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 1
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Glu Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Tyr Phe Asn Pro Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 2
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 3
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 4
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 4
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 5
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 7
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 8
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 9
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 9
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Phe Tyr Asp Ile Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 10
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 11
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 12
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Ile Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Asn Gly Tyr Phe Asp Ile Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 13
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Asn Gly Phe Tyr Asp Ile Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 14
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Asn Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Ser Gly Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 15
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 16
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Thr Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser
100 105 110
Gln Gly Phe Tyr Asp Ile Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Thr Lys
130
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 1
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 1
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 2
<400> 19
Ser Tyr Asp Gly Ser Tyr
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 2
<400> 20
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1 5
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 21
Asp Ser Glu Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asn Pro
20
<210> 22
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 22
Asp Gly Lys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Tyr
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 23
Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Tyr
20
<210> 24
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 24
Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Tyr
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 25
Asp Thr Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Phe Tyr Asp Ile
20
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 26
Asp Ser Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Pro
20
<210> 27
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 27
Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Tyr
20
<210> 28
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 28
Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Ile Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Asn Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Ile
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 29
Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Asn Gly
1 5 10 15
Phe Tyr Asp Ile
20
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 30
Asp Ser Asn Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Tyr
20
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 31
Asp Ser Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Phe Asp Pro
20
<210> 32
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VH链CDR 3
<400> 32
Asp Thr Gln Leu Arg Thr Ile Val Tyr Phe Glu Trp Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Phe Tyr Asp Ile
20
<210> 33
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 33
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Tyr Asn
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr
85 90 95
Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 34
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser
100 105
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Arg Ser
20 25 30
Ile Ser Gly Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 36
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Phe Ser
20 25 30
Tyr Lys Gly Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asp
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Gly Val Pro Ser Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr
85 90 95
Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser
100 105 110
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asn
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 39
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Ser
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Phe Ser
20 25 30
Tyr Lys Gly Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 41
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asp
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asn
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Ser
20 25 30
Tyr Lys Asn Tyr Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Trp Gly Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
85 90 95
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 44
Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Tyr Asn Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala
1 5 10 15
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 45
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Arg Ser Ile Ser Gly Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 47
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Phe Ser Tyr Lys Gly Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 48
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asp Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asn Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 50
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Ser Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 51
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Pro Phe Ser Tyr Lys Gly Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 52
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asp Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 53
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Asn Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 1
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Phe Ser Tyr Lys Asn Tyr Val Ala
1 5 10 15
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 2
<400> 55
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 2
<400> 56
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 2
<400> 57
Trp Gly Ser Tyr Leu Tyr Ser
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 2
<400> 58
Trp Gly Ser Tyr Leu Glu
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 3
<400> 59
Gln Gln Tyr Tyr Arg Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性VL链CDR 3
<400> 60
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5

Claims (17)

1.一种抗体试剂，其
(a)具有重链可变区，所述重链可变区：
(i)与SEQ ID NO:1的重链可变区相比，显示至少99％的实质上序列同源性；且
(ii)与SEQ ID NO:1共有至少一个CDR；以及
(b)具有轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:33-43中的一者相比，显示至少99％的实质上序列同源性。
2.如权利要求1所述的抗体试剂，其中所述轻链可变区进一步共有SEQ ID NO:33-43中的一者中至少一个CDR。
3.一种检测样品中血球凝集素(HA)多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
将样品接触抗体，所述抗体：
(a)具有重链可变区，所述重链可变区：
(i)与SEQ ID NO:1的重链可变区相比，显示至少99％的实质上序列同源性；且
(ii)与SEQ ID NO:1共有至少一个CDR；以及
(b)具有轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:33-43中的一者相比，显示至少99％的实质上序列同源性；以及
检测样品中的结合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述样品为或包括以下的一者或多者：
血液、血清/血浆、末梢血液单核细胞/末梢血液淋巴细胞(PBMC/PBL)、痰、尿、粪便、咽拭子、皮肤病变拭子、脑脊髓液、宫颈刮片、脓液样品、食物基质，以及身体各部分(比如脑、脾脏以及肝脏)的组织。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述样品为环境样品。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述环境样品为或包括土壤、水以及植物群中的一者或多者。
7.一种包括工程化抗体的组合物，所述工程化抗体：
(a)具有重链可变区，所述重链可变区：
(i)与SEQ ID NO:1的重链可变区相比，显示至少99％的实质上序列同源性；且
(ii)与SEQ ID NO:1共有至少一个CDR；以及
(b)具有轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:33-43中的一者相比，显示至少99％的实质上序列同源性。
8.一种细胞系，其表达如权利要求1或2所述的抗体试剂。
9.如权利要求8所述的细胞系，其中所述细胞系是哺乳动物细胞系。
10.如权利要求8所述的细胞系，其中所述细胞系是融合瘤。
11.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物进一步包括医药学上可接受的赋形剂。
12.一种试剂盒，其包含：
如权利要求7所述的组合物；
用于将至少一种抗体投予受检者的针筒、针或施用器；以及
使用说明书。
13.一种抗体试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗罹患或易受流感感染的患者，所述抗体试剂：
(a)具有重链可变区，所述重链可变区：
(i)与SEQ ID NO:1的重链可变区相比，显示至少99％的实质上序列同源性；且
(ii)与SEQ ID NO:1共有至少一个CDR；以及
(b)具有轻链可变区，所述轻链可变区与SEQ ID NO:33-43中的一者相比，显示至少99％的实质上序列同源性。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体试剂经调配通过选自由以下组成的群组投予：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、皮下、心室内、透皮、皮内、直肠、***内、腹膜内、局部、粘膜、鼻、颊内、肠内、舌下、气管内或支气管。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体试剂经调配以通过气管内滴注或支气管滴注投予。
16.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体试剂经调配以通过吸入投予。
17.如权利要求13所述的用途，其中所述抗体试剂经调配以通过口服喷雾、鼻喷雾或气雾剂投予。
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