CN109265424A - 一种黄酮类衍生物及其制备方法和鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄酮类衍生物,所述衍生物结构式包括如通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)所示:其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环,R3为烷基、芳基或芳烷基,n取值为1~10。本发明还公开了一种黄酮类衍生物的制备方法和鉴定方法。
Description
技术领域
本发明涉及黄酮类衍生物的研究,具体涉及一种黄酮类衍生物及其制备方法和鉴定方法。
背景技术
恶性肿瘤是基因突变导致的细胞调节失控,细胞自由的、无限制的增殖。细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)与细胞周期蛋白B(Cyclin B)结合形成复合物,在其它CDK/Cyclin缺失的情况下,仍能催化底物磷酸化,推动细胞完成***进程。因而,CDK1成为抗肿瘤药物研究的潜在靶点,CDK1抑制剂的研究成为抗肿瘤药物开发的新方向。
目前开发的CDKs抑制剂主要是ATP竞争性的抑制剂。不同的CDKs虽然在细胞周期进程中所起的作用不同,但是由于他们ATP结合区域的结构非常相似,所以早期开发的CDKs抑制剂往往是非选择性的。非选择性CDKs抑制剂在治疗过程中往往容易引起恶心,呕吐,疲惫和肝功能紊乱等副作用,因此开发选择性的CDKs抑制剂迫在眉睫。
CDK1的晶体结构未见报道。但是基于已知的CDK2等激酶的晶体结构,可以CDK1进行同源模建,得到其晶体结构。对CDK1的ATP结合部位进行分析,发现其主要由疏水性口袋1(Pocket1),和疏水性口袋2(Pocket2)以及袋口能与底物相互作用的氨基酸残基组成。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题,本发明的发明目的之一是设计开发了一种黄酮类衍生物。
本发明的发明目的之二是设计开发了上述黄酮类衍生物的制备方法。
本发明的发明目的之三是设计开发了上述黄酮类衍生物的鉴定方法。
本发明提供的技术方案为:
一种黄酮类衍生物,所述衍生物结构式包括如通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)所示:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环,R3为烷基、芳基或芳烷基,n取值为1~10。
优选的是,R1、R2和氮原子形成四氢吡咯环;
R1、R2和氮原子形成吗啉环;或者
R1、R2和氮原子形成N-甲基哌嗪环。
优选的是,R1、R2均为丙基。
优选的是,R3为芳基。
所述的黄酮类衍生物的制备方法,其包括使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物;
其中,具有通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)和通式(Ⅴ)的化合物为:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环。
优选的是,使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅲ)的化合物用水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应后,边搅边倒入准备好的冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,将滤饼真空干燥,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤,将滤饼真空干燥,得到具有通式(Ⅳ)的化合物;
取具有通式(Ⅳ)的化合物适量,加入一定量的甲醇溶解,称取当量的胺试剂和甲醛加入到反应瓶中,在20-65℃反应,薄层色谱法检测反应进程,直至反应完全,待有大量固体析出后过滤,收集固体,用少量甲醇分三次洗涤固体,将固体于真空干燥箱中烘干,得到具有通式(Ⅴ)的化合物。
优选的是,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物的过程如下:
称取相应有机酸适量,加入一定量的无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入N-羟基苯并三氮唑,然后称取二环己基碳酰二亚胺,溶于一定量的无水四氢呋喃然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用;
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定无水四氢呋喃,在搅拌条件下,依次加入对二甲氨基吡啶、三乙胺,在室温下搅拌,然后将活性酯滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中继续反应,薄层色谱法检测反应进程,待反应达到平衡,将反应液浓缩至干,用硅胶柱层析分离,聚酰胺柱分离,薄层制备,重结晶等方法纯化得到具有通式(Ⅰ)的化合物。
优选的是,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定量N,N-二甲基甲酰胺,在搅拌条件下,依次加入1,4-二溴丁烷,碳酸钾,碘化钾,在氮气保护下,60℃~70℃条件下搅拌反应;然后将上述反应液过滤出去多余的碳酸钾和碘化钾,在反应液中加入几滴甲酸,然后将反应液减压浓缩至干,浓缩液放凉后加入冰水将化合物分散在水中形成悬浊液,调节pH至中性,然后过滤得到滤饼;滤饼在真空干燥后用硅胶柱层析分离,纯化得到具有通式(Ⅱ)的化合物。
所述的黄酮类衍生物的鉴定方法,其特征在于,对具有通式(Ⅰ)的化合物鉴定过程包括:
将具有通式(Ⅰ)的化合物通过核磁共振氢谱和碳谱进行初步结构确定后,与具有通式(Ⅳ)的化合物和具有通式(Ⅴ)的化合物进行氢原子的数量和位移比较,确定胺亚甲基的反应位置和初步酯化位置;
将具有通式(Ⅰ)的化合物与氯化锶反应,生成绿色至棕色乃至黑色沉淀,则确定生成了具有通式(Ⅰ)的化合物。
优选的是,将具有通式(Ⅰ)的化合物与氯化锶反应过程包括:
取具有通式(Ⅰ)的化合物置小试管中,加入甲醇溶解,加入氯化锶的甲醇溶液,再加已用氨蒸气饱和的甲醇溶液,注意观察有无沉淀生成。
本发明与现有技术相比较所具有的有益效果:
1、以CDK1为靶标,靶点明确,将计算机辅助药物设计与合理药物设计相结合,以黄芩素为先导化合物设计合成一类具有选择性的新型CDK1抑制剂;
2、首次对黄芩素的7位和8位同时进行修饰,提高对CDK1的选择性抑制作用;
3、采用光谱学解析和化学鉴定相结合的方法,证明了对黄芩素mannich碱的酯化和醚化发生在7位酚羟基上,确定了目标化合物的准确结构。
附图说明
图1为本发明的实验设计思路。
图2为本发明所述的具有通式(Ⅴ)的化合物酯化反应示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明中以黄芩素为先导化合物,保留与CDK1活性区域疏水性口袋外侧氨基酸结合所必须的基团,同时在能与CDK1催化中心Pocket1结合的位置引入疏水性基团,以期开发出高效低毒、选择性高的新型黄酮类CDK1抑制剂。
如图1所示,本发明以CDK1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)为靶点,利用合理药物设计的原理方法,以黄芩素为先导化合物,保留能与CDK1中Pocket 2相互结合的官能团,对黄芩素6位(7位)羟基、8位氢原子进行选择性修饰,在8位引入胺甲基侧链,增强与袋口的氨基酸残基的相互作用;重点研究在6位(7位)羟基上引入不同取代基,考察其与CDK1催化中心Pocket 1的嵌合情况,阐明其对抗肿瘤活性的影响,根据6位连接取代基的不同,将设计的化合物分为A,B两个系列,即黄芩素的酯衍生物和醚衍生物;
其中,A类化合物的合成路线如下:
B类化合物的合成路线如下:
本发明提供了具有通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)的黄酮类化合物:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环,R3为烷基、芳基或芳烷基,n取值为1~10。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成四氢吡咯环。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成吗啉环。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成N-甲基哌嗪环。
在另一种实施例中,R1、R2均为丙基。
在另一种实施例中,R3为芳基。
本发明还提供了一种黄酮类衍生物的制备方法,使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物;
其中,具有通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)和通式(Ⅴ)的化合物为:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成四氢吡咯环。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成吗啉环。
在另一种实施例中,R1、R2和氮原子形成N-甲基哌嗪环。
在另一种实施例中,R1、R2均为丙基。
在另一种实施例中,R3为芳基。
在另一种实施例中,使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅲ)的化合物用水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应后,边搅边倒入准备好的冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,将滤饼真空干燥,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤,将滤饼真空干燥,得到具有通式(Ⅳ)的化合物;
取具有通式(Ⅳ)的化合物适量,加入一定量的甲醇溶解,称取当量的胺试剂和甲醛加入到反应瓶中,在20-65℃反应,薄层色谱法检测反应进程,直至反应完全,待有大量固体析出后过滤,收集固体,用少量甲醇分三次洗涤固体,将固体于真空干燥箱中烘干,得到具有通式(Ⅴ)的化合物。
在另一种实施例中,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物的过程如下:
称取相应有机酸适量,加入一定量的无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入N-羟基苯并三氮唑,然后称取二环己基碳酰二亚胺,溶于一定量的无水四氢呋喃然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌12小时,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用;
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定无水四氢呋喃,在搅拌条件下,依次加入对二甲氨基吡啶、三乙胺,在室温下搅拌,然后将活性酯滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中继续反应,薄层色谱法检测反应进程,待反应达到平衡,将反应液浓缩至干,用硅胶柱层析分离,聚酰胺柱分离,薄层制备,重结晶等方法纯化得到具有通式(Ⅰ)的化合物。
在另一种实施例中,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定量N,N-二甲基甲酰胺,在搅拌条件下,依次加入1,4二溴丁烷,碳酸钾,碘化钾,在氮气保护下,60℃~70℃条件下搅拌反应;然后将上述反应液过滤出去多余的碳酸钾和碘化钾,在反应液中加入几滴甲酸,然后将反应液减压浓缩至干,浓缩液放凉后加入冰水将化合物分散在水中形成悬浊液,调节pH至中性,然后过滤得到滤饼;滤饼在真空干燥后用硅胶柱层析分离,纯化得到具有通式(Ⅱ)的化合物。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的具体说明。
实施例1
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),吗啉0.696mL(0.008mol),将反应瓶于55℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出;将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-1)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.38g,产率93.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6 600MHz)δ:8.09(m,2H,H-2′,6′),7.58-7.63(m,3H,H-3′,4′,5′),6.96(s,1H,H-3),3.95(s,2H,H-9),3.62(s,4H,H-11,12),2.61(s,4H,H-10,13).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:182.7(C-4),163.0(C-2),154.7(C-8a),148.5(C-5),146.4(C-7),132.3(C-4′),131.6(C-1′),129.7(2C-3′,5′),129.4(C-6),126.7(2C-2′,6′),104.9(C-3),104.1(C-5a),100.6(C-8),66.5(2C-11,12),53.1(2C-10,13),52.0(C-9).
称取苯甲酸0.226g(0.0018mol),加入30mL无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入HOBT(1-羟基苯并***)0.354g(0.00262mol),然后称取DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)0.541g(0.00262mol),溶于20mL四氢呋喃中,然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌反应12h,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用。
称取8-吗啉亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-1)所示的化合物)1.0g(0.00271mol),加入无水四氢呋喃50mL,在搅拌条件下,依次加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.066g(0.00054mol),三乙胺1mL,然后将上述备用滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中,在室温下搅拌反应24h,将反应液浓缩至干,得黄色产物,用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇80:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅰ-1)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:13.17(s,1H,5-OH),8.13(m,4H,H-2′,6′,2″,6″),7.72-7.79(m,1H,H-4″),7.57-7.65(m,5H,H-3′,4′,5′,3″,5″),7.01(s,1H,H-3),4.17(s,2H,H-9),3.68(s,4H,H-12,13),2.81(s,4H,H-11,14).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:182.3(C-4),164.1(C-10),163.2(C-2),160.7(C-8a),152.8(C-5),152.1(C-7),134.4(C-4″),132.5(C-1′),131.4(C-4′),130.3(2C-2″,6″),129.7(2C-3′,5′),129.4(2C-3″,5″),129.2(C-1″),126.9(2C-2′,6′),123.1(C-6),105.2(C-3),102.7(C-5a),99.5(C-8),65.8(2C-12,13),52.7(C-9),52.4(2C-11,14).
实施例2
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),四氢吡咯0.496mL(0.006mol),将反应瓶于45℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出;将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-2)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.31g,产率92.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.05-8.06(m,2H,H-2′,6′),7.57-7.58(m,3H,H-3′,4′,5′),6.81(s,1H,H-3),4.35(s,2H,H-9),3.12(s,4H,H-10,13),1.90(s,4H,H-11,12).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:180.9(C-4),163.8(C-2),161.0(C-8a),150.1(C-5),143.7(C-7),132.0(C-4′),131.7(C-1′),130.7(C-6),129.6(2C-3′,5′),126.5(2C-2′,6′),104.9(C-3),101.0(C-5a),97.2(C-8),53.2(2C-10,13),49.7(C-9),23.4(C-11,12).
称取对甲氧基苯甲酸0.387g(0.00255mol),加入30mL无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入HOBT(1-羟基苯并***)0.378g(0.0028mol),然后称取DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)0.525g(0.00255mol),溶于20mL四氢呋喃中,然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌反应12h,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用。
称取8-四氢吡咯亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-2)所示的化合物)1.0g(0.0028mol),加入无水四氢呋喃50mL,在搅拌条件下,依次加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.066g(0.00054mol),三乙胺0.8mL,然后将上述备用滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中,在室温下搅拌反应24h,将反应液浓缩至干,得黄色产物,用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇70:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅰ-2)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(CDCl3,600MHz)δ:12.89(s,1H,5-OH),8.24(d,J=12.0Hz,2H,H-2″,6″),7.83(d,J=6Hz,2H,H-2′,6′),7.54(m,3H,H-3′,4′,5′),6.97(d,J=12.0Hz,2H,H-3″,5″),6.63(s,1H,H-3),4.28(s,2H,H-9),3.88(s,3H,H-15),2.87(s,4H,H-11,14),1.92(s,4H,12,13).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(CDCl3,151MHz)δ:182.4(C-4),164.2(C-10),163.8(C-4″),162.9(C-2),160.5(C-8a),152.8(C-5),151.5(C-7),132.7(2C-2″,6″),131.7(C-4′),131.6(C-1′),129.2(2C-3′,5′),126.1(2C-2′,6′),123.1(C-6),121.4(C-1″),113.7(C-3″,5″),105.6(C-3),103.7(C-5a),98.8(C-8),55.5(C-15),53.6(2C-11,14),51.9(C-9),23.7(2C-12,13).
实施例3
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),二丙胺0.656mL(0.0048mol),将反应瓶于45℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出;将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-3)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.41g,产率92.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:12.57(s,1H,5-OH),8.04-8.06(m,2H,H-2′,6′),7.56-7.61(m,3H,H-3′,4′,5′),6.85(s,1H,H-3),4.27(s,2H,H-9),2.77(t,J=6Hz,4H,H-10,13),1.64(m,4H,H-11,14),0.88(t,J=6Hz,6H,H-12,15).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:181.7(C-4),161.8(C-2),160.7(C-8a),148.8(C-5),144.9(C-7),132.0(C-1′),131.8(C-4′),130.3(C-6),129.6(2C-3′,5),126.6(2C-2′,6′),105.0(C-3),102.3(C-5a),97.7(C-8),54.8(2C-10,13),50.4(C-9),18.7(2C-11,14),11.8(2C-12,15).
量取α-甲基丙烯酸0.185mL(0.00217mol),加入30mL无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入HOBT(1-羟基苯并***)0.323g(0.00239mol),然后称取DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)0.493g(0.00239mol),溶于20mL四氢呋喃中,然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌反应12h,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用。
称取8-二丙胺亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-3)所示的化合物)1.0g(0.00261mol),加入无水四氢呋喃50mL,在搅拌条件下,依次加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.066g(0.00054mol),三乙胺1mL,然后将上述备用滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中,在室温下搅拌反应24h,将反应液浓缩至干,得黄色产物,用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇100:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅰ-3)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:13.10(s,1H,5-OH),8.05-8.07(m,2H,H-2′,6′),7.56-7.62(m,3H,H-3′,4′,5′),6.83(s,1H,H-3),6.23(s,1H,H-12E),5.84(s,1H,H-12Z),4.35(s,2H,H-9),2.92(t,J=6Hz,4H,H-11,14),1.99(s,3H,H-19),1.68(m,4H,H-12,15),0.87(t,J=6Hz,6H,H-13,16).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:181.0(C-4),167.4(C-10),164.8(C-2),161.8(C-8a),153.3(C-5),152.1(C-7),135.9(C-17),132.0(C-4′),131.7(C-1′),129.6(2C-3′,5′),127.4(C-6),126.7(2C-2′,6′),124.3(C-18),105.0(C-3),99.6(C-5a),97.2(C-8),54.4(2C-11,14),50.1(C-9),18.7(C-19),17.9(2C-12,15),11.6(2C-13,16).
实施例4
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),N-甲基哌嗪0.443mL(0.0048mol),将反应瓶于50℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出;将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-4)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.37g,产率89.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.07-8.08(m,2H,H-2′,6′),7.57-7.61(m,3H,H-3′,4′,5′),6.93(s,1H,H-3),4.02(s,2H,H-9),2.69(s,4H,H-10,13),2.51(s,4H,H-11,12),2.20(s,3H,H-14).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:182.4(C-4),162.6(C-2),156.2(C-8a),148.4(C-5),146.0(C-7),132.2(C-4′),131.6(C-1′),129.6(2C-3′,5′),126.7(2C-2′,6′),104.9(C-3),103.7(C-5a),100.0(C-8),54.7(2C-10,13),52.2(2C-11,12),45.9(C-9).
量取α-甲基丙烯酸(0.0018mol),加入30mL无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入HOBT(1-羟基苯并***)0.323g(0.00239mol),然后称取DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)0.493g(0.00239mol),溶于20mL四氢呋喃中,然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌反应12h,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用。
称取8-N-甲基哌嗪亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-4)所示的化合物)1.0g(0.00261mol),加入无水四氢呋喃50mL,在搅拌条件下,依次加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)0.066g(0.00054mol),三乙胺1mL,然后将上述备用滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中,在室温下搅拌反应24h,将反应液浓缩至干,得黄色产物,用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇80:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅰ-4)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:13.06(s,1H,5-OH),7.08-7.10(m,2H,H-2′,6′),7.57-7.63(m,3H,H-3′,4′,5′),6.93(s,1H,H-3),6.26(s,1H,H-12E),5.87(s,1H,H-12Z),4.20(s,2H,H-9),2.89(s,4H,H-14,17),2.51(s,4H,H-15,16),2.23(s,3H,H-18),2.00(s,H,H-13).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:181.8(C-4),164.8(C-10),163.0(C-2),162.6(C-8a),152.9(C-5),152.0(C-7),135.6(C-11),132.3(C-4′),131.5(C-1′),129.6(2C-3′,5′),127.9(C-6),126.8(2C-2′,6′),123.5(C-12),105.1(C-3),101.6(C-5a),98.7(C-8),53.7(2C-14,17),52.4(C-9),51.5(2C-15,16),45.6(C-18),18.7(C-13).
实施例5
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),吗啉0.696mL(0.008mol),将反应瓶于55℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出;将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-1)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.38g,产率93.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.09(m,2H,H-2′,6′),7.58-7.63(m,3H,H-3′,4′,5′),6.96(s,1H,H-3),3.95(s,2H,H-9),3.62(s,4H,H-11,12),2.61(s,4H,H-10,13).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:182.7(C-4),163.0(C-2),154.7(C-8a),148.5(C-5),146.4(C-7),132.3(C-4′),131.6(C-1′),129.7(2C-3′,5′),129.4(C-6),126.7(2C-2′,6′),104.9(C-3),104.1(C-5a),100.6(C-8),66.5(2C-11,12),53.1(2C-10,13),52.0(C-9).
称取8-吗啉亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-1)所示的化合物)1g(0.0031mol),加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)30mL,在搅拌条件下,依次加入1,4-二溴丁烷0.478mL(0.0040mol),碳酸钾1.28g,碘化钾1.54g,在氮气保护下,60℃~70℃条件下搅拌反应7h,然后将上述反应液过滤出去多余的碳酸钾和碘化钾,在反应液中加入几滴甲酸,然后将反应液减压浓缩至干,放凉后加入冰水将化合物分散在水中形成悬浊液,调节pH至中性,然后过滤得到滤饼。滤饼在真空干燥后用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇=100:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅱ-1)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(CDCl3,600MHz)δ:12.89(s,1H,5-OH),7.92-7.94(m,2H,H-2′,6′),7.52-7.58(m,3H,H-3′,4′,5′),6.68(s,1H,H-3),4.74(s,2H,H-9),4.30(t,J=5.4Hz,2H,H-10),3.83(s,2H,H-13),3.70(s,4H,H-15,16),2.58(s,4H,H-14,17),2.07(m,2H,H-11),1.86(m,2H,H-12).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(CDCl3,151MHz)δ:183.0(C-4),164.0(2C-2,8a),157.7(C-5),151.4(C-7),131.9(C-6),129.2(2C-1′,4′),126.3(4C-2′,3′,5′,6′),106.2(2C-3,5a),105.1(C-8),73.6(2C-10,13),71.5(2C-15,16),67.2(C-9),53.3(C-17),50.2(C-14),28.8(2C-11,12).
实施例6
称取黄芩苷(如式(Ⅲ)所示的化合物)4g用20mL水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸100mL,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应5min后,边搅边倒入准备好的500mL冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,滤饼真空干燥24h后,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤3次,将滤饼真空干燥24h,得到黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.74g,产率71.9%。
称取黄芩素(如式(Ⅳ)所示的化合物)1.08g(0.004mol)于150mL反应瓶中,加入甲醇30mL做溶剂,在搅拌条件下,依次加入37%的甲醛溶液0.486mL(0.006mol),四氢吡咯0.496mL(0.006mol)。将反应瓶于45℃条件下反应,薄层色谱法监测反应进程,直至反应完全,有大量黄色固体析出,将黄色固体抽滤,用少量甲醇洗涤滤饼(如式(Ⅴ-2)所示的化合物),将滤饼于真空干燥箱中干燥,称重:1.31g,产率92.5%。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:8.05-8.06(m,2H,H-2′,6′),7.57-7.58(m,3H,H-3′,4′,5′),6.81(s,1H,H-3),4.35(s,2H,H-9),3.12(s,4H,H-10,13),1.90(s,4H,H-11,12).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:180.9(C-4),163.8(C-2),161.0(C-8a),150.1(C-5),143.7(C-7),132.0(C-4′),131.7(C-1′),130.7(C-6),129.6(2C-3′,5′),126.5(2C-2′,6′),104.9(C-3),101.0(C-5a),97.2(C-8),53.2(2C-10,13),49.7(C-9),23.4(C-11,12).
称取8-四氢吡咯亚甲基黄芩素(如式(Ⅴ-2)所示的化合物)1g(0.0028mol),加入DMF(N,N-二甲基甲酰胺)30mL,在搅拌条件下,依次加入1,4-二溴丁烷0.478mL(0.0040mol),碳酸钾1.28g,碘化钾1.54g,在氮气保护下,60℃~70℃条件下搅拌反应7h,然后将上述反应液过滤出去多余的碳酸钾和碘化钾,在反应液中加入几滴甲酸,然后将反应液减压浓缩至干,放凉后加入冰水将化合物分散在水中形成悬浊液,调节pH至中性,然后过滤得到滤饼。滤饼在真空干燥后用硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷:甲醇=200:1),重结晶进一步纯化得目标化合物(如式(Ⅱ-2)所示的化合物)。
核磁共振氢谱分析:1H-NMR(DMSO-d6,600MHz)δ:12.94(s,1H,5-OH),8.11(d,J=7.2Hz,2H,H-2′,6′),7.59-7.64(m,3H,3′,4′,5′),7.04(s,1H,H-3),4.64(t,J=5.6Hz,1H,H-10),4.15(t,J=5.1Hz,1H,H-13),3.71(s,2H,H-9),3.53(s,4H,H-14,17),2.46(s,4H,H-11,12),1.96(t,J=5.6Hz,2H,H-15),1.73(t,J=5.6Hz,2H,H-16).
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(DMSO-d6,151MHz)δ:183.1(C-4),163.9(C-2),158.0(C-8a),153.6(C-5),151.2(C-7),132.6(C-6),131.4(C-4′),131.1(C-1′),129.7(2C-3′,5′),126.9(2C-2′,6′),106.9(C-3),106.1(C-5a),105.0(C-8),73.5(C-10),72.2(C-13),66.8(2C-14,17),53.6(2C-11,12),50.2(C-9),28.7(C-15),24.7(C-16).
本发明还提供了对具有通式(Ⅰ)的化合物的鉴定包括如下过程:
黄芩素(具有通式(Ⅳ)的化合物)中三个酚羟基活性顺序为:7位羟基>6位羟基>5位羟基,酯化反应优先发生在7位,但是考虑到具有通式(Ⅴ)的化合物中8位取代基空间位阻的影响,酯化可能发生在6位(如图1所示)。
1、光谱学方法确证过程:
将所得具有通式(Ⅰ)的化合物通过核磁共振氢谱、碳谱、质谱进行初步结构确定,与黄芩素(具有通式(Ⅳ)的化合物)相比,该系列化合物氢谱化学位移4.3左右单峰2个氢为9位亚甲基以及在氢谱化学位移为1~5之间多了相应的氢原子,为8位所接胺甲基氮原子所连碳原子上的氢,由此,可以确定在8位引入了胺亚甲基,化学位移7.28左右多了酯化反应引入的芳香有机酸相应个数的氢,可以证明有机酸与黄芩素(具有通式(Ⅳ)的化合物)的曼尼希碱成酯,在化学位移12.8左右有较钝的单峰为5位酚羟基上的氢,说明5位酚羟基没有被取代。
碳谱的化学位移50左右的1个碳为9位亚甲基上的碳以及10~50左右为相应的仲胺的碳,进一步可以证明在8位引入了胺亚甲基,在160~180左右多出的一个碳原子为10位的羰基碳,以及在芳香区苯环的128左右多了相应的碳原子,也可以进一步证明有酯键形成。
通过质谱的分子离子峰与预期化合物的相对分子质量比较确认,在6位(7位)酚羟基为单取代,所合成的酯化产物只接了一份子羧酸,通过上述波谱数据分析结构可能为具有通式(Ⅰ)的化合物和具有通式(Ⅹ)的化合物:
通过上述氢谱、碳谱、质谱数据不能确认酯键形成在6位还是在7位,由于通式(Ⅰ)的化合物结构的特殊性,二维核磁也没有办法很好的确认酯键的具体生成位置,因此,本发明又结合化学方法来确认具有通式(Ⅰ)的化合物的具体结构。
2、化学方法确定过程
确定依据为:分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物在氨性甲醇溶液中,可与氯化锶(SrCl2)生成绿色至棕色乃至黑色沉淀,通过该方法可以判定所合成的化合物分子中是否有邻二酚羟基,进而确定取代基的位置,其确定依据如下:
(1)、若是曼尼希碱7位酚羟基被取代成酯,化合物6位与5位酚羟基形成邻二酚羟基,用该法将成阳性反应。
(2)、若是曼尼希碱6位酚羟基被取代成酯,化合物分子中无邻二酚羟基,用该法将成阴性反应。
反应方程式:
具体实验方法:取约1.0mg检品(具有通式(Ⅰ)的化合物)置小试管中,加入1.0ml甲醇溶解(必要时可在水浴上加热),加入3滴0.01mol/L氯化锶的甲醇溶液,再加3滴已用氨蒸气饱和的甲醇溶液,注意观察有无沉淀生成。
实验结果:具有通式(Ⅰ)的化合物成阳性反应,生成了黑色沉淀。
实验结论:本课题组合成的化合物4分子中具有邻二酚羟基,可知6位与5位酚羟基形成邻二酚羟基,即6位没有取代基,酰基接到了分子的7位。
综合波谱数据和化学方法可以确认本发明合成的具有通式(Ⅰ)的化合物为7位酚羟基形成酯键,8位胺亚甲基的系列化合物;在本实施例中,以如式(Ⅰ-2)所示的化合物的结构为例进行说明:
该化合物为黄色粉末,MS(ESI,negative)m/z:486.1580[M-H]+;
核磁共振氢谱分析:1H–NMR(CDCl3,600MHz)δ:12.89(1H,s,5-OH),8.24(2H,d,J=12.0Hz,H-2′,6′),7.83(2H,d,J=6Hz,H-3″,5″),7.54(3H,m,H-3′,4′,5′),6.97(2H,d,J=6Hz,H-2″,6″),6.63(1H,s,H-3),4.28(2H,s,H-9),3.88(3H,s,H-15),2.87(4H,s,H-11,14),1.92(4H,s,H-12,13);
核磁共振碳谱分析:13C-NMR(CDCl3,151MHz)δ:182.4(4),164.2(10),163.8(2),162.9(4″),160.5(8a),152.8(5),151.5(7),132.7(2″,6″),131.7(6),131.6(1′),129.2(3′,5′),126.1(2′,6′),123.1(4′),121.4(1″),113.7(3″,5″),105.6(5a),103.7(3),98.8(8),55.5(15),53.6(11,14),51.9(9),23.7(12,13).
试验例
对如式(Ⅱ-1~4)所示的化合物和如式(Ⅱ-1~2)所示的化合物进行抗癌活性实验,采用CCK8法对该化合物以及先导化合物黄芩素,阳性对照CPG74514A进行抗MCF-7肿瘤细胞增殖活性实验;实验结果如表1所示。
表1 MCF-7抗癌活性实验
实验结果表明,如式(Ⅱ-1)、(Ⅱ-2)、(Ⅰ-3)、(Ⅰ-4)所示的化合物抑制MCF-7肿瘤细胞的增殖的活性强于先导化合物黄芩素,如式(Ⅱ-2)所示的化合物活性与CDK1选择性抑制剂CPG74514A相当,说明具有结构通式(Ⅱ)和部分具有通式(Ⅰ)的化合物能明显抑制MCF-7肿瘤细胞的增殖,能够开发成抗肿瘤药物。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种黄酮类衍生物,其特征在于,所述衍生物结构式包括如通式(Ⅰ)和通式(Ⅱ)所示:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环,R3为烷基、芳基或芳烷基,n取值为1~10。
2.如权利要求1所述的黄酮类衍生物,其特征在于,R1、R2和氮原子形成四氢吡咯环;
R1、R2和氮原子形成吗啉环;或者
R1、R2和氮原子形成N-甲基哌嗪环。
3.如权利要求1所述的黄酮类衍生物,其特征在于,R1、R2均为丙基。
4.如权利要求1-3中任一项所述的黄酮类衍生物,其特征在于,R3为芳基。
5.权利要求1-4中任一项所述的黄酮类衍生物的制备方法,其包括使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物;
对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物;
其中,具有通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)和通式(Ⅴ)的化合物为:
其中,R1为烷基或环烷基,R2为烷基或环烷基,R1、R2和氮原子形成脂肪环或者杂环。
6.如权利要求5所述的黄酮类衍生物的制备方法,其特征在于,使用具有通式(Ⅲ)的化合物脱葡萄糖醛酸后得到具有通式(Ⅳ)的化合物,再经过胺甲基取代得到具有通式(Ⅴ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅲ)的化合物用水溶解呈糊状,缓慢加入50%硫酸,90℃水浴机械搅拌至澄清,继续反应后,边搅边倒入准备好的冰水中,然后对其进行减压抽滤,滤饼用水洗至近中性,弃去滤液,将滤饼真空干燥,取适量乙酸乙酯分散成均一悬浊液,减压抽滤,滤饼用乙酸乙酯洗涤,将滤饼真空干燥,得到具有通式(Ⅳ)的化合物;
取具有通式(Ⅳ)的化合物适量,加入一定量的甲醇溶解,称取当量的胺试剂和甲醛加入到反应瓶中,在20-65℃反应,薄层色谱法检测反应进程,直至反应完全,待有大量固体析出后过滤,收集固体,用少量甲醇分三次洗涤固体,将固体于真空干燥箱中烘干,得到具有通式(Ⅴ)的化合物。
7.如权利要求6所述的黄酮类衍生物的制备方法,其特征在于,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行酯化反应得到具有通式(Ⅰ)的化合物的过程如下:
称取相应有机酸适量,加入一定量的无水四氢呋喃,在搅拌条件下加入N-羟基苯并三氮唑,然后称取二环己基碳酰二亚胺,溶于一定量的无水四氢呋喃然后用滴液漏斗将其滴加到上述反应液中于-5℃条件下搅拌,将反应液过滤,得白色固体及透明滤液,滤液备用;
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定无水四氢呋喃,在搅拌条件下,依次加入对二甲氨基吡啶、三乙胺,在室温下搅拌,然后将活性酯滤液用滴液漏斗将其缓慢滴加到此反应液中继续反应,薄层色谱法检测反应进程,待反应达到平衡,将反应液浓缩至干,用硅胶柱层析分离,聚酰胺柱分离,薄层制备,重结晶等方法纯化得到具有通式(Ⅰ)的化合物。
8.如权利要求6所述的黄酮类衍生物的制备方法,其特征在于,对具有通式(Ⅴ)的化合物进行醚化反应得到具有通式(Ⅱ)的化合物的过程如下:
取具有通式(Ⅴ)的化合物,加入一定量N,N-二甲基甲酰胺,在搅拌条件下,依次加入1,4-二溴丁烷,碳酸钾,碘化钾,在氮气保护下,60℃~70℃条件下搅拌反应;然后将上述反应液过滤出去多余的碳酸钾和碘化钾,在反应液中加入几滴甲酸,然后将反应液减压浓缩至干,浓缩液放凉后加入冰水将化合物分散在水中形成悬浊液,调节pH至中性,然后过滤得到滤饼;滤饼在真空干燥后用硅胶柱层析分离,纯化得到具有通式(Ⅱ)的化合物。
9.权利要求1-4中任一项所述的黄酮类衍生物的鉴定方法,其特征在于,对具有通式(Ⅰ)的化合物鉴定过程包括:
将具有通式(Ⅰ)的化合物通过核磁共振氢谱和碳谱进行初步结构确定后,与具有通式(Ⅳ)的化合物和具有通式(Ⅴ)的化合物进行氢原子的数量和位移比较,确定胺亚甲基的反应位置和初步酯化位置;
将具有通式(Ⅰ)的化合物与氯化锶反应,生成绿色至棕色乃至黑色沉淀,则确定生成了具有通式(Ⅰ)的化合物。
10.如权利要求9所述的黄酮类衍生物的鉴定方法,其特征在于,将具有通式(Ⅰ)的化合物与氯化锶反应过程包括:
取具有通式(Ⅰ)的化合物置小试管中,加入甲醇溶解,加入氯化锶的甲醇溶液,再加已用氨蒸气饱和的甲醇溶液,注意观察有无沉淀生成。
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