CN109258468A

CN109258468A - 一种马铃薯耐盐碱改良育种方法

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Publication number: CN109258468A
Application number: CN201811227576.6A
Authority: CN
Inventors: 王开
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-10-22
Filing date: 2018-10-22
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明公开了一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，该育种方法包括以下步骤：a）选取待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源；b）待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源杂交育种；c）对待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源分别进行花药诱导培养；d）马铃薯耐盐碱筛选压的鉴定；e）F1代杂交种花药培养，耐盐碱筛选；f）马铃薯花培幼苗壮苗生根；g）秋水仙素处理花培再生植株；h）进一步农艺性状、耐盐碱性筛选。马铃薯普通栽培品种为四倍体，遗传基础复杂，本发明利用花培技术诱导出马铃薯双单倍体，在此基础上进行耐盐碱筛选和改良育种，能显著提高筛选效率，并且极大地缩短了育种时间，加速了育种进程，不到3年即可实现马铃薯耐盐碱改良育种，对马铃薯的推广种植以及盐碱地资源的利用都具有重要意义。

Description

一种马铃薯耐盐碱改良育种方法

技术领域

本发明涉及一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，属于农作物种植和培育技术领域。

背景技术

马铃薯（学名：Solanum tuberosum L.）属茄科茄属，一年生草本植物，别称地蛋、洋芋、芋头、土豆等。马铃薯原产于南美洲安第斯山区，最早的人工栽培可追溯到大约公元前 8000年到5000年的秘鲁南部地区。马铃薯作为一种适应性广、抗灾能力强、营养全面的高产粮食与蔬菜作物，正在全球范围内大面积推广种植，根据***粮农组织（FAO）的统计，目前全世界种植马铃薯的国家和地区已达151个，其中亚洲41个，欧洲39个，非洲37个，中北美洲18个，南美洲10个，大洋洲6个。如今马铃薯已经成为了继水稻、小麦、玉米之后的世界第四大粮食作物，具有极高的经济价值和广阔的市场前景。

马铃薯在我国已有400多年的栽培历史，随着马铃薯主粮化战略的推进，其地位也将逐年提高，种植面积也将随之扩大，这对于保障国家粮食安全意义重大。从营养角度来看，马铃薯含有大量淀粉以及丰富的维生素、矿物质、氨基酸、类胡萝卜素、类黄酮等成分，比禾谷类粮食作物具有更多的优势，既能供给人体大量的热能，还能提供禾谷类粮食中所没有的维生素A和维生素C，而且马铃薯还具有抗氧化、抗衰老、健脾和胃、调解消化不良的功效，可称为“十全十美的食物”。从生长特性来，马铃薯产量高，对环境的适应性较强，种植起来更为容易，属于“省水、省肥、省药、省劲儿”的“四省”作物。据农业部分析，到2020年我国粮食需求增量将达到1000亿斤以上，但受耕地资源的约束和种植效益的影响，小麦、水稻等口粮品种继续增产的空间变小、难度加大，因此，马铃薯主粮化已成为必然的选择，预计到2020年，50%以上的马铃薯将作为主粮消费。

土壤盐碱化是一个世界性的资源问题和生态问题。据统计，全球有各种盐碱土约9.5亿公顷，占全球陆地面积的10%，广泛分布于100多个国家和地区。中国是世界上盐碱土较多的国家之一，盐碱化土壤总面积已达4万公顷，占全国可利用土地面积的4.88%，主要分布在华北、西北、东北、黄泛区和滨海地带，而且随着全球变暖、自然环境恶化，盐碱土面积还将不断扩大，土地盐碱化形势十分严峻。如果能利用广袤的盐碱化土地种植马铃薯，必将成为合理开发和利用盐碱地资源以及在不挤占三大主粮的前提下扩大马铃薯种植面积的有效途径。

研究表明，马铃薯属于盐中度敏感作物，当土壤盐碱含量超过一定限度时，马铃薯生长发育会受到抑制，严重时会造成植株死亡。因此要想利用盐碱化土地种植马铃薯，就必需选育出耐盐碱性强的马铃薯品种。常规杂交育种是目前马铃薯育种的主要手段，但是马铃薯是同源四倍体，而且是高度杂合体，染色体重组频率高，无论自交、回交都会产生分离。而马铃薯的耐盐碱性受到多基因控制且极其复杂，并受到物种与品种基因型及内部生理生化反应的综合影响。目前，育种专家在进行马铃薯耐盐碱品种选育时，需对杂交培育出的大量后代进行耐盐碱性鉴定，而鉴定方法大多采用大田多年多点鉴定法，即大田种植这些杂交后代，并给予一定的盐碱胁迫，然后根据耐盐碱性状差异，再筛选这些后代的耐盐碱性。不同的育种家评价耐盐碱与非耐盐碱品种/家系的标准不尽相同，但是都是根据在盐碱胁迫下，马铃薯形态学变化、出苗率、产量、商品薯率等表观性状进行划分的。由于大田鉴定环境不易控制，这些指标往往需要多年多点的重复鉴定才能获得相对可信的结果，因此，常规耐盐碱育种的周期都非常长，一般都7、8年，甚至10年以上，而且需要耗费大量的人力物力。

随着现代生物技术的快速发展，马铃薯育种技术必将逐渐整合现有技术方法并吸纳最新研究成果形成综合育种技术。单倍体育种技术是迄今为止创造纯和基因型最有效手段，这种技术通常是以花药培养的方式实现的。马铃薯的普通栽培种是四倍体，遗传基础较为复杂。通过花药培养方法可以获得马铃薯的双单倍体，由于其染色体组和染色体数量减半，双单倍体植株对外界胁迫的敏感性大大提高，在此水平上进行筛选，能够极大地提高筛选效率；马铃薯双单倍体经过人工手段加倍后，就能获得纯合的四倍体，通过不同纯合四倍体之间的相互杂交，可以获得不分离的杂种一代实生种子，使马铃薯杂种优势的利用成为可能，这对于用实生种子留种以解决品种的退化和种薯的调运，节约能源和成本具有十分重要的意义。此外，随着分子生物学和基因工程技术的发展，分子标记、转基因操作、基因定位、基因克隆技术的应用日益广泛，花培单倍体技术也将为上述研究提供实验材料和研究基础。

我国学者在马铃薯花药培养诱导单倍体方面已经取得了一些研究成果，但四倍体马铃薯经过常规的花药培养途径获得的再生植株往往倍性混杂，有双单倍体、四倍体以及混倍体，并且双单倍体所占比例不高，这对于我们后续利用马铃薯双单倍体植株对盐碱胁迫更敏感的特点开展耐盐碱性筛选工作有不利影响，因此我们对马铃薯花药培养过程进行有效调控，提高了再生植株中双单倍体的比例，从而极大地提高了筛选效率，成功开发出一种育种效率高、育种周期短的马铃薯耐盐碱改良育种方法，具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的是针对常规马铃薯耐盐碱育种的缺陷，提供了一种基于花药培养技术的显著缩短马铃薯耐盐碱育种周期、大大加快马铃薯耐盐碱育种速度的马铃薯耐盐碱改良育种方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：

一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，该育种方法包括以下步骤：

a）选取待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源：选取农艺性状良好但耐盐碱性不足的马铃薯栽培品种作为待改良马铃薯品种；根据马铃薯种质资源耐盐碱性评价，选取耐盐碱性能良好的种质材料种作为耐盐碱马铃薯资源；以种薯播种的方式大田种植待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源；

b）待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源杂交育种：以大田种植的待改良马铃薯品种作为母本，耐盐碱马铃薯资源作为父本，开花后人工杂交，结实后收获F1代杂交种；

c）对待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源分别进行花药诱导培养：在马铃薯现蕾期至初花期，采集待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源的花蕾并筛选出小孢子发育时期处于单核中晚期的花蕾，将花蕾预处理后转入超净工作台中进行无菌操作，先将花蕾表面消毒，然后用解剖刀和镊子剥离出花药，切去花丝后接种到诱导培养基上进行花药诱导培养，培养条件为24~26℃，黑暗；

所述诱导培养基的成分为：以不含琼脂的MS培养基为基础，再添加L-天冬酰胺4.7~5.5mg/L，番茄红素23~27mg/L，木糖醇13~19g/L，大豆卵磷脂4.0~4.6mg/L，硫酸镨30 ~36μg/L，三十烷醇 0.15~0.20mg/L，氯比脲0.4~0.6mg/L，2，4-D 1.0~1.2mg/L，马铃薯淀粉45~55g/L，陈皮素9~15mg/L，5-溴尿嘧啶2.2~2.6mg/L，pH值为5.6~6.0；

d）马铃薯耐盐碱筛选压的鉴定：分别在分化培养中加入梯度浓度的NaCl和Na₂CO₃混合溶液造成盐碱胁迫条件，待步骤c）中诱导出的待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源的愈伤组织长到2mm左右时，将其转接到上述分化培养基上进行分化培养，根据愈伤分化率选择合适的筛选压力水平浓度作为马铃薯耐盐碱筛选压；

所述分化培养的成分为：KNO₃ 2400~2600mg/L，NH₄NO₃ 1020~1100mg/L，KH₂PO₄ 350~400mg/L，MgSO₄·7H₂O 340~380mg/L，CaCl₂·2H₂O 410~460mg/L，MnSO₄·4H₂O 20~25mg/L，蛋氨酸锌 8.5~9.5mg/L，H₃BO₃ 11~14mg/L，KI 0.6~0.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.023~0.027mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.023~0.027mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.20~0.30mg/L，FeSO₄·7H₂O 27~28mg/L，Na₂-EDTA 36~37mg/L，***0.13~0.17mg/L，肌醇85~95mg/L，双甘氨肽4.4~5.0mg/L，盐酸硫胺素0.5~0.6mg/L，盐酸吡哆醇0.5~0.6mg/L，维生素K 0.3~0.5mg/L，叶酸0.5~0.8mg/L，没食子酸3.0~4.0mg/L，马铃薯泥50~60mg/L，褪黑素1.6~2.0mg/L，增产胺 0.8~1.2mg/L，2,4-表油菜素内酯0.5~0.7mg/L，4-氯本氧乙酸0.4~0.6mg/L，乙二醇缩糖醛2.2~2.4mg/L，低聚果糖7.5~8.1mg/L，5'-单磷酸胞苷11~15mg/L，麦芽糖33~37g/L，植物凝胶5~7g/L，pH值为5.6~6.0；

e）F1代杂交种花药培养，耐盐碱筛选：将F1代杂交种正季播种种植于大田，待实生苗进入现蕾期至初花期时，按照步骤c）所述的方法进行花药诱导培养，将诱导出的愈伤组织转接到添加了马铃薯耐盐碱筛选压的分化培养基（成分与步骤d）中分化培养基相同）上进行分化培养，获得马铃薯花培幼苗；

f）马铃薯花培幼苗壮苗生根：将高度在3~5cm的马铃薯花培幼苗转接到壮苗生根培养基中，培养20-28d后可获得生长健壮、根系旺盛的花培再生植株；

g）秋水仙素处理花培再生植株：将花培再生植株从瓶中取出，剪去部分根须，留根长度2~3cm，在室温下用0.05%秋水仙素和4%二甲基亚砜的混合溶液处理16h，处理结束后将植株根部残留的药液洗净，获得染色体倍性恢复为四倍的花培再生植株；

h）进一步农艺性状、耐盐碱性筛选：将上述四倍体花培再生植株移栽到温室中进行常规栽培管理，待进入结薯期后，单株收获健康种薯，将种薯进一步播种到大田里，对其耐盐碱性进行评价鉴定，筛选出耐盐碱性得到改良、农艺性状良好的马铃薯新品系。

所述步骤a）中选取的待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源均为四倍体普通栽培种，并且具有有性繁殖的能力。

所述步骤c）中筛选小孢子发育时期处于单核中晚期的花蕾的方法为：将花蕾中的花药挑取2~3枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检观察小孢子发育时期，筛选出单核中晚期对应的花蕾。

所述步骤c）中花蕾预处理的方法为：将花蕾洗净后放入40g/L的甘露醇溶液中，室温下预处理3d，然后将花蕾取出放在强度为400mT的均匀磁场中处理30min。

所述步骤c）中花蕾表面消毒的方式为：先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用用灭菌水冲洗冲洗5~6次。

所述步骤d）中NaCl和Na₂CO₃混合溶液中，二者的质量比为9:5。

所述步骤d）中合适的筛选压力水平浓度是指：待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源愈伤分化率均在1.5%~2.0%时，其分化培养基分别添加的NaCl和Na₂CO₃混合溶液的浓度，并取两者的平均值。

所述步骤d）和e）中分化培养的条件为：温度25~27℃，光照强度2000~2400Lux，每天光照13~15h。

所述步骤f）中壮苗生根培养基的成分为：以不含琼脂的1/2MS培养基为基础，再添加生根粉5号 0.1~0.2mg/L，微囊藻素16~24mg/L，活性炭0.1~0.3g/L，pH值为5.6~6.0；生根培养的条件为：温度23~28℃，光照强度2500~3000Lux，每天光照15~17h。

与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：

1、本发明针对常规四倍体马铃薯花药培养再生植株中双单倍体比例不高的问题，通过调控马铃薯花药培养流程，大大提高了花培再生植株中双单倍体的比例，为利用马铃薯双单倍体植株对盐碱胁迫敏感的特点开展耐盐碱性筛选工作提供了物质基础。

2、本发明改进和优化了四倍体马铃薯花药培养体系，提高了愈伤组织诱导率，并摸索出一种特别适用于在盐碱胁迫的条件下进行的分化培养流程。

3、本发明的育种方法结合了单倍体育种技术，F1代杂交种通过花药培养获得了双单倍体花培植株，再采用含有NaCl和Na₂CO₃的分化培养基模拟盐碱胁迫对其进行耐盐碱性筛选，再利用染色体加倍手段获得了纯合的四倍体，经过进一步的农艺性状、耐盐碱性筛选，不到3年即可获得马铃薯耐盐碱性新品系，与常规育种方法相比，极大的加快了马铃薯耐盐碱改良育种的进程，对马铃薯的推广种植以及盐碱地资源的利用都具有重要意义。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明提供的马铃薯耐盐碱改良育种方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

2015年开始，采用本发明的技术方案进行马铃薯耐盐碱改良育种工作，具体步骤如下：

（1）选取待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源：选取中薯2号作为待改良马铃薯品种，该品种是由中国农科学院蔬菜花卉研究所选育的优良品种，该品种为早熟品种，产量高、稳定性好，具体表现在单株结薯集中，平均每株4-6块，块茎大而整齐，出苗后50天即可收获商品薯，商品薯率在90%以上，块茎休眠期短，适合二季作栽培，高抗花叶和卷叶病毒。在生产实践中我们发现中薯2号耐盐碱性较差，而该品种的主栽地区河北、河南、山东、山西等地的土壤盐碱化问题也日益严重，因此对该品种进行耐盐碱性改良十分必要。根据马铃薯种质资源耐盐碱性评价，东农303的耐盐碱性表现为中上，并且该品种也为早熟品种，生育期60天左右，长势强，产量高，结薯集中，品质较好，具有有性繁殖的能力，因此选作耐盐碱马铃薯资源。2015年以种薯播种的方式大田种植中薯2号和东农303。

b）待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源杂交育种：2015年以大田种植的中薯2号作为母本，东农303作为父本，开花后人工杂交，结实后收获F1代杂交种。

c）对待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源分别进行花药诱导培养：在马铃薯现蕾期至初花期，采集中薯2号和东农303的花蕾并筛选出小孢子发育时期处于单核中晚期的花蕾（筛选方法为：将花蕾中的花药挑取2~3枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检观察小孢子发育时期，筛选出单核中晚期对应的花蕾），将花蕾洗净后放入40g/L的甘露醇溶液中，室温下预处理3d，然后将花蕾取出放在强度为400mT的均匀磁场中处理30min，将预处理后的花蕾后转入超净工作台中进行无菌操作，先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用用灭菌水冲洗冲洗5~6次，然后用解剖刀和镊子剥离出花药，切去花丝后接种到诱导培养基上进行花药诱导培养，培养条件为25℃，黑暗，统计中薯2号和东农303的愈伤组织诱导率；

采用的诱导培养基的成分为：以不含琼脂的MS培养基为基础，再添加L-天冬酰胺5.1mg/L，番茄红素25mg/L，木糖醇16g/L，大豆卵磷脂4.3mg/L，硫酸镨33μg/L，三十烷醇0.18mg/L，氯比脲0.5mg/L，2,4-D 1.1mg/L，马铃薯淀粉50g/L，陈皮素12mg/L，5-溴尿嘧啶2.4mg/L，pH值为5.8。

d）马铃薯耐盐碱筛选压的鉴定：分别在分化培养中加入浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的NaCl和Na₂CO₃混合溶液，其中NaCl和Na₂CO₃的质量比为9:5，造成盐碱胁迫条件，待步骤c）中诱导出的中薯2号和东农303的愈伤组织长到2mm左右时，将其转接到上述分化培养基上，在温度26℃、光照强度2200Lux、每天光照14h的条件下进行分化培养，统计这两个品种在各分化培养基上的愈伤分化率，并筛选愈伤分化率均在1.5%~2.0%时，其分化培养基分别添加的NaCl和Na₂CO₃混合溶液的浓度，取两者的平均值作为马铃薯耐盐碱筛选压；同时对不添加NaCl和Na₂CO₃混合溶液的分化培养基上分化出的马铃薯小苗进行倍性鉴定，统计不同倍性植株的比例；

采用的分化培养的成分为：KNO₃ 2500mg/L，NH₄NO₃ 1060mg/L，KH₂PO₄ 370mg/L，MgSO₄·7H₂O 360mg/L，CaCl₂·2H₂O 435mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.5mg/L，蛋氨酸锌 9.0mg/L，H₃BO₃12.5mg/L，KI 0.7mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.5mg/L，Na₂-EDTA 36.5mg/L，***0.14mg/L，肌醇90mg/L，双甘氨肽4.7mg/L，盐酸硫胺素0.55mg/L，盐酸吡哆醇0.55mg/L，维生素K 0.4mg/L，叶酸0.6mg/L，没食子酸3.5mg/L，马铃薯泥55mg/L，褪黑素1.8mg/L，增产胺1.0mg/L，2,4-表油菜素内酯0.6mg/L，4-氯本氧乙酸0.5mg/L，乙二醇缩糖醛2.3mg/L，低聚果糖7.8mg/L，5'-单磷酸胞苷13mg/L，麦芽糖34g/L，植物凝胶6g/L，pH值为5.8。

e）F1代杂交种花药培养，耐盐碱筛选：2016年将F1代杂交种正季播种种植于大田，待实生苗进入现蕾期至初花期时，按照步骤c）所述的方法进行花药诱导培养，将诱导出的愈伤组织转接到添加了马铃薯耐盐碱筛选压的分化培养基（成分与步骤d）中分化培养基相同）上，同样在温度26℃、光照强度2200Lux、每天光照14h的条件下进行分化培养，获得马铃薯花培幼苗。

f）马铃薯花培幼苗壮苗生根：将高度在3~5cm的马铃薯花培幼苗转接到壮苗生根培养基中（该培养基的成分为：以不含琼脂的1/2MS培养基为基础，再添加生根粉5号0.15mg/L，微囊藻素20mg/L，活性炭0.2g/L，pH值为5.8），在温度26℃，光照强度2750Lux，每天光照16h的条件下培养20-28d后可获得生长健壮、根系旺盛的花培再生植株。

g）秋水仙素处理花培再生植株：将花培再生植株从瓶中取出，剪去部分根须，留根长度2~3cm，在室温下用0.05%秋水仙素和4%二甲基亚砜的混合溶液处理16h，处理结束后将植株根部残留的药液洗净，获得染色体倍性恢复为四倍的花培再生植株。

h）进一步农艺性状、耐盐碱性筛选：将上述四倍体花培再生植株移栽到温室中进行常规栽培管理，待进入结薯期后，单株收获健康种薯，2017年将种薯进一步播种到大田里，对其耐盐碱性进行评价鉴定，筛选出耐盐碱性得到改良、农艺性状良好的马铃薯新品系。

对比例1

比较不同预处理方法以及花药诱导培养基对马铃薯花药诱导效果的影响：将实施例1步骤c）中的预处理方法改为将花蕾放置4℃冰箱预处理3d，将采用的诱导培养基替换为MS+2，4-D 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+硝酸银30mg/L+活性炭3g/L+蔗糖6%（W/V）+琼脂0.6%（W/V），该预处理方法以及花药诱导培养基均引用自申请公布号为CN 107155874 A的专利《一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基》，统计中薯2号和东农303的愈伤组织诱导率。

对比例2

比较不同分化培养基在盐碱胁迫的条件下，对马铃薯愈伤分化效果的影响：只将实施例1步骤d）中采用的分化培养基替换为MS+0.5mg/L赤霉素+2.0mg/L6-BA+3.0mg/L 玉米素，该分化培养基同样引用自专利《一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基》，分别在该分化培养基中加入浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的NaCl和Na₂CO₃混合溶液，统计中薯2号和东农303在各分化培养基上的愈伤分化率。

对比例3

比较不同花药培养流程对马铃薯花培植株倍性的影响：将实施例1中的花药培养流程即步骤c）与d）整体替换为专利《一种利用花药培养获得马铃薯双单倍体植株的方法及其培养基》中提供的方法，对中薯2号和东农303进行花药培养，具体步骤如下：

1）选择现蕾至初花期取长度为5mm的中薯2号和东农303的花蕾，放置4℃冰箱预处理3d。将处理好的材料在超净工作台无菌环境下，将花蕾先置于75％酒精溶液中表面灭菌30s，无菌水冲洗1次，随后转入0.1％升汞溶液中灭菌8min，再用无菌水冲洗3次，每次2min。灭菌后置于无菌滤纸上，用镊子与接种针将花药从花蕾中剥离出，接种于配方为MS+2,4-D1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+硝酸银30mg/L+活性炭3g/L+蔗糖6%（W/V）+琼脂0.6%（W/V）的诱导培养基上，将接种后的花药置于35℃恒温培养箱中黑暗培养72h，随后转入24℃、黑暗条件下诱导培养；

2）挑取花药裂缝处形成白色或淡黄色愈伤组织转入不添加NaCl和Na₂CO₃的分化培养基中分化培养，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃；选择分化出绿色芽点的愈伤组织转入继代培养基中培养30d，光照条件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24℃，分化培养基及继代培养基的配方为MS+0.5mg/L赤霉素+2.0mg/L6-BA+3.0mg/L 玉米素，对获得的马铃薯小苗进行倍性鉴定，统计不同倍性植株的比例。

结果分析

1、不同预处理方法以及花药诱导培养基对马铃薯花药诱导效果的影响，将实施例1与对比例1的愈伤组织诱导率结果统计如下表1。

由上表结果可以看出，实施例1中薯2号和东农303的愈伤组织诱导率分别达到了17.8%和20.5%，显著高于对比例1的愈伤组织诱导率。本发明的预处理方法采用了高温与适当的磁场处理结合的方法，尤其是磁场处理能够改变花粉的生理状态，更有利于启动雄核发育，从而提高愈伤组织诱导率；本发明的诱导培养基中添加了L-天冬酰胺、番茄红素、木糖醇、大豆卵磷脂、硫酸镨、三十烷醇 0.18mg/L、陈皮素、5-溴尿嘧啶，以及用马铃薯淀粉替代琼脂作凝固剂，都具有提高愈伤组织诱导率的作用。

2、不同分化培养基在盐碱胁迫的条件下，对马铃薯愈伤分化效果的影响，将实施例1与对比例2的愈伤组织分化率结果统计如下表2。

由上表结果可以看出，实施例1中，中薯2号和东农303在添加不同浓度NaCl和Na₂CO₃混合溶液的分化培养基上都有一定的愈伤分化率，且中薯2号愈伤分化率在1.5%~2.0%时，其分化培养基含有的NaCl和Na₂CO₃混合溶液浓度约为0.15%，东农303愈伤分化率在1.5%~2.0%时，其分化培养基含有的NaCl和Na₂CO₃混合溶液浓度约为0.4%，取二者的平均值浓度0.28%作为耐盐碱筛选压使用；对比例2中，中薯2号和东农303在添加不同浓度NaCl和Na₂CO₃混合溶液的分化培养基上的愈伤分化率极低甚至不分化，无法计算出耐盐碱筛选压。

比较实施例1与对比例2的数据，发现在没有盐碱胁迫的条件下，两个实施例中中薯2号和东农303的愈伤分化率差异不显著，而在有盐碱胁迫的条件下，愈伤分化率差异极显著，说明本发明的分化培养基更适合于在逆境胁迫的条件，进行的马铃薯花药分化培养。本发明的分化培养基改良了基本培养基中各元素的配比，并添加了***、双甘氨肽、没食子酸、褪黑素、增产胺、2，4-表油菜素内酯、乙二醇缩糖醛、低聚果糖、5'-单磷酸胞苷等物质，能够增强启动植物自身的生命活力，改善生理状况，稳定细胞膜，增强植物免疫力，提高抗逆性能。

不同花药培养流程对马铃薯花培植株倍性的影响，将实施例1与对比例3的马铃薯小苗倍性鉴定结果统计如下表3。

由上表结果可以看出，实施例1中，马铃薯小苗中双单倍体植株的比例高达89.4%，明显高于对比例3中双单倍体植株的比例，进一步统计实施例1中添加了NaCl和Na₂CO₃混合溶液的分化培养基中分化出的马铃薯小苗中双单倍体植株比例，发现二者结果并无显著差异，说明本发明提供的马铃薯花药培养流程可以大大提高花培植株中双单倍体植株的比例，减少了双单倍体植株自然加倍的出现，为后续开展耐盐碱性筛选工作提供了物质基础。

实施例1中获得染色体倍性恢复为四倍的花培再生植株127株，进一步大田种植，农艺性状、耐盐碱性筛选，最终筛选出耐盐碱性得到改良、农艺性状良好的2个的马铃薯新品系。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，该育种方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤a）中选取的待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源均为四倍体普通栽培种，并且具有有性繁殖的能力。

3.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤c）中筛选小孢子发育时期处于单核中晚期的花蕾的方法为：将花蕾中的花药挑取2~3枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检观察小孢子发育时期，筛选出单核中晚期对应的花蕾。

4.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤c）中花蕾预处理的方法为：将花蕾洗净后放入40g/L的甘露醇溶液中，室温下预处理3d，然后将花蕾取出放在强度为400mT的均匀磁场中处理30min。

5.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤c）中花蕾表面消毒的方式为：先将花蕾放入75%乙醇中浸泡60s，用灭菌水冲洗2~3次，再将花蕾放入0.1%氯化汞溶液中浸泡15min，边浸泡边轻轻震荡，再用用灭菌水冲洗冲洗5~6次。

6.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤d）中NaCl和Na₂CO₃混合溶液中，二者的质量比为9:5。

7.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤d）中合适的筛选压力水平浓度是指：待改良马铃薯品种和耐盐碱马铃薯资源愈伤分化率均在1.5%~2.0%时，其分化培养基分别添加的NaCl和Na₂CO₃混合溶液的浓度，并取两者的平均值。

8.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤d）和e）中分化培养的条件为：温度25~27℃，光照强度2000~2400Lux，每天光照13~15h。

9.根据权利要求1所述的一种马铃薯耐盐碱改良育种方法，其特征在于，所述步骤f）中壮苗生根培养基的成分为：以不含琼脂的1/2MS培养基为基础，再添加生根粉5号 0.1~0.2mg/L，微囊藻素16~24mg/L，活性炭0.1~0.3g/L，pH值为5.6~6.0；生根培养的条件为：温度23~28℃，光照强度2500~3000Lux，每天光照15~17h。