CN109256176A - 基于代谢产物测量的微生物生长过程评估模型 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于代谢产物测量的微生物生长过程评估模型，涉及生物技术领域，所要解决的是评估微生物迟缓期、指数生长期和稳定期、死亡期四个完整的生长阶段，实现直接由检测的代谢产物值反映微生物生长，并能进行定量预测。根据微生物代谢产物与种群数量的耦合关系，反演出微生物四个阶段的生长曲线，以物理参数经验值为建模工具的输入变量，建立并修正得出高精度的微生物完整生长过程评估模型。通过该模型可得到微生物性质随时间发展的预测值或预测特点，实现了评估微生物生长过程的量化。本发明优势在于算法简便有效、适用范围广，能够精确模拟出不同微生物完整的生长过程，对指导生产具有重要意义。

Description

基于代谢产物测量的微生物生长过程评估模型

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种基于代谢产物测量的建模方法，其适用于预测各类微生物四个阶段的生长过程。

背景技术

微生物生长曲线能够反映某一特定环境条件下表现出的群体生长规律，以此衡量不同生长状况的代谢情况、生长趋势等多种重要指标，这些规律对实际生产制造、科研探索具有重要的科学指导作用。例如在发酵工程领域中，依据微生物生长阶段中的对数期得到获取缩短菌种培育周期，依据稳定期可知收获的最佳时期等；在临床医学领域，依据生长特征可以快速诊断致病微生物。因此，得到模拟精准的微生物生长模型在人口数量预测、食品生产和安全、医疗诊断、微生物科学研究等领域中都具有重要意义。

在适宜的培养环境下微生物生长过程共分为四个阶段：迟滞期、指数生长期、稳定期和死亡期。这四个时期具有不同的数量特征，反映微生物在生长过程中的不同生存状态。而现有的模型都是根据前三个阶段来反映微生物数量与生长时间的关系，不能完整反映微生物生长的四个阶段。

代谢产物检测法是一种简单快速的测量方式，以此作为判断依据来检测微生物生长过程的方法已经成为高精度、快速、自动化的微生物生长检测手段，并被广泛应用于医疗中的临床检验，现有利用该方法对微生物生长的四个阶段进行定性分析的模型，但仍缺少一种能够直接定量描述微生物四个阶段生长过程曲线的模型。

因此，迫切需要一种新的模型，能直接由检测的代谢产物值反映微生物生长，并能通过这种模型对微生物生长的四个阶段进行定量预测。

发明内容

为了解决上述问题，针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于代谢产物检测的微生物生长过程模拟模型。该方法优势在于算法简单、适用范围广、预测结果准确。

本发明提供了一种基于代谢产物检测的微生物生长过程模拟模型，具体步骤如下：

(1)首先，利用微生物一阶生长动力学函数结合有机物、生长空间、PH值和温度等限制条件，得到限定条件下的生长模型

其中kC_MAX＝μ_MAX(C≤C_MAX)，C表示某一时间点t的微生物生长量。

但如果微生物并不是接种后马上生长而存在滞后时，该方程不适合描述整个生长曲线，因此在新环境下微生物生长模型可构建为其中U_(t-λ)满足当t≤λ时U_(t-λ)＝0，此时微生物不进行生长，且t＞λ时U_(t-λ)＝1，此时微生物生长遵循该式。

(2)虽然上述方程可以用来描述整个生长过程，但新环境下微生物生长存在适应期，它是一个不连续的模型，需要2个独立的方程。本发明利用一个平滑的过渡的单元函数f(t)，它决定了微生物生长曲线中迟滞期的长短，并且将微生物生长迟滞期至稳定期的过程表述为一个连续函数：

当t＜＜E时，f(t)＝0，当t＞＞E时，f(t)＝1，当t处于0到E之间并靠近E时，f(t)将逐步从0变成1。此时，微生物生长曲线变为：

求解上述方程得到其解

微生物的生长从一个初始浓度即最小值C₀逐步增大至一个最大生长量C_MAX，此时微生物生长曲线中的迟滞期、指数生长期、稳定期可表述为

其中y(t)₁为微生物t时刻的生长量，A_MAX为微生物生长中指数生长期生长速率最大值，E₁为微生物生长迟滞期，C_MAX和C₀分别为微生物生长过程中的最大生长量和初始生长量，D₁为修型参数。

(3)对于微生物生长的死亡期而言，死亡期微生物生长死亡率大于生长率，与指数生长期正相反，存活微生物数呈整体S型下降趋势，最后衰减至0。利用与迟滞期、指数生长期、稳定期前三时期相同的方式进行分析可得，微生物生长死亡期可表述为：

完整的微生物生长曲线可以表述为：

其中，μ_{max 1}，μ_{max 2}分别为指数生长期以及死亡期的最大生长速率，λ₁，λ₂-λ₁分别为迟滞期时间以及微生物生长稳定期结束进入死亡期时间；|C|＝C_MAX-C₀为微生物活体细胞增长数，D₁，D₂为修型参数。

(4)综上可得微生物生长过程代谢产物累积曲线：

其中B₀为微生物代谢产物的初始量。

微生物生长曲线曲线如图2(a)所示，代谢产物累积量曲线如图2(b)所示，其中①、②、③、④分别表示微生物生长迟滞期、指数生长期、稳定期、死亡期。

由于采用了上述建模方法，本发明的有益效果是：

考虑到微生物的生长是一个连续的过程，对比现有的仅对前三个生长过程进行描述的方法，本发明设计出能描述和预测微生物在限制条件下完整的四阶段生长过程模型。同时本发明还提供了一种基于代谢产物测量的生长过程累积法，为提高模型精度给出了明确的途径。综上，本发明提出的建模方法简便有效，具有可优化的特点，能够精确模拟出微生物完整的生长过程。

附图说明

图1为本发明的模型流程示意图。

图2为微生物生长曲线与微生物代谢产物累积量曲线。

图3为25℃下大肠杆菌代谢产物CO₂累积量、运用本发明的模型反演得到的大肠杆菌生长曲线。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

如图1，本发明的建模方法包括建立基于代谢产物测量的微生物四阶段生长模型的步骤、模型精度评估步骤以及对模型参数进行优化的步骤。

本发明的实施例中，采用大肠杆菌为例，图3为25℃下实时监测获得的大肠杆菌代谢产物CO₂信号及运用本发明的模型反演得到的大肠杆菌生长参量以及微生物生长曲线。首先将大肠杆菌接种至含有牛肉膏蛋白胨葡萄糖营养物质的5ml试管中，并25℃恒温摇床下振荡培养18小时。将振荡活化18小时的大肠杆菌培养液稀释至2.6×10⁵cfu/ml，取5ml的大肠杆菌溶液至45ml的培养瓶中，即培养中瓶中细菌的初始浓度为2.6×10⁴cfu/ml。最后将其放置在25℃恒温培养箱中培养并实时监测培养瓶内CO₂浓度。

根据CO₂的积累量与微生物生长速率的关系，利用MATLAB软件中的fminsearch函数，通过无约束非线性优化，反演出最接近实验数据数值的微生物生长曲线模型。根据文献资料，结合实际经验，将完整的微生物生长曲线模型

中的每个参数设定一个初始值。

设定2.6×10⁴cfu/ml大肠杆菌在25℃下生长曲线指数生长期μ_{max 1}以及死亡期μ_{max 2}的最大生长速率为0.9/h和0.4/h，初始培养瓶内二氧化碳量B₀为0.1％，修饰参数D₁和D₂分别为4和2，迟滞期λ₁为9h，微生物生长稳定期结束进入死亡期的时间λ₂-λ₁为15h。

更具体地说，fminsearch函数能够从一个初始值开始，找到一个标量函数的最小值。对于本发明来说，当设定参数模拟得到的生长曲线与实验数据的差值大于设定值时，自行对建模参数进行调整优化模型，直至与实际微生物生长测量线最为接近时停止计算。最终得到大肠杆菌在该条件下的生长曲线。其中指数生长期μ_{max 1}以及死亡期μ_{max 2}的最大生长速率为0.7476/h和0.4487/h，初始培养瓶内二氧化碳量B₀为0.0038％，修饰参数D₁和D₂分别为2.9683和1.8936，迟滞期λ₁为15.6131h，微生物生长稳定期结束进入死亡期的时间λ₂-λ₁为23.2395h。

运用SPSS软件分析，通过本发明模型得到的大肠杆菌生长曲线与实际生长数据的残差情况。结合实际数据与拟合结果分析可得，模型拟合相关系数为1，拟合优度好，模型回归程度强；残差平方和SSE为0.117，代表反应变量的变异中没有被回归模型所包含的变量解释的部分，残差大部分在±0.04之间，可以解释大部分的预测值，证明模型有效；均方根误差为0.013142，预测标准误差为13.06564，证明观测值与真实值的离散程度很低。

由实验数据可见，仿真结果与实验结果基本一致，本模型具有良好的应用性。

Claims (4)

1.一种基于代谢产物测量的微生物生长过程评估模型，其特征在于，包括建立基于代谢产物测量的微生物四阶段生长模型的步骤以及对模型拟合度评估步骤及参数优化步骤；

其中，建立基于代谢产物测量的微生物四阶段生长模型的步骤为根据微生物代谢产物与种群数量的耦合关系，反演出微生物完整的四个阶段的生长曲线，使用微生物代谢产物累积曲线指数生长期的最大生长速率、初始培养瓶代谢产物的浓度、进入迟滞期等物理参数经验值为建模工具的输入变量，建立并修正得出高精度的微生物的完成生长过程模型；

模型精度评估及优化步骤包括：连续、实施测量微生物生长过程中产生的代谢产物浓度信息，根据代谢产物的积累量与微生物生长速率的耦合关系，给每个物理参数设定一个初始值，当设定参数模拟得到的生长曲线与实验数据的差值大于拟合优度值时，对模型表达式中的物理参数进行调整优化。

2.根据权利要求1所述的一种基于代谢产物测量的微生物四阶段生长建模方法，其特征在于，建立微生物生长模型的步骤进一步包括：

步骤A1：根据理论，确定微生物代谢产物含量与种群数量耦合关系的式子，分析出微生物生长的特征量；

步骤A2：采取μ_max1，μ_max2(分别为指数生长期以及死亡期的最大生长速率)、λ₁，λ₂-λ₁(分别为迟滞期时间以及微生物生长稳定期结束进入死亡期时间)、|C|＝C_MAX-C₀(微生物活体细胞增长数)，B₀(微生物代谢产物的初始量)为模型中的特征变量，在原有函数的基础上对生长曲线模型进行二次建模。

步骤A3：经过反复的实验，提取微生物代谢产物浓度信息，对模型的物理参数进行修正，获得代谢产物对微生物生长量的影响规律，使所建立的理论模型与实际数据相吻合，进而提高微生物生长参数的反演精度。

3.根据权利要求1所述的一种基于代谢产物测量的微生物四阶段生长建模方法，其特征在于，能够直接定量描述微生物四个阶段生长过程曲线的模型。本模型利用一个平滑的过渡的单元函数f(t)，它决定了微生物生长曲线中迟滞期的长短，并且将微生物生长迟滞期至稳定期的过程表述为一个连续函数：

当t＜＜E时，f(t)＝0，当t＞＞E时，f(t)＝1，当t处于0到E之间并靠近E时，f(t)将逐步从0变成1。此时，微生物生长曲线变为

同理，微生物生长死亡期可表述为：

因此完整的微生物生长曲线可以表述为：

4.根据权利要求1所述的一种基于代谢产物测量的微生物四阶段生长建模方法，其特征在于，

模型精度评估步骤中，对微生物生长过程中产生的代谢产物浓度信息进行连续实施的测量，根据代谢产物的积累量与微生物生长速率的关系，利用fminsearch函数，给每个物理参数设定一个初始值，当设定参数模拟得到的生长曲线与实验数据的差值大于拟合优度值(即大于5％)时，启动模型参数优化步骤，直至与实际微生物生长测量线最为接近时停止计算。综上可得微生物生长过程代谢产物累积曲线：