CN109248159A - 每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法。本发明以生物可降解聚合物为微球的控释骨架，添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率，添加酸碱调节剂调控基于微球聚合物骨架降解的后段艾塞那肽释放速率，采用膜乳化沉降过程将所述生物可降解聚合物、制孔剂、酸碱调节剂和艾塞那肽成型为微球，使其接近零级释放，为生产每月一针粒径均一、包封率高、释放曲线良好的艾塞那肽微球提供了工艺支持。与现有技术相比，本发明成功的制备了每月一针高包封率、粒径均一、释放曲线良好的艾塞那肽缓释微球。

Description

每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法。

背景技术

医药产业经过长期的发展，生物大分子药物正以高速度发展并占据药物市场，近年来生物大分子药物的年均增长率可达12％～16％，销售额已达市场总额的一半。生物大分子药物也具有很大的局限性，口服不吸收导致无法口服给药、体内半衰期短而需频繁给药、用药周期普遍很长以及普通水针剂注射的给药方式给患者用药带来极大的痛苦和不便等。

聚合物微球是指用具备良好生物相容性、可体内降解的高分子聚合物将药物包裹起来形成微小球状实体，进入机体后高分子聚合物缓慢降解，球壳逐渐变薄、产生孔洞，从而缓慢释出内部包封的药物。通过筛选合适的高分子聚合物材料、调整微球粒径与载药量，能够获得适宜可控的药物释出速率，同时能够保护结构脆弱易变的大分子蛋白药物最大程度免受外界环境影响，最大限度发挥药效。由于其出色的缓释控释能力与对包封药物的强保护作用，聚合物微球是一种理想的大分子蛋白药物输送载体，一般经肌肉注射或皮下注射给药。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球由于具有较好的生物相容性和生物可降解性，是应用和研究最广泛的药物载体材料之一。

聚合物微球的释放机理可以分为三类，即表面降解机理、本体降解机理和扩散控释机理。(1)表面降解机理:药物均匀分布在降解聚合物中形成整块***，当降解速度高于扩散速度时，释放速度主要与降解速度有关。当水的渗透速度小于聚合物的降解速度，该聚合物的降解仅在表面进行，则药物释放速度受到微球表面积与体积比以及形状的影响。药物从微球表面释放，出现表面降解，随着微球表面积越来越小，药物释放速度越来越慢。(2)本体降解机理：当水的渗透速度大于聚合物的降解速度，微球表面和内部同时发生水解，最终出现骨架崩解的现象。如果该聚合物的降解方式为本体降解，则其降解速度与控释***的表面积与体积比无关，在降解的开始阶段，释放速度比较慢，随着聚合物的迅速溶解，释药速度大大加快。(3)扩散控制机理:假定降解速度远小于扩散速度时，药物释放主要以扩散方式进行，降解聚合物所形成的整体***可以用Higuchi方程表示释药速率。药物首先溶解成溶液后再从制剂中扩散出来进入体液，其释药受扩散速率的控制。

体外释放行为研究是为了能够更好地反映微球在体内的释药状况，有利于筛选出更理想的处方及工艺。聚合物的强疏水性、降解产物的酸性以及酸致自加速本体降解特征容易导致多肽药物和其它对酸敏感的药物的凝聚或失活，呈现“突释”或者“滞后”释放的现象，这对于药物的恒速释放是不利的。制备微球所用的主要基质材料PLGA分子量比较高，所形成的微球结构比较致密，药物的释放相对比较缓慢，主要是依赖于聚合物的降解，即本体降解。微球溶胀产生较多通道，释放介质通过通道进入微球内部，加快高分子骨架材料降解，在此阶段药物释放量较低。

发明内容

在上述背景下，本发明的目的在于提供一种每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法。本发明以生物可降解聚合物为微球的控释骨架，添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率，添加酸碱调节剂调控基于微球骨架降解的后段艾塞那肽释放速率，采用膜乳化沉降过程将所述生物可降解聚合物、制孔剂、酸碱调节剂和艾塞那肽成型为微球，可以很好的改善药物释放滞后的行为,使其接近零级释放，获得更为理想的释放曲线。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法，所述方法包括：

a)以生物可降解聚合物为微球的控释骨架；

b)添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率；

c)添加酸碱调节剂调控基于微球聚合物骨架降解的后段艾塞那肽释放速率；

d)采用膜乳化沉降过程将所述生物可降解聚合物、制孔剂、酸碱调节剂和艾塞那肽成型为微球。

优选的，基于扩散机制调控前段艾塞那肽释放速率的制孔剂选自药用小分子糖类辅料。

优选的，所述药用小分子糖类辅料选自海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖中的一种或几种的混合物。

更优选的，所述药用小分子糖类辅料为海藻糖。

更优选的，所述海藻糖占所述艾塞那肽控释微球的总重的质量比为0.01～3％。

优选的，基于微球聚合物骨架降解调控后段艾塞那肽释放速率的酸碱调节剂选自氢氧化锌、氢氧化镁中的一种或两种的混合物。

更优选的，所述酸碱调节剂为氢氧化镁。

更优选的，所述氢氧化镁占所述艾塞那肽控释微球的总重的质量比为0.5～11％。

优选的，所述艾塞那肽控释微球的平均粒径为40.102～55.465μm。

优选的，所述艾塞那肽控释微球的载药量为2wt％～8wt％。

优选的，所述膜乳化沉降包括如下步骤：

S1、多孔膜限定成型：将含有艾塞那肽、制孔剂和酸碱调节剂的生物可降解聚合物溶液转移至多孔膜内，通过氮气压力过膜形成胚胎微球；

S2、沉降柱导向进行微球固化：胚胎微球经沉降柱自然沉降到底部时收集微球，清洗，冻干即可。

优选的，所述多孔膜的材质为玻璃或者不锈钢。

优选的，所述多孔膜的孔径为5～40um。

优选的，所述沉降柱的高度为820～1600mm，直径为44～84mm，壁厚3～4mm。

优选的，所述沉降柱内装有预冷的聚乙烯醇溶液。

优选的，步骤S2中，底部收集的微球在虹吸作用下进入清洗罐进行清洗。

与现有技术相比，本发明采用膜乳化沉降过程将海藻糖、氢氧化镁包裹进艾塞那肽微球中,制备一个月的长效缓释微球,用扫描电镜进行微球表面形态的观察，采用高效液相色谱检测分析微球的包封率，采用微球残存法测定微球的体外释放；比较相同氢氧化镁含量下，不同海藻糖含量的艾塞那肽微球表面形态、包封率和释放曲线的差异,通过添加合适含量的海藻糖和氢氧化镁，成功的制备了高包封率、粒径均一、释放曲线良好的艾塞那肽缓释微球。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为艾塞那肽微球制备装置图；其中，1为微球制备装置，2为储液罐，3为多孔膜，4为沉降柱，5为微球收集罐，6为清洗罐，7为制冷机组，8为高压容器，9为震荡装置，10为总电源；

图2为不同海藻糖含量艾塞那肽微球表面的扫描电镜图；其中，图2-1氢氧化镁含量5％、海藻糖含量0％，图2-2氢氧化镁含量5％、海藻糖含量1％，图2-3氢氧化镁含量5％、海藻糖含量2％，图2-4氢氧化镁含量5％、海藻糖含量3％；

图3为不同海藻糖含量艾塞那肽微球的包封率图；其中，处方一氢氧化镁含量5％、海藻糖含量0％，处方二氢氧化镁含量5％、海藻糖含量1％，处方三氢氧化镁含量5％、海藻糖含量2％，处方四氢氧化镁含量5％、海藻糖含量3％；

图4为不同海藻糖、氢氧化镁含量艾塞那肽微球的累积释放曲线图；其中，处方一氢氧化镁和海藻糖含量均0％，处方二氢氧化镁含量5％、海藻糖含量0％，处方三氢氧化镁含量5％、海藻糖含量1％，处方四氢氧化镁含量5％、海藻糖含量2％，处方五氢氧化镁含量5％、海藻糖含量3％。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明的体系中，微球选用的基于扩散机制调控前段艾塞那肽释放速率的制孔剂材料：

本发明采用的制孔剂材料为海藻糖，海藻糖是一种自然界中广泛存在的非还原性双糖，无毒副作用，化学性质十分稳定，海藻糖易溶于水,在水中的溶解度随温度变化较为明显，溶解度在10℃时为55.3；50℃时为140.1；90℃时为602.9。艾塞那肽微球在释放前期，高分子材料尚未降解，微球主要依靠药物扩散进入释放介质释放，但是因为微球内部的疏水性性质，使得释放介质难以进入微球内部，故前期释放速度较慢；到释放后期，高分子材料发生降解，使得药物释放速度加快。本发明在本体降解的基础上添加海藻糖作为制孔剂，使得微球表面形成一些孔洞以及微球内部形成一些孔道，溶出介质通过这些孔洞和孔道很快浸入微球，药物即通过这些孔道迅速扩散。随着海藻糖不断的溶解，微球内部不断的形成孔道，调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率。通过调控海藻糖的含量调整扩散孔道的数量和分布。微球中药物的释放性能尤其是药物突释与微球的表面性能有关，微球的表面形貌是决定微球释放性能的重要因素，微球表面的微孔越多，孔径越大，体液向微球内的渗透与药物向微球外的扩散均较容易，能改善艾塞那肽微球释放的滞后期。

微球选用的基于微球聚合物骨架降解调控后段艾塞那肽释放速率的酸碱调节剂：

本发明采用的酸碱调节剂氢氧化镁调控基于微球骨架降解的艾塞那肽释放速率，由于溶出介质浸入微球，PLGA发生降解会产生乳酸和羟基乙酸，这些单体和低聚体一般带有羧酸基聚集在微球内部，降低了微球内部微环境的pH值。加入氢氧化镁，酸碱中和使pH值增加。PLGA降解产生的羧基发生解离产生羧酸根离子，使得降解产物的离子化程度增加，内部渗透压增大。在渗透压的作用下，水分子更容易浸入微球内部，促使聚合物降解加快且药物扩散加快。未加入氢氧化镁的处方在后期的释放过程中相对缓慢，加入碱性的氢氧化镁可以与PLGA降解产生的带羧酸基-COOH的物质反应，可以改变释放环境的pH值，从而增加释放后期PLGA的降解速率，促进微球释放。氢氧化镁的加入可以起到调节艾塞那肽微球体外释放的目的，适当的氢氧化镁的量促进后期释放，具有优化微球释放曲线的功能，提高微球的累计释放量。

微球选用的生物可降解聚合物材料：

本发明采用的聚合物材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)以其良好的生物相容性、低毒性和可降解性被广泛用于药物传递***。PLGA具有良好的生物可降解性，在体内可被降解为参与体内三羧酸循环的乳酸和羟基乙酸，最终生成水和二氧化碳而排出体外。PLGA在体内及其降解过程中不积累，无免疫原性，无致癌性可被机体吸收，对环境无污染。PLGA与人体组织细胞有良好的相容性，能减少炎症反应，促进细胞贴附生长。

微球成型的膜乳化沉降过程：

微球成型的膜乳化沉降过程是制备含有艾塞那肽、二甲基亚砜、海藻糖、二氯甲烷和氢氧化镁的聚合物溶液，将聚合物溶液转移至多孔膜内，通过氮气压力过膜形成胚胎微球，待胚胎微球自然沉降到微球收集罐底部时收集微球，清洗并分装冻干微球。这种工艺的优势之一是减少磁力搅拌等剪切力造成的蛋白多肽类药物流失、微球的碰撞粘连；另一方面，无搅拌一体化的设计理念应用在工业上使无菌等操作简单化，大批量生产的可实现化。

微球的体外释放方法：

微球的体外释放方法--微球残存法，精密称取10mg微球加入PBS(pH＝7.4)缓冲液中，置于100r/min、37℃恒温摇床，保证每天在同一时间，取出上清液后，补充相同量的新鲜的PBS缓冲液；样品分别于预定时间后停止振摇后，吸干上清液后将瓶中微球残留进行冻干；冻干后的微球进行高效液相色谱分析；根据标准曲线计算每个样品中的药物浓度，根据不同时间点绘制药物的累计释放曲线。

通过对未添加海藻糖艾塞那肽微球的体外释放曲线拟合，得出因为PLGA的疏水性使得释放介质很难进入微球内部，所以微球释放前期药物几乎没有释放。由于微球释放前期的释放机制以扩散机制占主导地位，药物不能通过扩散机制从微球内部释放出来。

添加海藻糖导致艾塞那肽微球表面的孔洞增多，如图2中的微球电镜图所示，高倍下观察微球表面光滑，随着海藻糖含量的增加，微球表面的孔洞明显增加和变大，原因是海藻糖在制备微球的过程中的溶出使微球表面形成很多小孔。在释放过程中溶出介质可以通过这些孔道很快浸入微球，这时药物能通过这些孔道迅速扩散出来。通过对微球溶胀行为的研究发现，添加海藻糖颗粒的微球的溶胀开始时间明显早于未添加海藻糖颗粒的微球。

本发明对艾塞那肽微球体外释放情况进行了考察，选用不同海藻糖和氢氧化镁含量的微球进行体外释放评估。在没有添加氢氧化镁和海藻糖的条件下，艾塞那肽微球释放缓慢。在没有添加海藻糖的情况下，加入碱性的氢氧化镁可以与PLGA降解产生的带羧酸基-COOH的物质反应，可以改变释放环境的pH值，从而增加释放后期PLGA的降解速率，促进艾塞那肽微球释放。在固定氢氧化镁含量基础上，添加不同含量的海藻糖，随着海藻糖含量越多，其在微球表面形成的孔洞越多，水分子渗透的越快，形成的孔洞会越大，随之药物扩散的速度也越快，因此随着海藻糖含量的增加，前期药物释放速度不断增加。从本发明我们得知，可以通过控制艾塞那肽微球中海藻糖和氢氧化镁的含量来调节药物的释放行为，添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率，添加酸碱调节剂调控基于微球聚合物骨架降解的后段艾塞那肽释放速率。

本发明中公开了微球的粒径分布,平均粒径40.102-55.465μm。

具体应用见以下实施例：

实施例1艾塞那肽微球的制备

如图1所示，使用微球制备装置1，首先打开总电源10，打开制冷机组7，将无菌的聚乙烯醇溶液加入沉降柱4中预冷。接着将含有艾塞那肽、二甲基亚砜、海藻糖、氢氧化镁和二氯甲烷的聚合物(PLGA)药液转移至储液罐2的多孔膜3内，开启震荡装置9，通过高压容器8提供氮气压力过膜形成胚胎微球，待胚胎微球自然沉降到微球收集罐5底部时，打开转移管阀门，在虹吸作用下微球进入清洗罐6，加入预冷至4℃的超纯水洗涤，清洗完毕后，分装后冻干，即得微球产品。

通过该简捷化微球制备装置，得到的微球使用激光粒度仪进行了粒径分布测定，测试结果显示成品微球的平均粒径40.102-55.465μm，表明制备得到的微球的粒径大小与粒径分布均一。

实施例2艾塞那肽微球的包封率考察

精密称取10mg的艾塞那肽微球置于离心管中，加入适量的DMSO，涡旋使微球溶解，经过离心取上清液100μl，注入高效液相色谱进行检测分析，记录样品的色谱主峰面积。

载药量＝(微球中蛋白的实际含量/微球的质量)*100％

包封率＝(微球实际载药量/微球理论载药量)*100％

由图3可知，添加海藻糖和氢氧化镁制备的艾塞那肽微球得到的包封率均在90％以上的。

实施例3艾塞那肽微球的释放动力学

采用微球残存法进行体外释放研究，每组处方精密称取10mg的艾塞那肽微球放入释放瓶中，加入1mlPBS(pH＝7.4)缓冲液，置于100r/min、37℃恒温摇床，保证每天在同一时间，取出上清液后，补充相同量的新鲜的PBS缓冲液，样品分别于第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、30天后停止振摇后，吸干上清液后将瓶中微球残留进行冻干。冻干后的微球加入DMSO，涡旋彻底溶解后，离心取上清液至液相瓶中进行高效液相色谱分析。根据标准曲线计算每个样品中的药物浓度，根据不同时间点绘制药物一个月的累计释放曲线。

色谱条件确定

色谱柱：Agilent TC-C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；

流动相：A相：含0.05％三氟乙酸的水溶液；B相：含0.05％三氟乙酸的乙腈溶液；B相含量随时间的变化比例，30％-55％(0-20min)，55％-30％(20-26min)；

流速：1.0ml·min^-1；检测波长：214nm；柱温：25度；进样量：100μl；

经计算得到了不同海藻糖和氢氧化镁含量的艾塞那肽微球累积释放率曲线，结果显示，海藻糖和氢氧化镁的添加促近了艾塞那肽微球释放，没有滞后和突释现象，四周内的累计释放达到100％。这说明，本发明在保证包封率和粒径均一的前提下，添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率，添加酸碱调节剂调控基于微球聚合物骨架降解的后段艾塞那肽释放速率，采用膜乳化沉降过程将所述生物可降解聚合物、制孔剂、酸碱调节剂和艾塞那肽成型为微球，能够使药物从微球中以均匀可控的速度释放出来，而且不引起滞后和突释现象，得到具备优良控释效果的微球，具体结果见图4。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种每月一针艾塞那肽控释微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

a)以生物可降解聚合物为微球的控释骨架；

b)添加制孔剂调控微球中基于扩散机制的前段艾塞那肽释放速率；

c)添加酸碱调节剂调控基于微球聚合物骨架降解的后段艾塞那肽释放速率；

d)采用膜乳化沉降过程将所述生物可降解聚合物、制孔剂、酸碱调节剂和艾塞那肽成型为微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，基于扩散机制调控前段艾塞那肽释放速率的制孔剂选自药用小分子糖类辅料。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述药用小分子糖类辅料选自海藻糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述药用小分子糖类辅料为海藻糖。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述海藻糖占所述艾塞那肽控释微球的总重的质量百分比为0.01～3％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，基于微球聚合物骨架降解调控后段艾塞那肽释放速率的酸碱调节剂选自氢氧化锌、氢氧化镁中的一种或两种的混合物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸碱调节剂为氢氧化镁。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氢氧化镁占所述艾塞那肽控释微球的总重的质量百分比为0.5～11％。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物可降解聚合物为聚乳酸-羟基乙酸共聚物。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述膜乳化沉降包括如下步骤：

S1、多孔膜限定成型：将含有艾塞那肽、制孔剂和酸碱调节剂的生物可降解聚合物溶液转移至多孔膜内，通过氮气压力过膜形成胚胎微球；

S2、沉降柱导向进行微球固化：胚胎微球经沉降柱自然沉降到底部时收集微球，清洗，冻干即可。