CN109234230A - 一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞领域，公开了一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，取皮肤组织预处理后，加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养60‑90min；取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。利用本发明所述原代分离方法分离培养的皮肤间充质干细胞细胞膜不会受到伤害，细胞培养稳定，且不会引入支原体污染，可分离出大量皮肤间充质干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。

Description

一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为胚胎干细胞，多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞如造血干细胞、神经干细胞等。目前，已有利用干细胞治疗心肌梗塞、红斑狼疮、类风湿性关节炎、神经损伤、肌肉萎缩等的实验报道。人体干细胞是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种超能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。在人体干细胞中，间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪脐带、皮肤和胎盘。而现有的间充质干细胞的研究主要侧重于从骨髓和脐带中获得，对于皮肤间充质干细胞的研究却很少。由于皮肤是人体中体积最大的组织器官，且取材方便，所以选择皮肤间充质干细胞作为细胞治疗的种子细胞具有广阔前景。

皮肤干细胞在维持皮肤与粘膜的正常组织结构和细胞内环境稳定中起重要作用。在遗传性皮肤病的基因治疗和受损伤皮肤和粘膜功能与结构的重建方面，皮肤干细胞有着极其重要的作用。皮肤干细胞由其自身特性，具有着广泛的应用前景，例如：组织工程皮肤构建、在创伤修复中的应用、在基因研究及遗传性疾病的治疗、细胞谱系的研究等等。

现有技术中皮肤间充质干细胞的分离方法是用含EDTA的胰蛋白酶来消化皮肤组织，经过滤后接种于特定培养基中。胰蛋白酶属于蛋白水解酶类，应用此方法分散组织、分离细胞会使细胞膜严重受损，在细胞培养时不稳定，甚至引入支原体污染。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效、经济、稳定、便捷的皮肤间充质干细胞的原代分离方法，以便分离出大量皮肤间充质干细胞，并能够后续稳定培养。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，包括如下步骤：

A、取皮肤组织预处理后加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养；

B、取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。

本发明所述分离方法首先对皮肤组织进行预处理。

其中，所述预处理为皮肤组织剪成3-5mm长方形，用氯化钠注射液清洗后置于75％乙醇中清洗，再用氯化钠注射液清洗后剪成细小组织块。

在一些实施方案中，针对新鲜采集的皮肤组织，还需要用含双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液4℃保存用于后续的预处理。其中双抗为青链霉素混合液。青霉素-链霉素溶液(100×)中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。在本发明所述生理盐水及葡萄糖溶液中双抗的浓度优选为1×，即青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。

本发明所述分离方法采用Dispase II分散酶对皮肤组织进行消化。Dispase II分散酶，即中性蛋白酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，该酶不会伤害细胞膜，且因为其来源于细菌，故不会引入支原体或任何动物病毒；温度、PH、血清成份等的差异对Dispase II分散酶的影响很小，该酶经稀释后活性大大降低，方便了后续的细胞培养。

其中，作为优选，步骤A所述Dispase II分散酶的浓度为0.5U/ml-2.5U/ml。在一些实施方案中，所述Dispase II分散酶的浓度为2U/ml。

作为优选，步骤A所述消化为37℃消化1h。

作为优选，步骤A所述清洗为氯化钠注射液清洗。

本发明所述分离方法分离细胞后过滤去除杂质。作为优选，步骤A所述过滤为100μm一次性细胞筛网过滤。

作为优选，步骤A所述离心为400g离心10min。

作为优选，步骤A所述培养为37℃、CO₂培养60-90min。

作为优选，步骤B所述未贴壁的细胞悬液的接种密度为5×10⁴/ml。

作为优选，步骤B所述包被培养板的纤黏连蛋白的浓度为10-50μg/ml。在一些实施方案中，包被培养板的纤黏连蛋白的浓度为20μg/ml。

作为优选，步骤B所述包被方法为37℃孵育30-60min。

作为优选，步骤B所述培养为37℃、5％CO₂浓度下培养。

作为优选，步骤B所述培养首次换液应间隔72h，之后每1-3天换一次液。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法。利用本发明所述原代分离方法分离培养的皮肤间充质干细胞细胞膜不会受到伤害，细胞培养稳定，且不会引入支原体污染。实验表明本发明所述原代分离方法分离培养的皮肤间充质干细胞可分离出大量皮肤间充质干细胞，且细胞活力好，能够后续稳定培养。

具体实施方式

本发明公开了一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中Dispase II分散酶购自Sigma公司；Lonza完全培养基购自瑞士龙沙公司；纤黏连蛋白购自Corning公司。

实施例1、皮肤间充质干细胞的原代分离

1.取20μg/ml纤黏连蛋白FN 2ml铺至10cm培养板中，37℃孵育30-60min，备用；

2.取皮肤组织约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，4℃保存，带回实验室24h内操作；

3.将皮肤组织剪成3～5mm长方形，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍；

4.将长方形剪成细小组织块，置于2U/ml的Dispase II分散酶37℃消化1h；

5.1h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍；

6.反复吹打组织块使其细胞分离，过100μm一次性细胞筛网去除杂质；

7.过滤后的细胞400g，10min离心；

8.得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬接种于10cm皿中，放入37℃二氧化碳培养箱培养60-90min以去除成纤维细胞；

9.取未贴壁的细胞悬液计数，以5×10⁴/ml的密度接种于已包被过FN的培养板中；

10.72h后首次换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。

实施例2、皮肤间充质干细胞的原代分离

1.取10μg/ml纤黏连蛋白FN 2ml铺至10cm培养板中，37℃孵育30-60min，备用；

2.取皮肤组织约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，4℃保存，带回实验室24h内操作；

3.将皮肤组织剪成3～5mm长方形，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍；

4.将长方形剪成细小组织块，置于0.5U/ml的Dispase II分散酶37℃消化1h；

5.1h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍；

6.反复吹打组织块使其细胞分离，过100μm一次性细胞筛网去除杂质；

7.过滤后的细胞400g，10min离心；

8.得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬接种于10cm皿中，放入37℃二氧化碳培养箱培养60-90min以去除成纤维细胞；

9.取未贴壁的细胞悬液计数，以5×10⁴/ml的密度接种于已包被过FN的培养板中；

10.72h后首次换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。

实施例3、皮肤间充质干细胞的原代分离

1.取50μg/ml纤黏连蛋白FN 2ml铺至10cm培养板中，37℃孵育30-60min，备用；

2.取皮肤组织约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，4℃保存，带回实验室24h内操作；

3.将皮肤组织剪成3～5mm长方形，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍；

4.将长方形剪成细小组织块，置于2.5U/ml的Dispase II分散酶37℃消化1h；

5.1h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍；

6.反复吹打组织块使其细胞分离，过100μm一次性细胞筛网去除杂质；

7.过滤后的细胞400g，10min离心；

8.得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬接种于10cm皿中，放入37℃二氧化碳培养箱培养60-90min以去除成纤维细胞；

9.取未贴壁的细胞悬液计数，以5×10⁴/ml的密度接种于已包被过FN的培养板中；

10.72h后首次换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。对比例1、皮肤间充质干细胞的原代分离

1.取皮肤组织约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，4℃保存，带回实验室24h内操作；

2.将皮肤组织剪成3～5mm长方形，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍；

3.将长方形剪成细小组织块，置于0.1％胰蛋白酶37℃消化1h；

4.1h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍；

5.反复吹打组织块使其细胞分离，过100μm一次性细胞筛网去除杂质；

6.过滤后的细胞400g，10min离心；

7.得到细胞沉淀用Lonza完全培养基以5×10⁴/ml的密度接种于10cm皿中，放入37℃二氧化碳培养箱培养；

8.72h后首次换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。对比例2、皮肤间充质干细胞的原代分离

1.取皮肤组织约(30mm×5mm)，用含1×双抗的生理盐水反复冲洗数次，再用75％酒精冲洗一次，最后保存于含双抗的葡萄糖溶液中，4℃保存，带回实验室24h内操作；

2.将皮肤组织剪成3～5mm长方形，用氯化钠注射液清洗，其后置于75％乙醇中清洗，最后再用氯化钠注射液清洗一遍；

3.将长方形剪成细小组织块，置于0.1％胰蛋白酶37℃消化1h；

4.1h后取出组织块，用氯化钠注射液清洗一遍；

5.反复吹打组织块使其细胞分离，过100μm一次性细胞筛网去除杂质；

6.过滤后的细胞400g，10min离心；

7.得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬接种于10cm皿中，放入37℃二氧化碳培养箱培养60-90min以去除成纤维细胞；

8.取未贴壁的细胞悬液计数，以5×10⁴/ml的密度接种于10cm培养皿中；

9.72h后首次换液，之后每2天换液，直接细胞长至汇合度80％-90％传代。试验例、细胞增殖及细胞活率比较

比较分别采用实施例1-3和对比例1-2的方法培养7天后的细胞增殖及细胞活率，结果见表1。

表1培养7天后的细胞增殖及细胞活率

由上表可知，实施例1-3所述原代分离方法可得更多的细胞，并且该方法所得皮肤间充质干细胞拥有更高的细胞活力。而对比例1未经过细胞消化后差速贴壁60-90min，所得间充质干细胞数为零。表明细胞消化后差速贴壁60-90min是必要的，此步骤利用不同细胞特性不同(贴壁时间不同)为依据可以有效的去除其余杂细胞。而利用胰蛋白酶等其他酶类对细胞的损伤较大，使得细胞活率不佳，不能更好的增殖。

Claims (10)

1.一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、取皮肤组织预处理后加Dispase II分散酶消化，清洗后反复吹打组织块使其细胞分离，过滤后离心，得到细胞沉淀用Lonza完全培养基重悬后接种于培养皿中培养，进行差速贴壁；

B、取未贴壁的细胞悬液接种至纤黏连蛋白包被的培养板中培养，待细胞汇合达到80％～90％后进行传代。

2.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述预处理为皮肤组织运输时保存于4℃、含双抗的葡萄糖溶液中，皮肤组织剪成3-5mm长方形，用氯化钠注射液清洗后置于75％乙醇中清洗，再用氯化钠注射液清洗后剪成细小组织块。

3.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述DispaseII分散酶的浓度为0.5U/ml-2.5U/ml。

4.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述消化为37℃消化1h。

5.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述清洗为氯化钠注射液清洗。

6.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述过滤为100μm一次性细胞筛网过滤。

7.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述离心为400g离心10min。

8.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤A所述差速贴壁为37℃、5％CO₂培养60-90min。

9.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤B所述未贴壁的细胞悬液的接种密度为5×10⁴/ml。

10.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤B所述包被培养板的纤黏连蛋白的浓度为10-50μg/ml；所述包被方法为37℃孵育30-60min；所述培养为37℃、5％CO₂浓度下培养；所述培养首次换液应间隔72h，之后每1-3天换一次液。