CN109232813A - 一种hrp印迹水凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种HRP印迹水凝胶的制备方法，采用丙烯酰胺（AAm）为功能单体，甲叉双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂，过硫酸铵（APS）为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为引发剂，辣根过氧化物酶（HRP）为模板分子，按照一定配比原位聚合制成厚度为1mm的HRP印迹水凝胶，洗去模板分子，样品溶液直接滴加到凝胶表面，经吸附，洗去未键合分子，采用3,3',5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)‑H2O2体系显色，所产生的颜色可直接肉眼检测。本发明的制备方法简单，成本低，制备的HRP印迹水凝胶检测方便，可多次重复使用，可高选择性地识别血清样品中HRP，有效地去除基质干扰，具有很大的应用价值和市场前景。

Description

一种HRP印迹水凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于分析化学和蛋白质识别传感器技术领域,，具体涉及一种HRP印迹水凝胶的制备方法。
背景技术
分子印迹技术，是模拟自然界所存在的分子识别作用，制备包裹模板分子的聚合物网状结构的人工受体，它是涉及高分子化学、生物化学、材料化学、分析化学等学科的一种用于分离纯化的先进技术。所制备的聚合物称为分子印迹聚合物（molecular imprintedpolymer, MIP）。分子印迹聚合物是一种具有较强分子识别能力的新型高分子仿生材料。基于分子印迹聚合物具有与天然抗体相似的识别选择性和高分子材料的抗腐蚀性能的双重优点，因而正逐步应用于分析化学、生物工程、临床医学、环境监测、食品工业等众多领域，有希望在将来逐步替代不稳定的传统生物传感器。
分子印迹材料是一种空穴大小、形状，和功能基团与模板分子相匹配的聚合物，对模板分子具有特异性识别能力，可用于目标分子的分离、富集、定性和定量分析，它的先进之处就在于它的预定性、特异识别性、广泛实用性。蛋白质印迹材料具有对溶液pH和环境温度等耐受性强，成本低、稳定性高等优点，在样品的预处理、分离富集、生物传感器等方面取得了一定成绩，但与小分子相比，蛋白质印迹技术仍处于摸索阶段，尤其在模板分子的种类、水相体系中的制备、选择性等方面仍然面临许多困难与挑战。
基于“分子印迹聚合物（MIP）”取代生物分子作为人工抗体的仿生传感器，在21 世纪逐渐成为传感器领域的研究热点。分子印迹技术常用的分析方法通常包括：紫外可见光谱，电化学，表面等离子共振，色谱，荧光等。然而这些方法需要特殊的仪器设备或繁琐的操作步骤，因此需要建立更直接、高效、简单的检测方法以提高分子印迹技术的应用价值。
在众多分析方法中,由于可视化方法具有低成本、快速、简单、可裸眼检测等优点而被很多研究者广泛关注。但在分子印迹技术中研究报道不多，这可能是因为分析方法需要与印迹材料相一致，才得以实现信号转换，因此在印迹材料的设计上需要考虑印迹材料本身的颜色，以及不破坏印迹材料的显色方法，据此本发明设计一种HRP印迹比色水凝胶的制备方法，采用一步原位聚合法制备HRP印迹丙烯酰胺水凝胶，采用直接显色法检测目标物，可用于目标物的直接分析，该凝胶制备方法简单，成本低廉，可重复使用，其比色法，不需特殊设备，直接出分析结果，可用于目标物的便携式检测，实现定性和半定量分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种HRP印迹水凝胶的制备方法，用于目标蛋白的识别与检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种HRP印迹水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）A液制备：将丙烯酰胺（AAm）和甲叉双丙烯酰胺（MBAA）充分溶解于超纯水中，定容至50 mL，密封冷藏保存，制得A液。
（2）HRP印迹水凝胶溶液制备：将HRP 蛋白溶解于A液中并搅拌均匀，再依次添加超纯水、10wt%过硫酸铵（APS）和4 μL四甲基乙二胺（TEMED）混合均匀，得到HRP印迹水凝胶溶液。
（3）HRP印迹聚丙烯酰胺水凝胶的制备：将步骤（2）所得的HRP印迹水凝胶溶液置于制胶装置中，聚合成凝胶后取出，先用洗脱液少量多次的洗脱其模板HRP分子，再经水洗，制得HRP印迹水凝胶。
步骤（1）中丙烯酰胺的质量浓度为10～40%，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为15：（0.2～0.8）。
步骤（2）中HRP蛋白的用量为2.0～10 mg，A液的体积为：2.0～10 mL, 添加超纯水的体积为：4.0～8.0 mL，10wt%过硫酸铵的体积为：20～200 μL。
步骤（3）中所使用的制胶装置为bio-red小型灌胶装置，厚度为1mm, 凝胶聚合时间为10～60 min，所用的洗脱液为 10 wt% SDS、1mol/L NaCl、10 vol.% 乙酸、10wt%SDS与10 vol.%乙酸等体积比混合溶液中的一种。
一种上述方法制备的HRP印迹水凝胶在可视化检测HRP中的应用，比色法检测：将上述制得的HRP印迹水凝胶切割成胶条，固定于白色底板上，室温晾干，白色底板做好点样标记，含HRP系列浓度的样品溶液滴加到相应位置，静置，充分吸附，并用超纯水洗去未键合分子，室温晾干，滴加TMB-H2O2溶液，记录颜色变化。
其中白色底板的晾干程度为半干，刚刚无游离水为宜，样品溶液的体积为5～20 μL，静置吸附时间为10～60 min，HRP的浓度范围为：0～2.0 mg/mL；
TMB-H2O2溶液中TMB的浓度为20～80 mmol/L, TMB与H2O2的摩尔比为：5:（4～10），TMB-H2O2混合溶液需新鲜配制，滴加体积为5～20 μL，显色时间为1～10 min，显色时间过长，背景颜色加深，影响比色。
本发明采用丙烯酰胺（AAm）为功能单体，甲叉双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂，过硫酸铵（APS）为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)为引发剂，辣根过氧化物酶（HRP）为模板分子，按照一定配比原位聚合制成厚度为1mm的HRP印迹水凝胶，洗去模板分子，样品溶液直接滴加到凝胶表面，经吸附，洗去未键合分子，采用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)-H2O2体系显色，所产生的颜色可直接肉眼检测。
本发明的显著优点在于：
1）本发明所用的HRP印迹水凝胶采用一步原位聚合方法，制备简单，成本低廉，可重复使用，便于携带，可用于实时在线样品监测。
2）所制备的水凝胶理化性质稳定，具有很大的柔软性，不易破碎，便于保存，其透明性适合于肉眼监测颜色的变化。
3）所制备的HRP印迹水凝胶含有与HRP分子空间结构相匹配的印迹空穴，对HRP具有特异性识别能力。
4）由HRP印迹水凝胶切割的凝胶条可用于试制HRP快速检测试剂盒，其检测过程最快10 min内完成，对于基质复杂的血清样品，可以直接检测，不需要预处理过程。
附图说明
图1 HRP印迹水凝胶的制备过程及显色机制示意图；
图2 HRP印迹水凝胶条吸附不同浓度HRP标准溶液的比色图，HRP浓度从左到右依次为：0、0.001mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL；
图3 HRP非印迹水凝胶条吸附不同浓度HRP标准溶液的比色图，HRP浓度从左到右依次为：0、0.001mg/mL、0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL；
图4 HRP印迹水凝胶条吸附不同蛋白的比色图；
图5 HRP印迹水凝胶条吸附不同血清样品的比色图，从左到右依次为：纯水，0.1mg/mLHRP，血清，含0.1mg/mL HRP的血清溶液；
图6 HRP非印迹水凝胶条吸附不同血清样品的比色图，从左到右依次为：纯水，0.1mg/mL HRP，血清，含0.1mg/mL HRP的血清溶液。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，以下实例将对本发明做进一步说明，但并非用以限制本发明的范围。
实施例1
HRP印迹水凝胶对不同浓度HRP的识别效果：
（1）A液制备：将15 g AAm 和 0.4 g MBAA充分溶解于超纯水中，定容至50 mL，得到A液。
（2）HRP印迹水凝胶溶液制备：将5 mg HRP 蛋白溶解于5 mL A液中充分搅拌，再依次添加4.9 mL超纯水、100 μL 10 wt% APS和4 μL TEMED并混合均匀，得到HRP印迹水凝胶溶液。
（3）HRP印迹水凝胶的制备：将上述HRP印迹水凝胶溶液，灌入bio-rad灌胶装置中，聚合成凝胶后取出，先用洗脱液少量多次的洗脱其模板HRP分子，再经水洗，制得HRP印迹水凝胶(MIPs)，厚度为1mm。
（4）比色法检测：将上述制得的印迹水凝胶切割成宽带为1cm的胶条，固定于白色底板上，室温晾干，白色底板做好样点标记，分别将10μL HRP浓度为0、0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL的样品溶液滴加到相应位置，静置，充分吸附30min，并用超纯水洗去未键合分子，室温晾干。
（5）分别取新鲜配置的50 mmol/L的TMB溶液和80 mmol/L的H2O2溶液，二者于即将显色时等体积混合，每个吸附点添加10 μL 显色液，显色10 min，拍下显色效果图，见图2，可以看出随着HRP浓度的增加，所显颜色逐渐加深，由浅蓝到深蓝再逐渐变成黄色。
实施例2
非HRP印迹水凝胶对不同浓度HRP的识别效果：
将实施例1中步骤（2）不加5 mg HRP 蛋白，其余条件及步骤同实施例1制得HRP非印迹水凝胶(NIPs),，可得HRP非印迹水凝胶对不同浓度HRP的吸附效果图，如图3所示，可以看出随着HRP浓度的增加，所显示的颜色无明显变化，在高浓度0.5 mg/mL区域显示较浅的颜色，与实施例1中显示的颜色表现出显著差异，这表明该HRP非印迹水凝胶对HRP无特异性吸附。
实施例3
HRP印迹水凝胶对不同蛋白的识别能力：
（1）将实施例1中所制备的HRP印迹水凝胶切割成宽带为1cm的胶条，固定于白色底板上，室温晾干，白色底板做好样点标记，10 μL 0.05 mg/mL不同蛋白[HRP（辣根过氧化物酶）、Try（胰蛋白酶）、OVA（卵清白蛋白）、ConA（刀豆蛋白）、BSA（牛血清蛋白）、GOD（葡萄糖氧化酶）]的样品溶液分别滴加到相应位置，静置，充分吸附30 min，并用超纯水洗去未键合分子，室温晾干。
（2）分别取新鲜配置的50 mmol/L的TMB溶液和80 mmol/L的H2O2溶液等体积混合，二者于即将显色时混合，每个吸附点添加10 μL 显色液，显色10 min，拍下显色效果图，见图4，如图4所示，肉眼明显观察到HRP点样点显示明显的蓝色，与其余蛋白点样点所显示的微弱颜色具有显著差异，表明该制备的HRP印迹水凝胶对这几种蛋白具有良好的选择性。
实施例4
HRP印迹水凝胶在血清样品中的应用：
（1）FBS用纯水稀释20倍，冰箱保存备用（以下实验所用FBS均为稀释20倍的FBS溶液）。
（2）将实施例1中所制备的印迹水凝胶切割成宽带为1cm的胶条，固定于白色底板上，室温晾干，白色底板做好样点标记，将10 μL不同溶液（纯水、0.1mg/mL HRP、血清、含0.1mg/mL HRP的血清溶液）分别滴加到相应位置，静置，充分吸附30 min，并用超纯水洗去未键合分子，室温晾干。
（3）按照实施例1中步骤（5）进行显色反应，拍下显色效果图，见图5，如图5所示，纯水与血清样品均无颜色变化，背景颜色透明，说明血清样品中未检出HRP蛋白，当血清溶液中添加0.1mg/mL HRP时，可以看到颜色加深，说明血清溶液不干扰HRP的识别，进一步证明所制备的HRP印迹水凝胶对目标HRP蛋白具有明显的吸附效果，表现出较强的特异性识别能力。
实施例5
HRP非印迹水凝胶在血清样品中的应用：
将实施例4中HRP印迹水凝胶更换为HRP非印迹水凝胶，其余条件及步骤同实施例4，拍下显色效果图，见图6，如图6所示，这4个样品点均无颜色变化，说明HRP非印迹水凝胶对HRP无特异性吸附能力，这是由于HRP非印迹水凝胶没有与HRP空间和识别位点相匹配的印迹空穴。
实施例6
将实施例1中所制备的HRP印迹水凝胶，吸附0.05mg/mL的HRP蛋白溶液，按实施例1步骤进行显色反应，记录颜色变化，经10%乙酸洗脱，后重复吸附0.05 mg/mL的HRP蛋白溶液，再次进行显色反应，拍照记录颜色变化，反复使用5次，其显示的颜色无明显差异，证明该HRP印迹水凝胶具有良好的重复使用性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种HRP印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）A液制备：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺充分溶解于超纯水中，密封冷藏保存，制得A液；
（2）HRP印迹水凝胶溶液制备：将模板HRP 蛋白溶解于A液中并搅拌均匀，再依次添加超纯水、10w%过硫酸铵,和四甲基乙二胺混合均匀，得到HRP印迹水凝胶溶液；
（3）HRP印迹聚丙烯酰胺水凝胶的制备：将步骤（2）所得的HRP印迹水凝胶溶液聚合成凝胶后，先用洗脱液洗脱其模板HRP蛋白分子，再经水洗，制得HRP印迹水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种HRP印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（1）所得的A液中丙烯酰胺的质量浓度为10～40%，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的质量比为15：（0.2～0.8）。
3.根据权利要求1所述的一种HRP印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（2）中HRP蛋白的用量为2.0～10 mg，A液的体积为：2.0～10 mL，添加超纯水的体积为：4.0～8.0 mL,10w%过硫酸铵的体积为：20～200 μL，四甲基乙二胺的体积为4μL。
4.根据权利要求1所述的一种HRP印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）中凝胶聚合时间为10～60 min。
5.根据权利要求1所述的一种HRP印迹水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤（3）所用的洗脱液为 10 wt% SDS、1mol/L NaCl、10 vol.% 乙酸、10 wt%SDS与10 vol.%乙酸等体积比混合液中的一种。
6.一种由权利要求1-5任意一项所述方法制备的HRP印迹水凝胶。
7.一种如权利要求6所述的HRP印迹水凝胶在可视化检测HRP中的应用，其特征在于：将制得的HRP印迹水凝胶切割成胶条，固定于白色底板上，室温晾干，含HRP样品溶液滴加到胶条上，静置，充分吸附，并用超纯水洗去未键合分子，室温晾干，滴加TMB-H2O2溶液，观察颜色变化。
8.根据权利要求7所述的HRP印迹水凝胶在可视化检测HRP中的应用，其特征在于：样品溶液的体积为5～20 μL，静置吸附时间为10～60 min。
9.根据权利要求7所述的HRP印迹水凝胶在可视化检测HRP中的应用，其特征在于：所述TMB-H2O2溶液中TMB的浓度为20～80 mmol/L，TMB与H2O2的摩尔比为：5:（4～10），TMB-H2O2混合溶液需新鲜配制，滴加体积为5～20 μL，显色时间为1～10 min。
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