CN109223827A

CN109223827A - 水溶性的富勒烯结构在制备治疗肺纤维化的药物中的应用

Info

Publication number: CN109223827A
Application number: CN201710560447.8A
Authority: CN
Inventors: 王春儒; 周悦; 甄明明; ***
Original assignee: Beijing Funakang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Funakang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2019-01-18

Abstract

本发明公开了水溶性的富勒烯结构在制备治疗肺纤维化的药物中的应用，该水溶性的富勒烯结构包括水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者中的可药用的盐。本发明中水溶性的富勒烯结构能治疗肺纤维化，包括治疗肺的充血、水肿或增生肥大，治疗肺部胶原纤维增生、堆积的情况。并且该有效成分可通过生物体代谢排出体外，无毒副作用，具有良好的生物相容性。

Description

水溶性的富勒烯结构在制备治疗肺纤维化的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种水溶性的富勒烯结构在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。

背景技术

肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病的终末期改变，也就是正常的肺泡组织被化学性或物理性损坏后，纤维母细胞分泌胶原蛋白进行肺间质组织修补导致的结构异常(疤痕形成)。目前对其病因和发病机制尚未阐明，临床上肺纤维化的主要致病因素有：吸入无机或有机粉尘、放射型损伤、家族性肺纤维化等。目前认为肺纤维化初期为慢性炎症过程，如结节病、韦格纳氏肉芽肿病、感染、环境剂(石棉、二氧化硅、暴露于某些气体)、暴露于电离辐射(如治疗胸部肿瘤的辐射疗法)、慢性病状(狼疮)，以及某些药物治疗(胺碘酮、博莱霉素、平阳霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、卡氮介、丝列霉素、白消安、甲氨喋呤和呋喃妥因)均可引起肺纤维化。

临床上肺纤维化表现为进行性呼吸困难和肺功能异常，确诊后其5年病死率可达50％-70％。长期以来糖皮质激素作为特发性肺纤维化的首选治疗方法，尤其适用于急性期肺纤维化的治疗，但对慢性期肺纤维化的疗效较弱。此外，糖皮质激素抗炎作用维持时间短暂，远期疗效欠佳，临床上一直在寻找治疗特发性肺纤维化的新途径。因此寻找一种新颖且有效的治疗肺纤维化的药物迫在眉睫。

富勒烯是由不同数目碳原子组成的笼状碳原子簇，其是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。含量最多的富勒烯分子是C₆₀，然后是C₇₀、C₈₄，其次是含量相对较少的C₇₆、C₇₈、C₈₂等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，被称之为内嵌富勒烯，如Gd@C₈₂，表示Gd内嵌在C₈₂的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。本发明的另一目的在于提供一种治疗肺纤维化的药物组合物及方法。

为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗肺纤维化的方法，包括向患有肺纤维化的受试者施用有效量的至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐。

本发明还提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，包括至少一种选自下组的有效成分：水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯、以上三者的可药用盐，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；C₆₀，C₇₀，C₈₄等。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3，例如：Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和水溶性氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸残基是指水溶性氨基酸在修饰富勒烯和/或内嵌金属富勒烯时，失去氨基酸分子的一部分后剩余的不完整的氨基酸，即：氨基酸残基是氨基酸分子的一部分，其是不完整的氨基酸。缺少氨基酸分子中的任何一个部分都算是氨基酸残基，如：失去氨基酸中氨基上的氢、失去氨基酸中羧基上的氢或羟基等。可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。还可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、丝氨酸残基和赖氨酸残基中的至少一种

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和蛋白质中的至少一种；可选的，所述蛋白质为白蛋白或转铁蛋白。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括脂质体、聚合物胶束和细胞膜载体的至少一种；可选的，所述聚合物胶束为聚乙丙交酯聚乙二醇(PEG-PLGA)、聚赖氨酸或壳聚糖。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯的通式为C_2n(OH)_x(Amino Acid)_y，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；30≤n≤60，可选的n为30或35；0<x<50，可选的20<x<30，还可选的x＝24；0≤y<20；所述水溶性的内嵌金属富勒烯纳米颗粒的通式为M@C_2a(OH)_b(Amino Acid)_c，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35；0≤b<50；0<c<20。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的水合半径范围为1-1000nm，可选的为80-180nm。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：(1)表面修饰亲水基团的方法一般在碱的作用下通过固液或者液液反应实现，具体为将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再洗涤，然后透析，即可得到与原料相应的水溶性羟基衍生物。如果需要获得水溶性氨基化衍生物，将上述步骤中的氢氧化钠替换成氨水即可。(2)物理包覆的方法可以将富勒烯和内嵌金属富勒烯中的至少一种与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与原料相应的被包覆的水溶性富勒烯结构，如聚乙二醇包覆的富勒烯和/或聚乙二醇包覆的内嵌金属富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的内嵌金属富勒烯。(3)当水溶性的富勒烯结构中含氨基酸残基的个数不为0时，(a)使用水溶性氨基酸和NaOH/KOH配制水溶性氨基酸碱溶液(可选的，水溶性氨基酸和NaOH/KOH的摩尔比为1:1-10，还可选的为1:2或1:1-8；可选的，水溶性氨基酸碱溶液中NaOH/KOH的质量分数可为10～50％，还可选的为14％或10～30％)；(b)按照氨基酸与富勒烯本体/内嵌金属富勒烯本体摩尔比为1-1000:1，可选的为50-1000：1，100-1000:1，200-1000:1，将氨基酸碱溶液与富勒烯本体/内嵌金属富勒烯本体进行混合；(c)将上述混合物40-80℃反应(可选的，所述反应为搅拌反应1-7小时)，过滤除去未反应的少量固体粉末；(d)滤液透析除去小分子杂质，过滤后，得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的水溶性的富勒烯/内嵌金属富勒烯。可选的，透析所使用的透析袋的截留分子量Mw＝3500，透析后的过滤所使用的微孔滤膜的孔径200-220nm。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，水溶性改性的方法(1)中所述碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，称取50～200mg C₆₀固体或C₇₀固体或Gd@C₈₂固体，以及3～15ml 20～40％的双氧水，2～10ml5～60％的碱溶液，在50～100℃的条件下混合反应至固体全部溶解，然后用乙醇洗涤，透析，得到对应的羟基化衍生物，即水溶性富勒烯结构。在此描述中，表现的是各物质之间的比例关系，实际应用中并不受50～200mg、5～15ml和2～10ml具体反应规模的限制，可按照比例进行扩大。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述原料富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；C₆₀，C₇₀，C₈₄等。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述原料内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3；例如：Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。N代表氮元素，C代表碳元素，S代表硫元素，镧系金属元素包括La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述治疗肺纤维化包括以下的至少一种：1)使肺的脏器系数趋于正常；(2)治疗肺的充血、水肿、增生或肥大；3)使肺中的纤维状减少；4)治疗肺纤维化引起的乳酸脱氢酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛的上升；5)治疗肺部胶原纤维增生或堆积；6)抑制转化生长因子TGF-β的过量表达；7)降低羟脯氨酸含量。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述肺纤维化可由常见慢性炎症、感染、环境剂、辐射、慢性病状、药物、化学毒物等诱导产生；其中：所述慢性炎症包括但不限于目前临床上的结节病、韦格纳氏肉芽肿病等；所述环境剂包括但不限于石棉、二氧化硅、暴露于某些气体等；所述辐射包括但不限于X射线、γ射线等；慢性病状包括但不限于狼疮、咽炎、支气管炎等；所述药物包括但不限于胺碘酮、博莱霉素、平阳霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、卡氮介、丝列霉素、白消安、甲氨喋呤和呋喃妥因等；所述化学毒物包括但不限于四氯化碳、酒精等。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物的方法可采用本领域普通技术人员公知的方法来制备，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、***胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(water syrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-50mg/mL，可选的为0.01-10mg/mL，0.01-20mg/mL，0.01-30mg/mL，0.01-40mg/mL；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-50mg/g，可选的为0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猴子、猪、牛、羊、马等。

上述方法在另一种实施方式中，所述有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d，可选的为1-100mg/kg/d，1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d，施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式可以为雾化吸入、气管滴注、静脉注射、腹腔注射、口服和局部给药。

本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明所用的术语“有效成分”、“有效成分水溶性富勒烯结构”或“水溶性富勒烯结构”均指的是水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、水溶性的富勒烯和水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯和以上三者的可药用的盐中的至少一种。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“原料富勒烯”、不加任何修饰词的“富勒烯”均是指没有经过水溶性改性的富勒烯，即富勒烯本体。

本发明所用的术语“原料内嵌金属富勒烯”、不加任何修饰词的“内嵌金属富勒烯”均是指没有经过水溶性改性的内嵌金属富勒烯，即内嵌金属富勒烯本体。

本发明所用的术语“水溶性的富勒烯”是指富勒烯本体经过水溶性改性后获得的水溶性改性富勒烯。

本发明所用的术语“水溶性的内嵌金属富勒烯”是指内嵌金属富勒烯本体经过水溶性改性后获得的水溶性改性内嵌金属富勒烯。

为了方便计量，本发明中所有关于水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯的具体含量、浓度等定量的限定均是以其对应的富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体的具体含量、浓度等来衡量的，例如：有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d是指每1天每1kg的小鼠要施用的有效成分中对应的富勒烯本体碳笼的量为1mg-500mg。

本发明的有益效果为：

本发明中水溶性的富勒烯结构能治疗肺纤维化，包括治疗肺的充血、水肿或增生肥大，治疗肺部胶原纤维增生、堆积的情况。并且该有效成分可通过生物体代谢排出体外，无毒副作用，具有良好的生物相容性。

附图说明

图1为本发明实施例1中所得C₇₀-OH的热重分析及微商热重分析曲线。

图2为实施例3中GF-OH的粒径分布曲线。

图3为实施例3中C₇₀-OH的粒径分布曲线。

图4为实施例5中不同组别小鼠体重变化曲线。

图5为实施例5中不同组别小鼠肺的脏器系数。

图6为实施例5中不同组别小鼠肺的HE及VG染色切片。

图7为实施例5中不同组别小鼠肺部的羟脯氨酸含量。

图8为实施例5中不同组别小鼠肺部的转化生长因子(TGF-β)相对表达量。

图9为实施例5中不同组别小鼠肺部的TGF-β免疫印迹图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。Gd@C₈₂固体和C₇₀固体均购自厦门福纳新材料科技有限公司，纯度为99％。

实施例1、羟基修饰的金属富勒烯Gd@C₈₂和羟基修饰的空心富勒烯C₇₀的制备

(a)将7mL质量百分含量为30％的过氧化氢水溶液和3mL质量百分含量为40％的氢氧化钠溶液加入100mL圆底烧瓶，再加入200mg Gd@C₈₂或C₇₀，之后加入磁力搅拌子(型号：B200)并使用磁力搅拌器在温度70℃、转速1000r/min的条件下搅拌24h，使用滤膜孔径200nm的溶剂过滤器过滤得到棕黄色溶液。

(b)将(a)步骤得到的棕黄色溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇，在转速10000r/min的条件下离心4min后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。

(c)将(b)步骤得到的黄色澄清溶液装入截止分子量为3500的透析袋放入超纯水中透析，透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，透析袋内得到黄色溶液。

(d)将透析袋内的溶液装入50mL塑料离心管中，使用液氮冷冻后放入冷冻干燥机中在-50℃、真空度10Pa的条件下冷冻干燥48h，得到黄色固体羟基修饰的金属富勒烯Gd@C₈₂(以下简称GF-OH)或羟基修饰的空心富勒烯C₇₀(以下简称C₇₀-OH)并装入棕色样品瓶中备用。

实施例2、水溶性GF-OH和C₇₀-OH中各元素含量的测定

对上述实施例1制备得到的C₇₀-OH纳米颗粒进行元素分析(Flash EA1112)，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。在元素分析的结果中，所述C₇₀-OH中，C含量为37.85％，H含量为1.51％，N含量<0.3％。从热重分析(图1)可知，C₇₀-OH固体粉末中含3.7％的水，约为5个水分子，结合元素分析中H含量与C含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基。所以C₇₀-OH的平均结构式为C₇₀(OH)₂₄·5H₂O。

对上述实施例1制备得到的Gd@C₈₂对应的羟基化衍生物(以下简称Gd@C₈₂(OH)_n)进行元素分析，C含量为76.6％，H含量为0.89％，N含量小于0.6％。

实施例3、水溶性GF-OH及C₇₀-OH水合粒径的测定

取少量本发明实施例1制备的GF-OH及C₇₀-OH粉末分别溶于pH＝7.0的纯水配成100μM/L的稀溶液，由于分子间相互作用，GF-OH和C₇₀-OH在水中团聚成纳米颗粒，形成平均水合粒径在1～200nm的颗粒。

采用动态光散射(DLS，Zetasizer Nano ZSP)测定了在pH＝7.0的纯水中纳米颗粒的水合粒径，GF-OH的平均粒径为146.1nm，其粒径分布曲线参见图2；C₇₀-OH的平均粒径为135.9nm，其粒径分布曲线参见图3。

实施例4配制注射用溶液

取实施例1中的相应质量的GF-OH或C₇₀-OH固体溶解于相应体积的生理盐水中，室温超声5分钟，封装在玻璃瓶中，制成注射用溶液。

实施例5GF-OH及C₇₀-OH治疗博来霉素诱导的肺纤维化

1、动物模型：选用8周雄性C57BL/6小鼠，平均体重20g，随机分成6组，每组6只，6组分别为空白对照组(Control)、博来霉素(BLM)+生理盐水(Saline)组、BLM+GF-OH高剂量(H)组、BLM+GF-OH低剂量(L)组、BLM+C₇₀-OH(H)组、BLM+C₇₀-OH(L)组。

2、实验方法：

(1)建模：通过一次性气管滴注给药博来霉素(BLM)的方法建模。

除了空白对照组以外的其他5组小鼠按照3ml/kg的剂量施用10％水合氯醛进行麻醉后，固定于手术台上，剪开喉部皮肤，钝性分离，暴露气管后，用1ml注射器吸取博来霉素(PBS配制5mg/kg)溶液，最大注射体积不超过0.1ml，从气管快速注射，将小鼠垂直放置，旋转3周，使博来霉素均匀分布于肺部，缝合伤口，让小鼠自然清醒。

空白对照组以同样的方法注射同体积的PBS。

(2)给药：建模当天计为Day 0，从Day 3开始，每天按照实验分组对各组小鼠雾化给药15min吸入给予相应的药物，其中：

BLM+GF-OH高剂量组和BLM+C₇₀-OH高剂量组中雾化给药的相应药物分别是实施例4中配制的浓度为0.50mM的GF-OH和C₇₀-OH；BLM+GF-OH低剂量组和BLM+C₇₀-OH低剂量组中雾化给药的相应药物分别是实施例4中配制的浓度为0.25mM的GF-OH和C₇₀-OH。上述4个组开始给药后每天施用1次，每次施用150μL，施用至处死小鼠；

空白对照组(Control)、博来霉素(BLM)+生理盐水(Saline)组给予与上述4组施药体积相同的生理盐水。

(3)实验结果：

(i)每隔2d记录小鼠体重变化。

从各组小鼠的体重变化曲线(如图4)可以看出，BLM+Saline组及BLM+C₇₀-OH(L)组体重从建模之后下降很快，而其它组体重下降相对缓慢，且BLM+GF-OH(H)组的体重变化与对照组较为一致。

(ii)Day 21的时候，处死各组小鼠，取血清及肺组织。检测血清中乳酸脱氢酶与丙二醛的浓度；将肺组织称重并计算其脏器系数(脏器系数即实验动物某脏器的重量与其体重之比值)，检测肺组织中的乳酸脱氢酶与丙二醛的浓度，并将肺组织进行HE染色及VG染色。

脏器系数结果：图5给出了不同组别小鼠的肺的脏器系数，从图5中可以看出，BLM+Saline组的肺的脏器系数明显高于对照组。脏器系数增大，代表脏器发生了充血、水肿或增生肥大等病理生理的变化，说明化疗药物博来霉素可能引起了小鼠脏器的充血、水肿或增生肥大等，而各治疗组在一定程度上均降低了这些病变，相比于BLM+Saline组，各治疗组的脏器系数显著降低，其中BLM+GF-OH高剂量组优于BLM+C₇₀-OH高剂量组，BLM+GF-OH低剂量组优于BLM+C₇₀-OH低剂量组。

氧化水平结果：血清及肺组织中乳酸脱氢酶与丙二醛与肺纤维化相关的氧化应激密切相关，如下表所示，博来霉素引起的肺纤维化能造成血清及肺组织中乳酸脱氢酶活性及丙二醛含量的上升，说明小鼠体内脂质过氧化水平较高，而富勒烯，特别是金属富勒烯在很大程度上能减轻这种过氧化水平，这与金属富勒烯优异的自由基清除能力相关。

肺组织HE染色和VG染色结果：VG染色中，对照组正常的肺组织中肌肉呈现黄色，而伴随着胶原纤维增生的慢性炎症使VG染色呈现大面积红色。从图6的肺组织HE染色及VG染色切片看，两种富勒烯类的药物均表现出对肺纤维化的治疗效果，使HE染色中的纤维状减少，使VG染色中的红色减少。BLM+GF-OH高剂量组的HE染色及VG染色病理切片与对照组非常接近，其显著改善了肺部胶原纤维的堆积。

羟脯氨酸含量的结果：羟脯氨酸是肺组织中胶原堆积的指标，如图7所示，相比于Control组，BLM+Saline组的羟脯氨酸含量显著增加，说明BLM+Saline组中小鼠肺组织中的胶原堆积，小鼠肺组织出现了肺纤维化；而相比于BLM+Saline组，各治疗组小鼠中羟脯胺酸含量显著降低。

转化生长因子的结果：转化生长因子(TGF-β)是最重要的致纤维化因子，能诱导细胞外基质产生和成纤维细胞生成，过量表达时会导致胶原纤维沉积而产生瘢痕组织及纤维化。从图8显示的肺组织中TGF-βmRNA的相对表达看，GF-OH和C₇₀-OH的施用显著抑制了TGF-β在肺中的表达，这也与图9中其蛋白免疫印迹结果相吻合，即GF-OH和C₇₀-OH的施用显著抑制了TGF-β。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种水溶性的富勒烯、水溶性的内嵌金属富勒烯、所述水溶性的富勒烯和所述水溶性的内嵌金属富勒烯的组合物、以上三者的可药用的酯或以上三者的可药用的盐在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述水溶性的富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯；

所述水溶性的内嵌金属富勒烯选自下组的一种或多种：(1)碳笼外表面修饰有亲水基团的内嵌金属富勒烯；(2)碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的内嵌金属富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的内嵌金属富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系内嵌金属富勒烯。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，

所述富勒烯包括一种或多种通式为C_2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，可选的为C₆₀，C₇₀，C₈₄；

所述内嵌金属富勒烯包括M@C_2n、M₂@C_2n、MA@C_2n、M₃N@C_2n、M₂C₂@C_2n、M₂S@C_2n、M₂O@C_2n和M_xA_3-xN@C_2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自镧系金属元素、Sc和Y中的任意一种，30≤n≤60，0≤x≤3；可选的为Gd@C₈₂、Gd₃N@C₈₀。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和水溶性氨基酸残基中的一种或多种；可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，

所述水溶性的富勒烯的通式为C_2n(OH)_x(Amino Acid)_y，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；30≤n≤60，可选的n为30或35；0<x<50，可选的20<x<30，还可选的x＝24；0≤y<20；

所述水溶性的内嵌金属富勒烯的通式为M@C_2a(OH)_b(Amino Acid)_c，Amino Acid代表水溶性氨基酸残基；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35；0<b<50；0≤c<20。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水溶性的富勒烯是通过对原料富勒烯进行水溶性改性获得的；所述水溶性的内嵌金属富勒烯是通过对原料内嵌金属富勒烯进行水溶性改性获得的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：

(1)将原料富勒烯和原料内嵌金属富勒烯中的至少一种与双氧水和碱溶液混合并进行反应，再洗涤，然后透析，即可得到与原料相应的水溶性羟基衍生物；如果需要获得水溶性氨基化衍生物，将上述步骤中的氢氧化钠替换成氨水即可；

(2)物理包覆的方法可以将富勒烯和内嵌金属富勒烯中的至少一种与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与原料相应的被包覆的水溶性富勒烯结构；

(3)当水溶性的富勒烯结构中含氨基酸残基时，包括以下步骤：(a)使用水溶性氨基酸和NaOH和/或KOH配制水溶性氨基酸碱溶液(可选的，水溶性氨基酸和NaOH和/或KOH的摩尔比为1:1-10，还可选的为1:2或1:1-8；可选的，水溶性氨基酸碱溶液中NaOH/KOH的质量分数可为10～50％，还可选的为14％或10～30％)；(b)按照水溶性氨基酸与原料富勒烯和/或原料内嵌金属富勒烯摩尔比为1-1000:1，可选的为50-1000：1，100-1000:1，200-1000:1，将水溶性氨基酸碱溶液与原料富勒烯和/或原料内嵌金属富勒烯进行混合；(c)将上述混合物40-80℃反应(可选的，所述反应为搅拌反应1-7小时)，过滤除去未反应的少量固体粉末；(d)滤液透析除去小分子杂质，过滤后，得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的水溶性的富勒烯/内嵌金属富勒烯。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水溶性改性中羟基化的方法为称取50～200mg C₆₀固体或C₇₀固体或Gd@C₈₂固体，以及3～15ml 20～40％的双氧水，2～10ml 5～60％的碱溶液，在50～100℃的条件下混合反应至固体全部溶解。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗肺纤维化包括以下的至少一种：1)使肺的脏器系数趋于正常；(2)治疗肺的充血、水肿、增生或肥大；3)使肺中的纤维状减少；4)治疗肺纤维化引起的乳酸脱氢酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛的上升；5)治疗肺部胶原纤维增生或堆积；6)抑制转化生长因子TGF-β的过量表达；7)降低羟脯氨酸含量。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装粉针剂中的一种。