CN109207611B

CN109207611B - 一种与绵羊发情性状相关的snp分子标记及其检测试剂盒和应用

Info

Publication number: CN109207611B
Application number: CN201811354573.9A
Authority: CN
Inventors: 储明星; 刘秋月; 贺小云; 狄冉; 王翔宇; 胡文萍
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2018-11-14
Filing date: 2018-11-14
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2038-11-14
Also published as: CN109207611A

Abstract

本发明提供了一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用，属于绵羊SNP分子标记技术领域，所述SNP位点位于绵羊第10号染色体第52551820bp(NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)，所述SNP位点上存在G/A碱基突变，与绵羊季节性发情性状具有显著的相关性。通过对所述SNP位点进行分型即可确定待测绵羊发情性状。本发明提供的检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可将具有常年发情性状的AA纯合个体和GA杂合个体选留下来，从而提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

Description

一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用

技术领域

本发明属于绵羊SNP分子标记技术领域，尤其涉及一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用。

背景技术

单核苷酸多态性标记(SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、***和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种基因型检测方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子标记育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。

季节性繁殖是绵羊适应生存的重要进化结果，但在实际生产中却限制了生产效率。由于绵羊仅在秋季发情，限制了羊肉的四季均衡供给，这是全球范围内绵羊生产效率低下的主要限制因素之一。我国现有绵羊数量位居世界前列，但出栏率确低于世界平均水平，大力发展养羊业迫在眉睫。常年发情是某些舍饲绵羊品种特有的性状，通过目前的常规育种技术很难对这个性状进行遗传改良。因此，从遗传上研究绵羊常年发情的关键基因，利用现代生物技术改变绵羊发情的季节性，对提高绵羊的繁殖性能具有十分重要的意义，应用前景十分广阔。但目前还没有任何特异的DNA分子标记可以用于绵羊发情性状的筛选。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记及其检测试剂盒和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第10号染色体上第52551820bp位点(NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)所述位点上存在G/A碱基突变，与绵羊发情性状具有显著的相关性，当所述位点为A碱基时，绵羊具有常年发情性状；当所述位点为G碱基时，绵羊常年发情性状不明显。

本发明提供了利用Sequenom

SNP技术检测所述SNP位点的引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明提供了利用Sequenom

SNP技术检测所述SNP位点的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液和SAP酶，其特征在于，还包括所述的引物组。

优选的，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.45～0.55μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度为0.6～1.3μmol/L。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测与所述绵羊发情性状相关的SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；

3)用SAP酶对步骤2)中获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物；

4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。

优选的，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃2min；

变性95℃30s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

优选的，步骤3)中所述消化体系以2μL计包括：

SAPBuffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶 0.3μL；

去离子水 1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

优选的，步骤4)中所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃ 30s；

[94℃ 5s，(52℃ 5s，80℃ 5s)]；其中所述(52℃ 5s，80℃ 5s)进行5个循环，所述[94℃ 5s，(52℃ 5s，80℃ 5s)]进行40个循环；

72℃ 3min。

本发明还提供了所述的SNP位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述SNP位点为A碱基的绵羊进行后续育种。

本发明还提供了所述试剂盒在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，利用所述试剂盒筛选所述SNP位点为A碱基的绵羊进行后续育种。

本发明的有益效果：本发明提供的与绵羊发情性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第10号染色体上第52551820bp位点(NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)，所述位点上存在G/A碱基突变，与绵羊发情性状具有显著的相关性，当所述位点为A碱基时，绵羊具有常年发情的性状；当所述位点为G碱基时，绵羊常年发情性状不明显，表现为季节性发情。所述SNP位点的G/A碱基突变与绵羊发情性状紧密相关，通过对所述SNP位点进行分型即可确定待测绵羊发情性状。

本发明提供的利用Sequenom

SNP技术检测绵羊所述SNP位点基因型的方法，灵敏度，准确性更高，性价比更高，能同时对数百至数千份样本中数十到数百个SNP位点进行检测。

本发明中所述方法可对所述SNP位点实现自动化检测，在绵羊育种过程中，可以将具有常年发情性状的AA纯合个体和GA杂合个体选留下来，从而提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用Sequenom

SNP技术对FBXL3基因的三种基因型，即GG、GA或AA的检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种与绵羊发情性状相关的SNP分子标记，所述SNP位点位于绵羊第10号染色体上第52551820bp位点(NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)，所述位点上存在G/A碱基突变，与绵羊发情性状具有显著的相关性，当所述位点为A碱基时，绵羊具有常年发情性状；当所述位点为G碱基时，绵羊无常年发情性状。本发明中所述SNP位点位于FBXL3基因中，季节性发情绵羊中主要以野生型G为主。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测所述SNP位点的引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。具体如下：上游引物5’-ACGTTGGATGACTCCAAATCCTTGTCCTCG-3’；下游引物：5’-ACGTTGGATGTCAGCAGCTTGAGTGTATCG-3’；延伸引物：5’-GCTCGCTGAAGATAGATGACA-3’。

本发明所述的Sequenom

SNP技术结合多重PCR技术、MassARRAYiPLEX单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术对基因进行分型检测。利用此方法可对FBXL3基因的SNP位点实现自动化检测。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测所述SNP位点的试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液和SAP酶，还包括所述的引物组。本发明中，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度优选的独立为0.45～0.55μmol/L，更优选的独立为0.50μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度优选为0.6～1.3μmol/L。在本发明中，所述dNTPs的使用浓度优选为20～30μmol/L，更优选为25μmol/L；所述Taq DNA聚合酶的使用浓度优选为4～6U/μL，更优选为5U/μL；所述MgCl₂的使用浓度优选为20～30mmol/L，更优选为25mmol/L；所述PCR反应缓冲液优选为10×PCR反应缓冲液；所述SAP酶的酶活优选为1.7U/μL。本发明中所述试剂盒优选的还包括SAP Buffer。在本发明中，所述标准阳性模板DNA的基因型为AA，所述标准阳性模板DNA作为阳性对照，增加所述SNP位点检测的准确性。

本发明还提供了利用Sequenom

SNP技术检测与绵羊发情性状相关的所述SNP分子标记位点的方法，包括以下步骤：1)提取待测绵羊的基因组DNA；2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；3)用SAP酶对步骤2)中获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物；4)以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。

在本发明中，首先提取待测绵羊的基因组DNA。本发明对所述待测绵羊的种类没有特殊要求，任何种类的绵羊均可，在本发明实施例中采用的是藏系绵羊、蒙古系绵羊和欧洲绵羊；本发明对所述待测绵羊基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的动物细胞基因组提取方法即可，在本发明具体实施过程中，利用红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

本发明在获得所述待测绵羊基因组DNA后，以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物。本发明中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃ 2min；

变性95℃ 30s；

退火56℃ 30s；

延伸72℃ 60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

本发明在所述PCR扩增完成后，优选的将PCR扩增产物保存于4℃。本发明所述PCR扩增反应结束后，所述PCR扩增产物中含有目标SNPs位点所在的DNA片段。

本发明在获得所述PCR扩增产物后，用SAP酶对获得的PCR扩增产物进行消化获得消化后的产物。在本发明中所述消化体系以2μL计包括：

SAP Buffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶 0.3μL；

去离子水 1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

本发明中所述消化后的产物优选的保存于25℃。本发明中所述消化的作用为消化掉PCR扩增反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs。

本发明在获得所述消化产物后，以消化后的产物为模板，利用所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物。本发明中，所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃ 30s；

72℃ 3min。

本发明中，所述延伸体系中的iplex Buffer Plus、iplex Terminator、0.6～1.3μmol/Lprimer mix和iplex酶来源于

Gold Reagent Set试剂盒。本发明所述延伸反应过程中，对延伸体系中的待检SNP位点进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸引物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。本发明子在获得所述延伸产物后，优选的将所述延伸产物经过树脂纯化，本发明对所述树脂纯化的方法没有特殊限定，采用本领域常规的树脂纯化即可。

本发明在获得所述延伸产物后，利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP位点的基因型。本发明将所述延伸产物点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。本发明中，所述质谱点样有关的使用MassARRAY NanodispenserRS1000进行；所述质谱分析优选的使用MassARRAY Compact System进行；本发明在所述质谱分析后，优选的利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

本发明中所述Sequenom

SNP技术的基本原理为：首先使用上游引物和下游引物扩增目标SNPs所在DNA片段，在扩增产物中加入SAP酶消化掉反应体系中的引物序列和剩余的dNTPs，然后利用延伸引物对待检SNP位点同时进行单碱基延伸，位点特异性的延伸引物将在突变位点处延伸一个碱基并终止。延伸产物将根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物在经过树脂纯化后，将点样至靶片上，并使用质谱仪对不同延伸产物的分子量差异进行检测，通过数据分析，就可得到各突变位点的具体基因型。

本发明还提供了所述的SNP位点在绵羊辅助育种中的应用，在绵羊育种过程中，筛选所述SNP位点为A碱基的绵羊进行后续育种。在本发明中所述SNP位点的筛选优选的采用上述Sequenom

SNP技术；优选的筛选SNP位点为AA基因型和GA基因型的绵羊进行后续育种，更优选筛选SNP位点为AA基因型的绵羊进行后续育种。本发明所述应用可以将具有常年发情性状的基因型AA纯合个体和基因型GA杂合个体选留下来，从而提高绵羊的发情配种率，对绵羊大规模分子育种具有非常大的应用价值。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1

与绵羊季节性发情相关的SNP分子标记的鉴定

通过对10个绵羊品种99个绵羊个体进行全基因组重测序，包括藏系绵羊三个品种(山谷型藏羊、草原型藏羊、欧拉羊)、6个蒙古系绵羊(小尾寒羊、乌珠穆沁、滩羊、湖羊、策勒黑羊和巴音布鲁克)和1个欧洲绵羊(澳洲美利奴)，获得了迄今为止最大数量的绵羊基因组遗传多态位点，分析了这些绵羊群体的遗传多样性和群体遗传结构，筛选了与季节性发情相关基因。并通过Fst值计算获得了大量的有效SNP位点并筛选获得一些基因，其中包括与绵羊季节性发情相关的FBXL3基因的SNP位点。发现FBXL3基因位于第10号染色体52551820bp位点(NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月)的碱基存在G/A突变，与绵羊季节性发情具有显著的相关性。

利用Sequenom

SNP技术检测绵羊FBXL3基因的SNP位点并验证绵羊的发情性状

实验材料

表1大群验证所用绵羊品种

品种	只数	备注
			小尾寒羊	380	常年发情
杜泊	30	常年发情
			滩羊	80	季节性发情
苏尼特羊	100	季节性发情
			草原型藏羊	131	季节性发情
萨福克	39	季节性发情

2、试剂及仪器

试剂：Complete Genotyping ReagentKit for

Compact 384；

基因扩增：ABI

9700 384Dual；

质谱点样：MassARRAY NanodispenserRS1000；

质谱分析：MassARRAY Compact System；

所有试剂和仪器均购自北京君诺德生物技术有限公司(Beijing GenenodeBiotech Co.,Ltd)。

3、基因组DNA的提取

绵羊颈静脉采血1ml，用EDTA抗凝处理。首先红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解包细胞释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

4、Sequenom

SNP技术进行基因分型

针对绵羊第10号染色体上第52551820位点(Oar4.0,Chr10,SNP g.52551820G>A)设计引物组合。

PCR扩增引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5’-ACGTTGGATGACTCCAAATCCTTGTCCTCG-3’

下游引物R：5’-ACGTTGGATGTCAGCAGCTTGAGTGTATCG-3’

延伸引物序列及延伸产物如表1所示。

表2延伸引物序列及延伸产物

上述引物由君诺德公司合成。

检测流程如下：

1、提取待测绵羊的基因组DNA；

2、以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；

3、用SAP酶对PCR扩增产物进行消化；

4、以消化后的PCR扩增产物为模板，利用所述延伸引物S1进行延伸反应；

5、分析延伸产物，从而对绵羊FBXL3基因型进行判定。

其中，PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计为：20-50ng/μL基因组DNA 1μL，10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mmol/L MgCl₂0.4μL，25μmol/L dNTPs 0.1μL，PCR Primer mix 1μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，去离子水补齐至5μL；

PCR扩增反应的扩增程序为：95℃ 2min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 60s，45个循环；72℃ 5min。

对PCR扩增产物进行消化，主要是用SAP酶去除反应产物中的剩余引物和dNTP。使用的SAP酶消化体系以2μL计为：SAP Buffer 0.17μL，SAP Enzyme 0.3μL，去离子水补齐至2μL。

反应条件为：37℃ 40min，85℃ 15min，25℃保存。

延伸反应体系以2μL计为：iplex Buffer 0.2μL，Terminator mix 0.2μL，Extendprimermix 0.94μL，iplex Enzyme 0.041μL，去离子水补齐至2μL；

延伸反应条件为：94℃ 30s；[94℃ 5s，(52℃ 5s，80℃ 5s)5个内部循环]，40个外部循环；72℃ 3min。

将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。

经质谱分析得到PCR扩增产物大小为133bp，延伸产物的质谱检测结果如图1所示。

统计结果：

对绵羊第10号染色体上第52551820bp位点在待测绵羊中的基因型频率和等位基因频率分别进行了统计，并计算了这个位点在各群体中的多肽信息含量、杂合度和有效等位基因数，并用卡方检验检测该位点在各群体中的平衡状态，分析统计结果见表2。

表2待测绵羊第10号染色体上第52551820bp位点不同基因频率以及群体遗传学信息统计分析

注：P>0.05表示位点在该品种中处于哈代温伯格平衡状态；P<0.05表示位点在该品种中不处于哈代温伯格平衡状态。

表3第10号染色体上第52551820bp位点在不同发情性状绵羊群体间统计分析

上述分析可得出绵羊第10号染色体上第52551820bp位点在不同发情表型绵羊中频率分布差异显著(P<0.05)。在常年发情表型绵羊中以突变型A为主，而在季节性发情绵羊中以G为主。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种与绵羊发情性状相关的 SNP分子标记及其检测试剂盒和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg actccaaatc cttgtcctcg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg tcagcagctt gagtgtatcg 30

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcgctgaa gatagatgac a 21

Claims

1.检测与绵羊发情性状相关的SNP分子标记的引物组在绵羊发情性状方面辅助育种中的应用，其特征在于，在绵羊育种过程中，筛选所述SNP分子标记的位点为A碱基的绵羊进行后续育种；

所述SNP分子标记的位点位于绵羊第10号染色体上第52551820bp位点，NC_019467.2，基于绵羊基因组序列信息版本号Oar_v4.0，2015年12月，所述位点上存在G/A碱基突变，与绵羊发情性状具有显著的相关性，当所述位点为A碱基时，绵羊具有常年发情性状；当所述位点为G碱基时，绵羊无常年发情性状；

所述引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.检测与绵羊发情性状相关的SNP分子标记的试剂盒在绵羊发情性状方面辅助育种中的应用，其特征在于，在绵羊育种过程中，利用所述试剂盒筛选所述SNP分子标记的位点为A碱基的绵羊进行后续育种；

所述试剂盒，包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、MgCl₂、标准阳性模板DNA、PCR反应缓冲液、SAP酶和引物组；所述引物组，包括上游引物、下游引物和延伸引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述引物组中上游引物和下游引物的使用浓度独立为0.45～0.55μmol/L；所述引物组中的延伸引物的浓度为0.6～1.3μmol/L。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，利用Sequenom SNP技术检测所述与绵羊发情性状相关的SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

1)提取待测绵羊的基因组DNA；

2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物组中的上游引物和下游引物进行PCR扩增反应获得PCR扩增产物；

4)以消化后的产物为模板，利用权利要求2所述引物组中的延伸引物进行延伸反应获得延伸产物；

5)利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术分析延伸产物，确定所述SNP分子标记的位点的基因型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增反应使用的反应体系以5μL计包括：

所述PCR扩增反应的程序为：

预变性95℃2min；

变性95℃30s；

退火56℃30s；

延伸72℃60s；

所述变性、退火和延伸步骤进行45个循环后；72℃保持5min。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述消化的体系以2μL计包括：

SAPBuffer 0.17μL；

1.7U/μL SAP酶0.3μL；

去离子水1.53μL；

所述消化的程序为：37℃，40min；85℃，5min。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤4)中所述延伸反应的体系以2μL计包括：

所述延伸反应的程序为：

94℃30s；

[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]；

其中所述(52℃5s，80℃5s)进行5个循环，所述[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)]进行40个循环；

72℃3min。