CN109207405B - 一种耐镉乳酸菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐镉乳酸菌及其应用，涉及镉吸附技术领域，该耐镉乳酸菌的保藏编号为CGMCC NO.16301。该耐镉乳酸菌可以耐受最高1000mg/L的镉浓度，在pH为6的条件下，对50mg/L的镉溶液镉吸附率为30％以上，且对金黄色葡萄球菌有抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及镉吸附技术领域，具体而言，涉及一种耐镉乳酸菌及其应用。
背景技术
乳酸菌(lactobacillus)是一种在动物饲料中广泛使用的益生菌，具有促进动物生长、改善动物肠道健康的功能。近年研究表明乳酸菌具有吸附重金属的作用，在水体和土壤重金属污染治理中有所应用。镉是目前饲料卫生标准中限定的重金属之一。国内外的一些调查表明能量蛋白饲料如原料麦麸、菜籽粕等和矿物质原料石粉、磷酸氢钙等存在镉超过饲料卫生标准限量范围，给动物养殖业带来了饲料镉超标的风险，同时带来动物性食品镉超标的风险。镉对动物和人体具有严重的危害，被国际癌症研究所(IARC)列为I级致癌物。为防范和降低镉对动物和人的危害和风险，有必要寻找到降低饲料镉对动物的危害方法。目前采用的方法包括利用一些螯合剂如二巯基丁二酸与镉螯合后排镉；加大必需微量元素如铁等在饲料中的供给量，通过铁等与镉竞争金属硫蛋白，减少镉在动物体内的沉积；补充维生素如vC、 vE，降低镉对机体细胞的氧化损伤。上述方法或多或少存在一定的弊端，大剂量使用螯合剂对机体有副作用，补充微量元素和维生素对高剂量的镉有缓解作用，而饲料中的镉在一般情况下难以达到极高的中毒量，其经济性和适用性有待商榷。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐镉乳酸菌，该乳酸菌可以在高浓度的镉环境生存，并对镉具有较强的吸附效果，可用于去除基质例如饲料、土壤、培养基等中的镉元素。
本发明的另一目的在于提供上述耐镉乳酸菌的应用。
本发明的另一目的在于提供一种镉吸附剂。
本发明的另一目的在于提供镉的吸附方法。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种耐镉乳酸菌，其保藏编号为CGMCC NO.16301。
该菌株于2018年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为：约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)，保藏号为CGMCC NO.16301。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其16S rRNA基因的碱基序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其具有如下抑菌性质：具有抑制金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的特性，不具有抑制大肠杆菌和沙门氏菌的特性。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述耐镉乳酸菌的耐受胆盐浓度为0.5％。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述耐镉乳酸菌在pH 为6的条件下具有超过30％的镉吸附率。
本发明的发明人首次从鸡肠道内容物中分离了一种新的耐隔乳酸菌，其可以耐镉乳酸菌可以耐受最高1000mg/L的镉浓度，在pH 为6的条件下，对50mg/L的镉溶液镉吸附率为30％以上，且对金黄色葡萄球菌有抑制作用。该耐镉乳酸菌可用于去除基质中的镉金属元素，这种基质可以是土壤、饲料、培养基等需要去除镉的物质。
另一方面，本发明提供了上述耐镉乳酸菌在制备镉吸附剂中的应用。
另一方面，本发明提供了一种镉吸附剂，其包括上述的耐镉乳酸菌。
另一方面，本发明提供了一种镉的吸附方法，其包括：往需要去除镉的基质中加入上述的耐镉乳酸菌。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制所述基质的pH为 2.6-7。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，控制所述基质的pH为 5.8-6.2。
本发明的研究发现，在pH为2.6-7的条件下，上述耐镉乳酸菌具有较好的镉吸附率，例如在pH为6的条件下，其镉吸附率超过 30％，该效果出人意料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为乳酸菌革兰氏染色结果。
图2为耐受最大镉浓度的乳酸菌生长结果。
图3为乳酸菌：Cd1-1、Cd3-1、Cd5-2、Cd4-5、Cd8-2抑制金黄色葡萄球菌生长结果。
图4为乳酸菌：Cd1-1、Cd3-1、Cd5-2、Cd4-5、Cd8-2抑制空肠弯曲杆菌生长结果。
图5为根据Cd3-1的16S rRNA序列与其他同类菌株构建的进化树结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
耐镉乳酸菌的分离和鉴定
1样品来源于鸡肠道内容物。取肠道内容物0.1g，无菌PBS溶液逐级稀释至10-5，分别取10μL各级稀释液滴在含Cd 50mg/L的MRS 固体培养基上，37℃厌氧培养48h后，挑取单菌落，继续接种在含 Cd 100mg/L的MRS固体培养基上，继续培养48h后，挑取单菌落，重复接种在含Cd 100mg/L的MRS固体培养基上，培养48h后获得的单菌落为耐镉100mg/L的菌株。命名为Cd3-1。
2乳酸菌的鉴定
2.1革兰氏染色
挑一个乳酸菌单菌落于10μL无菌PBS溶液中混匀，涂布在无菌载玻片上，快速在火焰上固定，冷却后，按照革兰氏染色步骤操作，在倒置显微镜下用油镜观察，确定为革兰氏阳性菌(图1)。
2.2 16S rRNA生物学鉴定
上述1中所获得的菌株经MRS液体培养基37℃静止培养18h后，取1mL培养液，按照TaKaRa细菌DNA提取试剂盒(No：9763)的要求，提取菌株DNA。利用细菌16S rRNA基因通用引物(表1)PCR 扩增菌株16S rRNA基因。PCR扩增程序为：95℃:1min,95℃:30 s,52℃:30s,72℃:2min,35循环,16℃。取4μL PCR扩增产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，剩余PCR产物送生物技术公司测序，测序结果与NCBI数据库比对，确定乳酸菌种属。
表1 16S rRNA基因扩增引物
16S rRNA基因测序结果如下(SEQ ID NO.1)：
CATGCAAGTCGAGCGAGCTTGCCTAGATGATTTTAGTGCTTGCACTAAATGAAAC TAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGAC TGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGGATAACAACACTAGACGCATGTCTA GAGTTTGAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTT GGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGG CCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT TCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGG CTCGTAAAGCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGA CGGTAATTACTTAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGT CTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAATTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGA GTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGA AGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAA GCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGC TAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT CCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTGTTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGC ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACAC GTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCT AGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGAGAGTCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTC AGCCGTC。
根据16s rRNA基因序列构建的进化树见图5，根据图5结果，可以看出，Cd3-1是一种不同于现有的新的乳酸菌株。
2.3乳酸菌最大镉耐受量
上述1中乳酸菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，分别取10μL滴至含Cd 100mg/L、200mg/L、400mg/L、800 mg/L、1000mg/L的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养72h观察结果，确定乳酸菌耐受最大镉浓度，将最大耐镉浓度的乳酸菌株接种在无镉MRS固体培养基上，37℃厌氧培养48h。结果显示其可耐受最大镉浓度1000mg/L的生长(图2)。
2.4乳酸菌对溶液中镉离子的吸附性
上述1中乳酸菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基厌氧培养18h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min 转速，离心10分钟，去上清后加入0.5mL pH为6.0的50mg/L镉溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的镉含量。利用公式(1)计算乳酸菌镉吸附率。
吸附率(％)＝100％-(C1/C0)×100％ (1)
其中C0为初始镉液浓度，C1为最终上清液中镉液浓度。
结果显示，该乳酸菌对50mg/L镉溶液(pH6)镉吸附率大于30％。
2.5乳酸菌抑菌性质
上述1中乳酸菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，取1mL MRS培养液于无菌管中，将6mm的无菌滤纸片分别浸入MRS培养液中。调节金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、大肠杆菌、沙门氏菌吸光度为0.08-0.1(OD600)，分别取50μL金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌均匀涂满LB培养基，空肠弯曲菌均匀涂满MH血培养基，将滤纸片分别铺在细菌培养板上，金葡菌、大肠杆菌、沙门氏菌37℃培养24h，空肠弯曲菌42℃厌氧培养48h后观察结果，确定乳酸菌的抑菌性质。结果显示，该乳酸菌可抑制金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的生长(图3,图4)。
2.6乳酸菌耐受胆盐
上述1中乳酸菌按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基中培养18h，调吸光度为1(OD600)，逐级稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、 10-5，分别取10μL滴至含牛胆盐0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％的 MRS固体培养板上，以无胆盐MRS培养板为对照，37℃厌氧培养 48h观察结果，确定乳酸菌耐受胆盐浓度。
结果显示，该乳酸菌可耐受0.5％的胆盐。
综上，该乳酸菌最大耐受镉浓度为1000mg/L，对50mg/L镉溶液(pH6)镉吸附率大于30％，且耐受0.5％的胆盐，可抑制金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的生长。
Cd3-1菌株于2018年8月15保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类学命名为：约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)保藏号为CGMCC NO.16301。
实施例2
乳酸菌Cd3-1对溶液中镉离子的吸附
乳酸菌Cd3-1按1％的接种量接种至5mL的MRS液体培养基厌氧培养18h后，以10000r/min转速离心10分钟，去上清，超纯水清洗沉淀后，调吸光度为1(OD600)，取0.5mL溶液仍以10000r/min 转速，离心10分钟，去上清分别加入0.5mL pH为2.6、4.0、6.0和 7.0的50mg/L镉溶液悬浮沉淀，37℃，中速震荡2h后，10000r/min 转速，离心10分钟，取上清液，经适当倍数稀释后，用石墨炉法测定溶液中的镉含量。利用公式(1)计算乳酸菌镉吸附率。
吸附率(％)＝100％-(C1/C0)×100％
其中C0为初始镉液浓度，C1为最终上清液中镉液浓度。
结果(表2)显示，pH值对菌株吸附镉的影响较大。在pH值为 2.6、4.0时，乳酸菌株对50mg/L镉溶液镉的吸附率低于20％，随着pH值的升高，镉的吸附率上升，pH为6.0时镉吸附率最高，超过30％， pH为7.0时，镉吸附率接近30％。
表2 Cd 3-1对镉溶液的吸附率
| pH | 吸附率 |
| 2.6 | 17.6±2.1 |
| 4.0 | 18.5±0.2 |
| 6.0 | 31.1±1.6 |
| 7.0 | 28.9±0.3 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 一种耐镉乳酸菌及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1444
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgcaagtc gagcgagctt gcctagatga ttttagtgct tgcactaaat gaaactagat 60
acaagcgagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccaagag actgggataa 120
cacctggaaa cagatgctaa taccggataa caacactaga cgcatgtcta gagtttgaaa 180
gatggttctg ctatcactct tggatggacc tgcggtgcat tagctagttg gtaaggtaac 240
ggcttaccaa ggcaatgatg catagccgag ttgagagact gatcggccac attgggactg 300
agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tggacgaaag 360
tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttggta 420
gtgaagaaag atagaggtag taactggcct ttatttgacg gtaattactt agaaagtcac 480
ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggatttat 540
tgggcgtaaa gcgagtgcag gcggttcaat aagtctgatg tgaaagcctt cggctcaacc 600
ggagaattgc atcagaaact gttgaacttg agtgcagaag aggagagtgg aactccatgt 660
gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctctctggtc 720
tgcaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt 780
ccatgccgta aacgatgagt gctaagtgtt gggaggtttc cgcctctcag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960
ccaggtcttg acatccagtg caaacctaag agattaggtg ttcccttcgg ggacgctgag 1020
acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080
gagcgcaacc cttgtcatta gttgccatca ttaagttggg cactctaatg agactgccgg 1140
tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tgccccttat gacctgggct 1200
acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gaagcgaacc tgcgaaggca agcggatctc 1260
ttaaagccgt tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag ctggaatcgc 1320
tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380
gtcacaccat gagagtctgt aacacccaaa gccggtggga taacctttat aggagtcagc 1440
cgtc 1444
Claims (10)
1.一种耐镉乳酸菌，其为约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii），其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.16301。
2.根据权利要求1所述的耐镉乳酸菌，其特征在于，其16S rRNA基因的碱基序列如SEQID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的耐镉乳酸菌，其特征在于，其具有如下抑菌性质：具有抑制金黄色葡萄球菌和空肠弯曲菌的特性，不具有抑制大肠杆菌和沙门氏菌的特性。
4.根据权利要求1或2所述的耐镉乳酸菌，其特征在于，所述耐镉乳酸菌的耐受胆盐浓度为0.5%。
5.根据权利要求1或2所述的耐镉乳酸菌，其特征在于，所述耐镉乳酸菌在pH为6的条件下具有超过30%的镉吸附率。
6.权利要求1-5任一项所述的耐镉乳酸菌在制备镉吸附剂中的应用。
7.一种镉吸附剂，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的耐镉乳酸菌。
8.一种镉的吸附方法，其特征在于，其包括：往需要去除镉的基质中加入权利要求1-5任一项所述的耐镉乳酸菌。
9.根据权利要求8所述的镉的吸附方法，其特征在于，控制所述基质的pH为2.6-7。
10.根据权利要求9所述的镉的吸附方法，其特征在于，控制所述基质的pH为5.8-6.2。
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