CN109182498A - 一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用 - Google Patents

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汤冬娥
徐慧璇
徐勇
刘冬舟
陈文标
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Abstract

本发明提供了一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用。本发明首次以tRF/tiRNA为切入点，研究了自身免疫性疾病患者的tRF/tiRNA的表达情况，筛选出了合适的分子标记，可以作为自身免疫性疾病的诊断、预后的重要手段之一，以期能够更加方便、准确地对该疾病进行诊断，从而为将来疾病的治疗打下相关的基础。

Description

一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用。
背景技术
非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)广泛存在于细胞中，种类繁多，在机体中发挥着多种不同的功能。ncRNA具体包括有信使RNA(message RNA，mRNA)、核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)、转移RNA(transfer RNA，tRNA)，以及其它一些抑制基因表达的单链微RNA(microRNA，miRNA)、双链小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)、长链非编码RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)等。而随着高通量测序等技术的进一步发展，人们发现了一种新的ncRNA，即tRNA来源的小片段RNA(tRNA-derived fragment，tRF)。
tRF是指在特定的细胞或组织中或者在细胞受到胁迫等条件下，核酸酶在tRNA的环上剪切，产生的具有特定大小的小片段RNA。成熟的tRNA具有三叶草型的二级结构，可分为接收茎臂、D环、TψC环、反密码子环与可变环等。在剪切后产生的tRF中，来源于前体tRNA的3′前导序列被称为tRF-1；从成熟形式tRNA的5′端到D环附近的tRF为tRF-5；而成熟形式tRNA的TψC环附近到3′端的tRF为tRF-3，其长度为14-30个核苷酸(nucleotide，nt)。此外，在成熟形式tRNA的反密码子环剪切产生的tRF被称为tRNA半分子(tRNA halves)。tRNA半分子一般是在胁迫条件下产生，所以也称为tiRNA(tRNA-derived stressinducedfragment)，分为5′tiRNA和3′tiRNA两种，其长度为29-50nt。
尽管tRF和tiRNA的具体生物学功能尚未完全阐明，但越来越多的证据表明它们具有多种生物学功能，既可以在应激反应中作为信号分子，也可以作为基因表达的调节者。现已发现，tRF和tiRNA与人类多种疾病(例如：肿瘤、代谢性疾病、神经精神性疾病和传染病等)密切相关。tRF和tiRNA的组成和数量高度依赖于细胞类型和疾病状态。因此，基于tRF和tiRNA的非侵袭性生物标志物在疾病诊断的应用中将具有非常广阔的前景。而关于tRF和tiRNA与自身免疫性疾病的关系还未见诸报道。因此，有必要对其进行研究以拓展在自身免疫性疾病的诊断中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种分子标记，该分子标记为tRF或tiRNA片段，其核苷酸序列为SEQ ID No.1-3中的任一种。
一种自身免疫性疾病的诊断和/或预后的试剂盒，包括特异性识别分子标记的引物，分子标记为上述的至少一种。
优选的，自身免疫性疾病为***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎中的至少一种。
定量分子标记的表达量的试剂在制备自身免疫性疾病的诊断和/或预后的试剂盒中的应用，分子标记为上述的至少一种。
优选的，自身免疫性疾病为***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明首次以tRF/tiRNA为切入点，研究了自身免疫性疾病患者的tRF/tiRNA的表达情况，筛选出了合适的分子标记，可以作为自身免疫性疾病的诊断、预后的重要手段之一，以期能够更加方便、准确地对该疾病进行诊断，从而为将来疾病的治疗打下相关的基础。
附图说明
图1是本发明的差异表达tiRNA/tRF的散点图。
具体实施方式
以下将结合实验对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。
***性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性的***性自身免疫病。患者自身免疫***产生抗体攻击自身细胞和组织，导致炎症的发生和组织损害。SLE的发病机制尚不明确，目前认为其致病是多因素多层面的影响，包括免疫，遗传，环境，性激素等，诸多细胞因子参与其中。本发明将以***性红斑狼疮这一常见的、典型的自身免疫性疾病作为代表和实施例进行说明。
病例来自于在深圳市人民医院就诊的SLE患者，根据《2010年***性红斑狼疮诊断及治疗指南》，采用美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准，在该分类标准的11项中，符合4项或4项以上者，在除外感染。肿瘤和其他***病后，确诊的SLE患者，再计算SLEDAI评分(SLEDAI评分≥8为狼疮活动期，<8为疾病稳定期)，选取处于狼疮活动期的患者进入实验组。SLE组包括SLE患者20例，正常健康的对照组包括20例，两组实验对象性别年龄等基本条件相互匹配，采取随机对照设计。患者的入选标准为：签署知情同意书并且有完整的临床和其它各种资料；排除标准为未获得知情同意或临床和其它资料不完整。
1.序文库构建
用EDTA抗凝管收集SLE组的患者及对照组的正常人外周静脉血(空腹时)5ml，4小时内处理样品，根据Ficoll密度梯度离心法，使用淋巴细胞分离液将收集的静脉血分离出外周血单个核细胞(PBMC)。采用Trizol法提使用TrizolTM试剂提取PBMC的总RNA，采用RNA纯化试剂盒对总RNA进行过柱纯化，并进行相应的质量检测。
将产物进行去甲基化处理、去末端处理和去氨基酸处理，从而筛选出高质量的tRNA。
通过PCR技术，构建tRNA文库。
2.SLE组与对照组差异性表达tRNA的表达筛选
使用Assemnler-3.4.4.0、Alignment 2.0、coverage Analysis 3.0软件、基于fame 2算法的序列比对软件，以h38chrM(NC-012920)，参考基因组对数据进行组装和比对，允许10个碱基的错配。原始序列经过预过滤和比化筛除滤过率低于40％、mapping率低于80％、覆盖深度低于100X或覆盖度不均一的样本数据，最终筛选得到对照组和SLE组有效数据，寻找有意义的差异性表达tRNA。
3.tRNA降解片段tiRNA/tRF的数据分析
tRNA-change分析每个tRNA携带氨基酸与不携带氨基酸的比例，tRNA需携带氨基酸才能参与蛋白质翻译，tRNA氨基酸携带状态解析tRNA生理病理功能。统计密码子tRNA表达量，tRNA通过反密码子识别不同氨基酸，统计分析反密码子的量及携带不同氨基酸的能力，了解每个tRNA相应反密码子表达量，明确tRNA反密码子与RNA密码子相互作用关系，辨别反密码子基因突变对于蛋白合成影响。研究tRNA翻译效应预测与mRNA表达谱联合分析，tRNA介导mRNA与蛋白质之间信号传导，分析tRNA库与mRNA表达谱的吻合程度，统计吻合与非吻合点有助发现基因突变位点。统计tRNA降解片段tiRNA-5、tiRNA-3、tRF-3与tRF-5在实验组与对照组的表达量，分析降解片段在实验组与对照组的数量差异。
1.tRF/tiRNA表达量及差异性表达分析
图1是本发明的差异表达tiRNA/tRF的散点图。如图1所示，其中横坐标代表对照组的tiRNA/tRF的CPM平均值的对数值，纵坐标代表IgAN组的tiRNA/tRF的CPM平均值的对数值，两条虚线内部的点代表非差异性表达的tRNA(共184个)，上侧虚线的上方代表差异性表达上调的tRNA(共130个)，下侧虚线的下方代表差异性表达下调的tRNA(共225个)，Pearson相关系数＝0.721。从130个上调表达和225个下调表达的tRNA降解片段中综合筛选出差异性表达最显著的(tRF-Thr-AGT-003、tRF-Tyr-GTA-011、tiRNA-Val-TAC-004的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3)，其具体信息如下：
表1.相关tRF/tiRNA信息
其中，FC值(Fold Change)为表达差异倍数，p值为负二项分布检验的p值，s_CPM为SLE组tRF/tiRNA的CPM平均值的对数值，z_CPM为对照组tRF/tiRNA的CPM平均值的对数值，CPM为每百万读长(reads)中特定tRNA的读长数。
从上述结果可以看出，这三个tRF/tiRNA片段在SLE患者和正常对照组中表达的差异极为显著，通过对这三个tRF/tiRNA片段在外周血或其它一些样本中的表达情况进行检测，研究人员能够快速、简便地对自身免疫性疾病进行诊断，有可能为今后自身免疫性疾病的诊断、预后提供一种行之有效的快速诊断方法；同时，借此可以发现与自身免疫性疾病的发生发展相关的重要调控因子，为进一步揭示其生理学机制，探寻与这类疾病的治疗相关的全新靶点提供理论依据。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种分子标记及试剂盒和在自身免疫性疾病中的应用
<130> 9
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aatcccagcg gtgcctcca 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atccggctcg gaggacca 18
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggttccatag tgtagtggtt atcacgtctg cttt 34

Claims (5)

1.一种分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列为SEQ ID No.1-3中的任一种。
2.一种自身免疫性疾病的诊断和/或预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性识别分子标记的引物，所述分子标记为权利要求1中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述自身免疫性疾病为***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎中的至少一种。
4.定量分子标记的表达量的试剂在制备自身免疫性疾病的诊断和/或预后的试剂盒中的应用，其特征在于，所述分子标记为权利要求1中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎中的至少一种。
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CN103237901A (zh) * 2010-03-01 2013-08-07 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 用于治疗诊断的生物标志物
US20150176073A1 (en) * 2012-07-18 2015-06-25 Exosome Diagnostics, Inc. Use of microvesicles in diagnosis, prognosis, and treatment of medical diseases and conditions

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