CN109170235A - 益生菌微胶囊及其制备方法与应用 - Google Patents

益生菌微胶囊及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种益生菌微胶囊及其制备方法与应用。本发明针对反刍动物的微胶囊制备技术，采用具有良好生物相容性的天然控释材料和对pH值敏感的高分子材料，以及温和的工艺，对益生菌细胞进行微囊化制备。采用微晶纤维素空白丸芯造粒，作为微丸造粒的起膜芯粒，不仅有效解决制粒中真球度低、颗粒均匀度差的问题，而且兼具稀释－粘合－崩解三合剂的作用。采用双层包被技术可以分别耐受瘤胃微生物分解和真胃胃酸的侵蚀，从而使尽可能多的菌体到达肠道，是一种促进微生物在奶牛肠道有效定植的方法。本发明方法操作简单，通过流化床双层包被可以实现工业化的微胶囊制备，为工厂化生产包被益生菌细胞，建立一套行之有效的工艺参数。

Description

益生菌微胶囊及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及饲料添加剂领域，具体地说，涉及益生菌微胶囊及其制备方法与应用。
背景技术
饲料中使用抗生素已近60年，其效果显著、价格低廉而备受青睐，但同时也带来了隐患，如耐药性问题、畜产品中的残留与食品安全风险、造成动物免疫抑制与二重感染，抗生素的使用已经成为全球问题。欧盟自2006年就全面禁止在饲料中使用抗生素，饲料禁抗后，抗生素的主要替代品微生态制剂应用而生。众所周知，目前广泛使用的一类微生态活菌制剂主要是以乳酸菌、双歧杆菌、肠杆菌以及芽抱杆菌等多种益生菌进行研制，其主要作用是在数量或种类上补充肠道内减少或缺乏的正常微生物，恢复肠道内的微生态平衡，进而促进微生物在肠道中黏附、定植、繁殖以达到保健的目的。
这些外源微生物要在动物肠道定植，就必须耐受胃酸、胆盐、消化酶等的作用。对于反刍动物来说，还需要克服瘤胃微生物的分解作用。同时，作为一种微生态活菌制剂在常温贮存极易失去活性，降低产品的货架期。目前已有多种方法来提高微生物对不良环境的抵抗力，其中微胶囊包被技术使用颇为广泛，成为重点开发的高新技术之一。包被后获得高浓度、高活性的微囊化益生菌产品可以直达肠道定点释放，快速占位定植，有效发挥益生作用。
据已有报道，微胶囊包被多采用乳化法、挤压法、喷雾干燥法、发酵前包被等方法。CN1969889A公开了一种挤压法制备肠溶性多层包被益生菌微胶囊的方法，多数文献比较乳化法和挤压法的优缺点，认为挤压法在制备微胶囊时形成球形度比较困难，且不利于外层包被；一般来说采用挤压法制备微胶囊的粒径比较大(2-3mm)，过大的颗粒仅适合单胃动物，对于反刍动物要经过瓣胃的研磨，容易使微胶囊崩裂而失去包膜的保护作用。CN105105144A公开了一种采用乳化法制备微胶囊的方法，但是本身乳化法的包埋率较低，而且乳化过程中过高的剪切力也会对益生菌细胞产生伤害。CN103283975A公开了一种用喷雾干燥制备益生菌微胶囊的方法，此法对耐高温的微生物影响不大，但是对温度敏感的乳酸菌来说，喷雾干燥机的温度超过40℃以上，乳酸菌的活菌率就会下降，在实际操作中，温度每升高10℃，活菌率将下降一个数量级。CN103275966A公开了一种发酵前包被，通过包被后的再培养来控制菌体增殖和代谢的微胶囊化技术得到了很好的发展，但是制备成本高。
发明内容
本发明针对以上现有技术不足，提供一种益生菌微胶囊，特别是针对反刍动物的微胶囊及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：
A、益生菌菌泥混合液的制备：将益生菌进行活化、培养，得到益生菌发酵液，离心，弃上清，收集菌体，得到菌泥；向所述菌泥中加入适量脱脂奶粉保护液，得到菌泥混合液；
B、制粒：将微晶纤维素空白丸芯(MCC)和海藻酸钠作为起膜芯粒加入流化床中，使所述菌泥混合液按照一定流速注入所述流化床中，在一定条件下混合制粒；
C、一次包衣：将一次包衣液均匀喷涂到步骤B所得颗粒上，得到一次包衣颗粒；
D、二次包衣：将二次包衣液均匀喷涂到步骤C所得颗粒上，完成二次包衣，干燥后即得益生菌微胶囊成品。
其中，所述一次包衣液为1.5-2％的海藻酸钠水溶液，或者1.5-2％的海藻酸钠和壳聚糖水溶液(海藻酸钠与壳聚糖的质量比为2-4:1)。
所述二次包衣液为10-12％的丙烯酸树脂水溶液、1-5％的乙基纤维素溶液或氢化油脂(如C18H36O2)。
在制粒、一次包衣和二次包衣过程中，将混合物料温度控制在25-40℃。该温度是益生菌适宜繁殖的最佳温度，可有效避免高温对益生菌活菌率大幅度地破坏。
前述的方法，步骤A中所述菌泥与脱脂奶粉保护液的体积比为1:1-3。
优选地，所述脱脂奶粉保护液的浓度为10％-30％，优选20％。
前述的方法，步骤B中所述起膜芯粒与菌泥混合液的用量比为1g:1-2mL，优选1g:1mL。
优选地，所述起膜芯粒中微晶纤维素空白丸芯与海藻酸钠的重量比为11:1-5，优选11:1。
优选地，步骤B进行流化床制粒的条件如下：
注：热机目的为使物料温度达到30℃以上；风量和流速调节根据制粒情况而定，若热机时或制粒开始风量过大，容易将MCC吹高(高过喷头)，造成物料损伤增加以及制粒不均匀。若一开始菌泥混合液流速过大，加入过多，在小风量下无法及时将水分带走，使MCC粉末迅速结块，影响制粒。
优选地，包衣所用一次包衣液为1.5-2％的海藻酸钠水溶液，二次包衣液为10-12％的丙烯酸树脂水溶液。
优选地，步骤C进行流化床一次包衣的条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度
热机 20m<sup>3</sup>/h ---- ---- 至30℃ 70℃
0-10ml 20-30m<sup>3</sup>/h 6-8r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
10-20ml 30-38m<sup>3</sup>/h 8-12r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
20-32ml 38-45m<sup>3</sup>/h 12-18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
其中，所述颗粒与包衣液的用量比为1.5-2g:1mL，优选2g:1mL。
步骤D进行流化床二次包衣的条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度
0-5ml 55m<sup>3</sup>/h 15r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
5-16ml 55m<sup>3</sup>/h 16r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
干燥10min 50m<sup>3</sup>/h ---- ---- 31-40℃ 关闭温度
其中，所述一次包衣颗粒与包衣液的用量比为2-4g:1mL，优选4g:1mL。二次包衣结束后，关闭流化床，利用仪器的余温干燥10min。
本发明所述益生菌包括乳酸菌及其分属，如干酪乳杆菌、植物乳杆菌、粪链球菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸肠球菌、乳酸乳杆菌、乳酸片球菌、保加利亚乳杆菌等。
第二方面，本发明提供按照上述方法制备的益生菌微胶囊。
第三方面，本发明提供所述益生菌微胶囊的以下任一种应用：
1)在饲料制备中的应用；
2)在微生态制剂，特别是反刍动物微生态制剂制备中的应用；
3)恢复肠道内微生态平衡中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供了一种针对反刍动物的微胶囊制备技术，采用具有良好生物相容性的天然控释材料和对pH值敏感的高分子材料，以及温和的工艺，对益生菌细胞进行微囊化制备。
(二)本发明方法操作简单，通过流化床双层包被可以实现工业化的微胶囊制备，为工厂化生产包被益生菌细胞，建立一套行之有效的工艺参数。
(三)采用低温冷循环装置成功解决乳酸菌制粒过程中不耐热的难题；利用多孔的微晶纤维素晶体作为载体基质，可以提高制粒的稳定性，且具有较好的流动性、适度的吸水性、较高的机械强度和圆球度。
(四)针对反刍动物特有的生理结构，采用对pH值敏感的包材进行包被，包被后的微胶囊不仅可以避免瘤胃微生物的分解作用，而且可以防止真胃胃酸的破坏，促使微生物在奶牛肠道靶向释放，促进微生物定植于肠道。
(五)本发明以热敏性的乳酸菌为囊芯物，对流化床进行冷温处理，研发出一种温和工艺，不仅适用于乳酸菌，而且对其他耐高温益生菌的包被同样有效。采用微晶纤维素空白丸芯造粒，作为微丸造粒的起膜芯粒，不仅有效解决制粒中真球度(圆整度)低、颗粒均匀度差的问题，而且兼具稀释－粘合－崩解三合剂的作用。采用双层包被技术可以分别耐受瘤胃微生物分解和真胃胃酸的侵蚀，从而使尽可能多的菌体到达肠道，是一种促进微生物在奶牛肠道有效定植的方法。采用动物体内试验(体内试验是评估益生菌包被效果的金标准)，真实反应乳酸菌发挥益生作用经历的生理过程。
(六)采用本发明流化床包被技术制成的益生菌微胶囊粒径均匀、成囊性能良好、操作工艺简单、利于规模化生产，可广泛应用于食品、制药、化工及饲料制备领域。
(七)制粒过程中使用微晶纤维素作为起膜芯粒，目的是在乳酸菌包被时，可以在一个近似圆形的菌体外面，均匀地将包衣液喷涂上去。而常规方法大多借助于模具，使得菌泥被挤压成近似球形，但这种方法对菌体的剪切力较大，使活菌率及包埋率受到影响。本发明所采用的微晶纤维素空白丸芯，属于中空的纤维载体，呈球形，可省去挤压制作模型这一过程；在包被过程中，约80％乳酸菌菌体都被吸附到微晶纤维素空白丸芯中间，有效解决了制粒中真球度(圆整度)低、颗粒均匀度差的问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中制粒(A)、一次包衣(B)、二次包衣(C)及微胶囊成品(D)的实物图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的微晶纤维素空白丸芯颗粒的外径为850-1000μm，购自杭州高成生物营养技术有限公司。
实施例1植物乳杆菌(单菌)微胶囊的制备
1)菌种的活化与增殖：
将植物乳杆菌JCM-1149(来源于中国农业大学农学院微生物实验室保藏日系菌株)接种于MRS液体培养基中进行活化培养三代，采用管式离心机(10000r/min以上)离心10-15min，收集菌泥。
2)制备菌泥混合液：
取菌泥15ml加入20％脱脂奶粉水溶液45ml(菌泥:20％脱脂奶粉溶液＝1:3)，充分混匀，即得加入保护剂的菌泥混合液。
3)制粒：
以微晶纤维素空白丸芯和海藻酸钠充分混匀作为基质(60g微晶纤维素和5.4g海藻酸钠充分混匀)，加入菌泥混合液60ml(菌泥混合液:微晶纤维素≈1:1)，流化床制粒，条件如下：
注：热机目的为使物料温度达到30℃以上；每阶段随情况微调进风量和流速；进样量大时，可将流速降低。
4)包衣液的制备
一次包衣液的制备：配制含1.5％的海藻酸钠水溶液；
二次包衣液的制备：配制含12％的丙烯酸树脂水溶液。
5)流化床包衣
一次包衣：采用顶喷包衣，一次包衣液用量为颗粒：包衣液＝2:1；第一步制粒后得颗粒64g，所用包衣液32ml。包衣条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度
热机 20m<sup>3</sup>/h ---- ---- 至30℃ 70℃
0-10ml 20-30m<sup>3</sup>/h 6-8r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
10-20ml 30-38m<sup>3</sup>/h 8-12r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
20-32ml 38-45m<sup>3</sup>/h 12-18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
二次包衣：二次包衣液用量为一次包衣颗粒：二次包衣液＝4g:1mL。包衣条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度
0-5ml 55m<sup>3</sup>/h 15r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
5-16ml 55m<sup>3</sup>/h 16r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
干燥10min 50m<sup>3</sup>/h ---- ---- 31-40℃ 关闭温度
制粒、一次包衣、二次包衣及微胶囊成品的实物图见图1。
二次包衣结束后，关闭流化床，利用仪器的余温干燥10min。
包被前后活菌数比较及包埋率见表1。
表1
由表1可知，经本发明包被处理的植物乳杆菌在包被后活菌数仍可达109，且包埋率可达80％左右。
实施例2复合乳酸菌(复合菌)微胶囊的制备
1)菌种的活化与增殖：
将复合乳酸菌主要由乳杆菌、乳球菌和芽孢杆菌等组成(由中国农业大学农学院微生物实验室提供)，接种于MRS液体培养基中进行活化培养三代，采用管式离心机(10000r/min以上)离心10-15min，收集菌泥。
2)制备菌泥混合液：
取上述加工好的菌泥1公斤加入20％脱脂奶粉水溶液3公斤(菌泥:20％脱脂奶粉溶液＝1:3)，充分混匀，即得加入保护剂的菌泥混合液。
3)制粒：
以微晶纤维素空白丸芯和海藻酸钠充分混匀作为基质制粒，3.6公斤的微晶纤维素加入0.36公斤的海藻酸钠(微晶纤维素：海藻酸钠＝10：1)，再加入菌泥混合液4公斤(菌泥混合液:微晶纤维素≈1:1)。最后制粒得约8公斤的湿颗粒料。
流化床制粒工艺参数如下：
进样量 进风量 流速 雾化压力 物料温度 进风温度
热机 12m<sup>3</sup>/h ---- ---- 至30℃ 65℃
0-20ml 15-24m<sup>3</sup>/h 5-8r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 29±1℃ 65℃
20-40ml 25-40m<sup>3</sup>/h 8-13r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 29±1℃ 65℃
40-60ml 40-50m<sup>3</sup>/h 13-10r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 29±1℃ 65℃
干燥10min 45m<sup>3</sup>/h ---- ---- 31-40℃ 关闭温度
注：热机为让物料温度达到30℃以上；每阶段随情况微调进风量和流速。制粒后得约7公斤的湿颗粒。
4)包衣液的制备
一次包衣液的制备：配制1.5-2％的海藻酸钠和壳聚糖水溶液，其中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为4:1。
二次包衣液的制备：配制3％的乙基纤维素溶液。
5)流化床包衣
一次包衣：采用顶喷包衣，包衣液为1.5％海藻酸钠溶液，按照颗粒：1.5％海藻酸钠＝4：3的用量进行包衣，一次包衣参数如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度
干燥10min 50m<sup>3</sup>/h ---- 1.2kg/cm<sup>3</sup> 26℃ 55℃
0-20ml 50m<sup>3</sup>/h 10r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 27℃ 55℃
20-40ml 50m<sup>3</sup>/h 12-13.5r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 27±1℃ 55℃
40-60ml 55m<sup>3</sup>/h 15r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 27±1℃ 55℃
60-105ml 55m<sup>3</sup>/h 18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 27±1℃ 55℃
105-150ml 60m<sup>3</sup>/h 18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 27±1℃ 55℃
干燥5min 60m<sup>3</sup>/h ---- ---- 29-34℃ 关闭温度
颗粒在包衣前先在流化床干燥10min，整个包衣过程约耗时1～1.5h。在商品生产中可以根据包被量的需求选用大型流化床进行包被。
二次包衣：一次包衣结束后进行二次包衣，二次包衣液用量为：一次包衣颗粒：12％丙烯酸树脂水溶液＝4g:1mL进行包衣，包衣条件如下：
进样量 进风量 流速 雾化压力 物料温度 进风温度
0-5ml 60m<sup>3</sup>/h 18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 28-30℃ 55℃
5-20ml 60-70m<sup>3</sup>/h 18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 28-30℃ 55℃
干燥10min 60-70m<sup>3</sup>/h ---- ---- 28-30℃ 关闭温度
二次包衣结束后，关闭流化床，利用仪器的余温干燥10min。
包被前后活菌数比较及包埋率见表2。
表2
由表2可知，经本发明包被处理的复合乳酸菌在包被后活菌数仍可达109，且包埋率可达80％左右。
值得说明的是，本方法还可适用于本发明中未提及的其他益生菌。
实施例3微胶囊产品的性能试验
现有报道均采用体外模拟胃肠道环境，来检测包被后的菌体是否可以耐受胃酸和胆盐环境，最终靶向释放。而本研究采用体内验证的方法，真实评估乳酸菌在发挥益生作用时所经历的生物过程，具体实施如下：
试验在北京市顺义区中地种畜良种奶牛科技园选取4头体况良好，体重相近的三胎荷斯坦干奶牛，安装永久性瘤胃瘘管和十二指肠瘘管，用于瘤胃和十二指肠内容物的采集。待术后护理1月后，动物机体恢复至正常状态进行试验。
试验共分三期，每期正式期7天，间隔期20天，4头瘘管牛每日饲喂2次(早9：00和晚21：00)全混合日粮。采用自身对照试验设计，第一期为空白对照组，不添加任何益生菌，第二、三期(试验组)分别在晨饲后1h(10：00)打开瘤胃瘘管塞投喂未包被植物乳杆菌和实施例1的包被植物乳杆菌菌粉(有效活菌数分别为8×109cfu/g和3.8×109cfu/g)。试验组连续投喂7天，每日投菌量为80g(头·d)，则每头牛每日饲喂活菌量分别达到6.40×1011cfu和3.04×1011cfu。每期试验最后3天连续采样，每天采样时间点均为晨饲前8:00开始第一次采样，随后每间隔3h进行24h动态采集瘤胃液、十二指肠食糜以及直肠粪样，采用流式细胞仪检测其中活菌比例，以及定量PCR检测乳酸菌达到肠道的数量(表3、表4)。
表3瘤胃液和十二指肠液活菌比例(％)
注：同行肩标不同字母表示差异显著(P&lt;0.05)；相同或无字母表示差异不显著(P&gt;0.05)。
由表3可知，在瘤胃液中，与对照组相比，在11：00、2：00、5：00和全天平均值中包被植物乳杆菌JCM-1149活菌比例显著升高(P&lt;0.05)；在十二指肠液中，8：00、11：00、20：00和全天平均值中，包被植物乳杆菌JCM-1149活菌比例显著升高(P&lt;0.05)。
表4定量瘤胃和肠道植物乳杆菌JCM-1149含量(ng)
注：同行肩标不同字母表示差异显著(P&lt;0.01)；相同表示差异不显著(P&gt;0.01)。
由表4可知，在瘤胃液、十二指肠液以及直肠粪便中，包被植物乳杆菌JCM-1149定量PCR值显著高于对照组以及未包被植物乳杆菌JCM-1149(P&lt;0.01)。在瘤胃中，3组Q-PCR的值都在一个数量级上，说明刚投入瘤胃中包被的植物乳杆菌JCM-1149还未完全释放，说明在瘤胃中包衣起到保护乳酸菌的作用，避免瘤胃微生物的降解；而在十二指肠中，包被的植物乳杆菌JCM-1149抵御真胃胃酸的侵蚀，可以在肠道释放，所以定量的PCR值升高；在直肠中，包被的植物乳杆菌JCM-1149基本释放，Q-PCR的值显著升高，分别比瘤胃和十二指肠中Q-PCR的值高1和2个数量级，说明包被的植物乳杆菌JCM-1149在肠道大量释放。
由表3和表4试验结果可知，包被后的植物乳杆菌JCM-1149可以顺利通过瘤胃、真胃，最终到达肠道，从而促进外源乳酸菌在奶牛肠道定植。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、益生菌菌泥混合液的制备：将益生菌进行活化、培养，得到益生菌发酵液，离心，弃上清，收集菌体，得到菌泥；向所述菌泥中加入适量脱脂奶粉保护液，得到菌泥混合液；
B、制粒：将微晶纤维素空白丸芯和海藻酸钠作为起膜芯粒加入流化床中，使所述菌泥混合液按照一定流速注入所述流化床中，在一定条件下混合制粒；
C、一次包衣：将一次包衣液均匀喷涂到步骤B所得颗粒上，得到一次包衣颗粒；
D、二次包衣：将二次包衣液均匀喷涂到步骤C所得颗粒上，完成二次包衣，干燥后即得益生菌微胶囊成品；
其中，所述一次包衣液为1.5-2％的海藻酸钠水溶液，或者1.5-2％的海藻酸钠和壳聚糖水溶液；其中1.5-2％的海藻酸钠和壳聚糖水溶液中海藻酸钠与壳聚糖的质量比为2-4:1；
所述二次包衣液为10-12％的丙烯酸树脂水溶液、1-5％的乙基纤维素溶液或氢化油脂；
在制粒、一次包衣和二次包衣过程中，将混合物料温度控制在25-40℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述菌泥与脱脂奶粉保护液的体积比为1:1-3；其中，所述脱脂奶粉保护液的浓度为10％-30％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述起膜芯粒与菌泥混合液的用量比为1g:1-2mL；其中，所述起膜芯粒中微晶纤维素空白丸芯与海藻酸钠的重量比为11:1-5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B进行流化床制粒的条件如下：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包衣所用一次包衣液为1.5-2％的海藻酸钠水溶液，二次包衣液为10-12％的丙烯酸树脂水溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤C进行流化床一次包衣的条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度 热机 20m<sup>3</sup>/h ---- ---- 至30℃ 70℃ 0-10ml 20-30m<sup>3</sup>/h 6-8r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃ 10-20ml 30-38m<sup>3</sup>/h 8-12r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃ 20-32ml 38-45m<sup>3</sup>/h 12-18r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃
其中，所述颗粒与包衣液的用量比为1.5-2g:1mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤D进行流化床二次包衣的条件如下：
进样量 进风量 包衣液流速 雾化压力 物料温度 进风温度 0-5ml 55m<sup>3</sup>/h 15r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃ 5-16ml 55m<sup>3</sup>/h 16r/min 1.2kg/cm<sup>3</sup> 31±1℃ 75℃ 干燥10min 50m<sup>3</sup>/h ---- ---- 31-40℃ 关闭温度
其中，所述一次包衣颗粒与包衣液的用量比为2-4g:1mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述益生菌包括乳酸菌。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法制备的益生菌微胶囊。
10.权利要求9所述益生菌微胶囊的以下任一种应用：
1)在饲料制备中的应用；
2)在微生态制剂，特别是反刍动物微生态制剂制备中的应用。
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