CN109170144A - 基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法 - Google Patents

基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包括以下步骤：(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28‑32℃，培养时间：18‑24h。(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行发酵，接种量为3～30％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量。将活化后的菌种接种至棉籽粕进行发酵，利用微生物的作用降低发酵底物中的游离棉酚和提高氨基酸及小肽含量。

Description

基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复 合型生物饲料的方法。
背景技术
生物饲料一般是指以饲料和饲料添加剂为对象，以基因工程、蛋白质工程、发酵工程等 高新技术为手段，在人工控制条件下，利用乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌等有益微生物自身的 生长代谢活动，将原料中的抗营养因子分解或转化，产生更能被畜禽采食、消化、吸收，养 分更高且无毒害作用的饲料。目前，生物饲料的市场值达到每年30亿美元，并以年均20％ 的速度递增，预计到2025年，世界范围内生物饲料的市场额将达到200亿美元/年。目前我 国有1,000余家企业专门从事生物酶制剂、益生素、植物提取物类生物饲料及其添加剂的生 产加工。但与国外相比，生物饲料(发酵饲料)普及率不到饲料总量的3％，生物饲料的研究 与产业化起步较晚，整体研发与产业化水平落后于发达国家，且发展很不平衡。许多关键生 物饲料的生产还处于仿制水平或严重依赖国外技术，缺乏自主知识产权。
随着我国饲料及养殖业的不断快速发展，蛋白质词料资源短缺己成为饲料产业发展的重 要制约因素。目前主要是通过降低饲料中蛋白质添加量和进口部分蛋白饲料来解决，这不仅 要花费大量的外汇，且使得饲料行业的生产成本难以降低。另外，我国许多资源丰富的饼粕 类蛋白饲料由于含抗营养因子或营养成分不平衡等原因，在动物饲粮中不能充分利用。在这 种新的市场条件下，开发生物饲料原料是一种解决蛋白质饲料资源短缺的有效途径之一。
黄浆水(Yellow serofluid)是豆制品厂排出的废水，因其含有丰富的营养而适合微生物的 生长。据研究，黄浆水中一般固形物的含量在1％以上，其中蛋白质含量约为0.3％、脂肪含 量约为0.08％、还原糖含量为0.15％左右；此外，还含有大豆异黄酮、大豆皂苷等多种功能 性成分，目前我国大多数企业将黄浆水直接排放，不仅没有充分利用其营养价值，而且直接 排放污染环境，不利于清洁生产和增加大豆加工附加值。黄浆水废液中干固物形态含量高， 易造成高浓度有机废水污染，治理难度大，并且造成资源的严重浪费。所以很有必要把黄浆 水利用到农业资源化经济中来，把它转化成一种好的生物词料资源。
棉籽粕(Cottonseed meal)是提取棉籽油后的副产品，粗蛋白质含量可高达53％，仅次 于豆粕，是重要的植物性蛋白质资源之一。我国棉籽粕资源丰富，价格低廉，棉籽蛋白在质 量上近似豆类蛋白质，是一种重要的饲料蛋白资源，广泛应用于饲料工业。但由于棉籽粕中 含有的抗营养因子，特别是游离棉酚，以及氨基酸比例不均衡，同时由于棉籽结构致密造成 的适口性差和消化率偏低等限制了其饲用价值。目前，应用发酵技术处理棉籽粕，是有效提 高棉籽粕品质的方法之一，有研究者将大豆粉和棉籽粉混合经米曲霉发酵后，除有效降低棉 酚的毒性外，还可以提高鱼组织中的自由基清除活性。此外，在发酵过程中还可以产生直接 被动物吸收的小肽和其他多种生物活性物质，这对动物的生长十分有利。同时在发酵过程中 会产生呈味物质，这对于幼龄动物，具有明显的诱食效果。并且，由于部分碳水化合物被降 解，棉籽粕致密结构变得疏松，适口性将显著提高。
目前，国内外相关研究主要集中在黄浆水、棉籽粕单物料发酵及棉籽粕喂食动物后所产 生的影响方面，对于将黄浆水及棉籽粕组合后进行固体发酵，尚未见有关报道。
因此，有必要开发一种基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法； 在前期关于黄浆水及棉籽粕发酵研究的基础上，将黄浆水及棉籽粕按一定比例混合后，进行 微生物固态法发酵，生产多功能、环保型生物饲料；利用微生物的作用降低发酵底物中的游 离棉酚和提高氨基酸及小肽含量；使生态效益、社会效益和企业经济效益得到较好的统一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种多功能环保且成本低廉的基于多菌种协同发酵制 备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与 棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子培养 基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行发酵，接种量为3～30％， 发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发酵产品中的 粗蛋白及游离棉酚含量。
采用上述技术方案，将活化后的菌种接种至棉籽粕进行发酵，利用微生物的作用降低发 酵底物中的游离棉酚和提高氨基酸及小肽含量；使用微生物发酵法对棉籽粕进行脱毒，可以 避免化学添加剂和物理法对棉籽蛋白功能性质的影响，不会对其风味、色泽以及适口性构成 损害，通过发酵产生的各种消化酶类、氨基酸、维生素及小肽等也大大提高了棉籽粕的营养 价值和蛋白的营养性能，极大的提高了棉籽粕的经济价值。
作为本发明的优选技术方案，所述菌种为霉菌或/和芽孢杆菌或/和酵母菌。
作为本发明的优选技术方案，所述霉菌为黑曲霉和/或白地霉，所述芽孢杆菌为枯草芽孢 杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的一种或几种；所述酵母菌为产朊假丝酵母、杰丁毕 赤酵母和热带假丝酵母中的一种或几种。
作为本发明的优选技术方案，所述菌种为霉菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁 培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml， 煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可。
作为本发明的优选技术方案，所述菌种为芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB 培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值 7.0～7.2；所述步骤(2)中的液体种子培养基为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2。
作为本发明的优选技术方案，所述菌种为酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD 培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所 述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体培养基。
作为本发明的优选技术方案，所述步骤(3)棉籽粕发酵为平板点种发酵或/和三角瓶棉 籽粕发酵或/和浅盘固体发酵；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼脂2％， pH值为7.0±0.5，121℃灭菌15min；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕44％， 麸皮10％，尿素2％，水分44％(即按料液比1:1，g/ml)，然后装量50g/250ml，封口，121℃ 灭菌15min；所述浅盘固体发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水 44％(即按料液比1:1，g/ml)，不经灭菌；放置在25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄层。 将黄浆水中非蛋白氮尽可能转化为微生物蛋白，提高饲料中蛋白质含量；提高黄浆水及棉籽 粕发酵产品的蛋白质品质，降低游离棉酚含量，使其达到饲用标准，并应用到动物饲养中。
作为本发明的优选技术方案，所述棉籽粕为脱酚棉籽蛋白，其中粗蛋白含量为49.90％， 游离棉酚含量为842mg/kg。
与现有技术相比，具有以下优势：将活化后的菌种接种至棉籽粕进行发酵，利用微生物 的作用降低发酵底物中的游离棉酚和提高氨基酸及小肽含量；使用微生物发酵法对棉籽粕进 行脱毒，可以避免化学添加剂和物理法对棉籽蛋白功能性质的影响，不会对其风味、色泽以 及适口性构成损害，通过发酵产生的各种消化酶类、氨基酸、维生素及小肽等也大大提高了 棉籽粕的营养价值和蛋白的营养性能，极大的提高了棉籽粕的经济价值。
附图说明
图1为基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法中的四种单菌种 的黄浆水与棉籽粕平板点种实验培养后的照片图；
图2为基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法中浅盘固体发酵 试验的发酵前后的对比照片图。
具体实施方式
实施例1：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子培养 基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行发酵，接种量为3～30％， 发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发酵产品中的 粗蛋白及游离棉酚含量；所述菌种为霉菌或/和芽孢杆菌或/和酵母菌；所述霉菌为黑曲霉和/ 或白地霉，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的一种或几种； 所述酵母菌为产朊假丝酵母、杰丁毕赤酵母和热带假丝酵母中的一种或几种；所述菌种为霉 菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮 沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽 汁液体培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即 可；所述菌种为芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB培养基，配方为：牛肉膏5g， 蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述步骤(2)中的液 体种子培养基为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述菌种为酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所述步骤(2)中的液体种子 培养基为豆芽汁液体培养基；所述步骤(3)棉籽粕发酵为平板点种发酵或/和三角瓶棉籽粕 发酵或/和浅盘固体发酵；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼脂2％，pH 值为7.0±0.5，121℃灭菌15min；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕44％，麸 皮10％，尿素2％，水分44％，然后装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min；所述浅盘固体 发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水44％，不经灭菌；放置在 25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄层。将黄浆水中非蛋白氮尽可能转化为微生物蛋白，提 高饲料中蛋白质含量；提高黄浆水及棉籽粕发酵产品的蛋白质品质，降低游离棉酚含量，使 其达到饲用标准，并应用到动物饲养中。
实施例2：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 霉菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆 芽汁液体培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖 即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行平板点种发酵，接种 量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发 酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼 脂2％，pH值为7.0±0.5，121℃灭菌15min。
实施例3：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述步骤(2)中的液体种子培养基 为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行平板点种发酵，接种 量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发 酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼 脂2％，pH值为7.0±0.5，121℃灭菌15min。
实施例4：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g， 葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体 培养基；配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行平板点种发酵，接种 量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发 酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼 脂2％，pH值自然，121℃灭菌15min。
将实施例2、实施例3、实施例4中的三种菌种以及这三种菌种混合点种到棉籽粕含量为 3％的培养基平板上，所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼脂2％，pH值 自然，121℃灭菌15min；进行3次平行试验，观察并记录，结果如下图1所示。由下图1可见，不同菌种在以棉籽粕为唯一底物的平板培养基上的生长状况稍有差别，但初选的各菌株 都能在棉籽粕培养基上生长。同时，霉菌及芽孢杆菌、酵母菌的混合菌也能同时在含有棉籽 粕的培养基上生长。
实施例5：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 霉菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆 芽汁液体培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖 即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行三角瓶棉籽粕发酵， 接种量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测 定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕 44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水44％，然后装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min。
实施例6：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述步骤(2)中的液体种子培养基 为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行三角瓶棉籽粕发酵， 接种量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测 定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕 44％，麸皮10％，尿素2％，水分44％，然后装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min。
实施例7：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间： 18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g， 葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体 培养基；配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行三角瓶棉籽粕发酵， 接种量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测 定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕 44％，麸皮10％，尿素2％，水分44％，然后装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min。
单菌三角瓶发酵试验：将实施例5、实施例6、实施例7中的三种菌种分别进行单菌种三 角瓶棉籽粕固体发酵实验，结果如表1所示。
表1单菌发酵后棉籽粕中粗蛋白含量及游离棉酚测定结果
注：数据分析采用SPSS 18.0软件单因素方差分析(ANOVA)
——表示与空白对照(原料)相比较差异不显著(p>0.05)
*表示与空白对照(原料)相比较差异显著(p<0.05)
从表1可以看出，所选用的霉菌及酵母菌能显著的提高棉籽粕中粗蛋白的含量，同时单 菌均能显著的降低饲料中游离棉酚的含量。
混菌三角瓶发酵优化试验：将实施例5、实施例6、实施例7中的三种菌种按不同比例混 合进行混菌三角瓶棉籽粕固体发酵实验，结果如表2所示。
表2不同比例(霉菌、芽孢杆菌、酵母菌)混菌发酵后棉籽粕中粗蛋白含量及游离棉酚测定结果
注：数据分析采用SPSS 18.0软件单因素方差分析(ANOVA)
*表示与空白对照(原料)相比较差异显著(p<0.05)
***表示与空白对照(原料)相比较差异极显著(p<0.001)。
从上表可以看出，霉菌及芽孢杆菌、酵母菌不同比例所组成的混合菌固体发酵棉籽粕均 能极显著地降低原料中游离棉酚的含量，与棉籽粕相比，霉菌及芽孢杆菌、酵母菌在特定比 例混合中增蛋白作用明显。以霉菌及芽孢杆菌、酵母菌为的混合菌进行三角瓶棉籽粕发酵试 验，其发酵工艺为：发酵培养基：棉籽粕44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水44％(即按料 液比1:1，g/ml)，装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min；接种量为15％，发酵温度为30℃， 发酵时间72h。经发酵后，棉籽粕中粗蛋白相比原料有了一定程度的提高(从54.78％到 59.41％)，而其中游离棉酚含量相比原料有极显著的下降(p<0.001)。
实施例8：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子培养 基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为曲霉； 所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min 后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体培 养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行浅盘固体发酵，接种 量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发 酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述浅盘固体发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％， 尿素2％，黄浆水44％，不经灭菌；放置在25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄层。
实施例9：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述步骤(2)中的液体种子培养基 为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行浅盘固体发酵， 接种量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测 定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述浅盘固体发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸 皮10％，尿素2％，黄浆水44％，不经灭菌；放置在25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄 层。
实施例10：该基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，具体包 括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间： 18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子 培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～120h后转移到冰箱中备用；所述菌种为 酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g， 葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体 培养基；配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行浅盘固体发酵，接种 量为15％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发 酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量；所述浅盘固体发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％， 尿素2％，黄浆水44％，不经灭菌；放置在25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄层。
浅盘固体发酵试验：将实施例8、实施例9、实施例10中的菌种分别放入具有浅盘固体发酵 培养基的25cm×45cm搪瓷盘中，铺成约3cm薄层，用8层纱布覆盖发酵2d后，发酵前和 发酵后的对比照片如图2所示，棉籽粕颜色变深，表面结块，有一定的槽臭味，说明棉籽粕 完全可以不经灭菌而直接进行发酵。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不 脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要 求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)活化菌种：将菌种接种至斜面培养基中进行活化，培养温度：28-32℃，培养时间：18-24h。
(2)制备液体种子：将经过步骤(1)活化好的菌种从斜面培养基接种到装有液体种子培养基的三角瓶中，放置在恒温摇床中30℃培养18～24h后转移到冰箱中备用；
(3)棉籽粕发酵：将步骤(2)中制备好的液体种子接种至棉籽粕进行发酵，接种量为3～30％，发酵温度为30℃，连续发酵24～72h；发酵后在60℃下烘干得发酵产品，测定发酵产品中的粗蛋白及游离棉酚含量。
2.根据权利要求1所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述菌种为霉菌或/和芽孢杆菌或/和酵母菌。
3.根据权利要求2所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述霉菌为黑曲霉和/或白地霉，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的一种或几种；所述酵母菌为产朊假丝酵母、杰丁毕赤酵母和热带假丝酵母中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述菌种为霉菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为豆芽汁培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖及2％琼脂；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体培养基，配方为：豆芽200g，加水1000ml，煮沸10min后过滤，滤液加2％葡萄糖即可。
5.根据权利要求1所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述菌种为芽孢杆菌；所述步骤(2)中的斜面培养基为LB培养基，配方为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1 000ml，pH值7.0～7.2；所述步骤(2)中的液体种子培养基为LB液体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1 000ml，pH值7.0～7.2。
6.根据权利要求1所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述菌种为酵母菌；所述步骤(2)中的斜面培养基YPD培养基，配方为：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，加水1000ml；所述步骤(2)中的液体种子培养基为豆芽汁液体培养基。
7.根据权利要求1所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述步骤(3)棉籽粕发酵为平板点种发酵或/和三角瓶棉籽粕发酵或/和浅盘固体发酵；所述平板点种发酵的初筛培养基的配制：棉籽粕3％，琼脂2％，pH值为7.0±0.5，121℃灭菌15min；所述三角瓶棉籽粕发酵的培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水44％，然后装量50g/250ml，封口，121℃灭菌15min；所述浅盘固体发酵培养基的配制：棉籽粕44％，麸皮10％，尿素2％，黄浆水44％，不经灭菌；放置在25cm×45cm搪瓷盘内，铺成约3cm薄层。
8.根据权利要求7所述的基于多菌种协同发酵制备黄浆水与棉籽粕复合型生物饲料的方法，其特征在于，所述棉籽粕为脱酚棉籽蛋白，其中粗蛋白含量为49.90％，游离棉酚含量为842mg/kg。
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