CN109164188A - 一种区分不同产区和发酵类型乌龙茶的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了采用全自动顶空固相微萃取(headspace solid‑phase microextraction，HS‑SPME)法来萃取茶叶中的香气成分，并结合气相色谱‑质谱(gas chromatography‑mass spectrometry,GC‑MS)来分离和鉴定茶叶的香气成分，利用鉴定出来的茶叶香气成分相对含量，结合化学计量学方法(CA和PCA)来构建聚类和主成分模型，从而把不同产区和发酵类型的乌龙茶区分开。本发明为茶叶的品质审评鉴定(特别是基于香气成分的产地和发酵类型判别)提供了一种新的有效的评估和控制的方法。本发明方法操作简单易行、成本低、环保，能对茶叶的质量评估和控制提供一种高效、客观、规范化的方法。
Description
技术领域
本发明属于茶叶技术领域，具体而言，涉及一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法区分不同产区和发酵类型乌龙茶的方法。
背景技术
乌龙茶属于半发酵茶，是我国6大茶类之一，其主要生产地区集中于闽北(武夷岩茶、水仙、大红袍、肉桂等)、闽南(铁观音、奇兰、水仙、黄金桂等)、广东(凤凰单枞、凤凰水仙、岭头单枞等)及台湾(冻顶乌龙、包种、乌龙等)地区，不同地区发酵程度也不一样，比如铁观音属于轻度发酵乌龙茶，而凤凰单枞和东方美人等属于重度发酵的乌龙茶。乌龙茶其色泽青褐、汤色黄亮、味道纯正、香气宜人，深受消费者喜爱。乌龙茶以天然花果香和独特的韵味闻名于世，其精油含量高，味道纯正，受到国内外专家的普遍关注。
但是由于茶树品种、产地、季节和采制方法的不同，各种乌龙茶形成了自己独特的品质特征，其中香气是体现茶叶品质的一个重要因素，也是捕获和培养消费者忠诚度最重要的因素。
目前，对乌龙茶香气成分的研究已有很多报道，但大多数是停留在单一品种或者同一产区不同品种之间的比较研究上，对不同品种、产地和制茶工艺的乌龙茶香气成分的综合比较及其变化规律方面的研究少有报道。
中国专利申请号201510652180.6公开了一种利用近红外光谱技术鉴别茶叶品种的方法，该方法用近红外光谱仪获取茶叶样本的近红外漫反射光谱，并对所述光谱进行数学处理。但是，该方法不能获取茶叶成分，特别是香气的具体信息，对不同茶叶的香气成分无法鉴别。
中国专利申请号201710164063.4公开了一种快速、无损的茶叶产地鉴定方法，其采用质子转移反应－飞行时间质谱仪对茶叶进行无损分析，并对质谱数据进行分析，建立识别模型，以鉴定茶叶产地。
中国专利申请号201711042224.9公开了一种茶叶元素指纹图谱的构建方法，其用于鉴别茶叶产地，包括用微波消解仪消解茶叶，并用电感耦合等离子体质谱测定茶叶样品中元素含量，进一步将茶叶元素组成转化为元素指纹图谱，用以鉴定茶叶产地。但是，该方法也不涉及茶叶香味成分的鉴定。
中国专利申请号201711321322.6公开了通过GC×GC-TOF/MS技术建立茶叶中香精的高通量筛查检测方法，并建立茶叶中香精快速筛查数据库以及茶叶中香气成分数据库。该专利申请不涉及茶叶产地鉴定方法，也没有公开对香气成分进行化学计量。
此外，HS-SPME是一种集萃取、浓缩和进样为一体且无需任何溶剂的样品前处理技术。且HS-SPME结合GC-MS已经被成功用于很多茶叶的香气成分的定性和定量分析。然而，利用各茶叶香气成分的信息并进一步通过化学计量学方法(CA和PCA)来区分不同产区和发酵类型乌龙茶的方法鲜有报道。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题及不足，本发明提供一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法来区分不同产地和发酵类型乌龙茶的方法，本发明方法采用HS-SPME结合GC-MS法来客观的定性和定量分析茶叶香气成分，可解决传统的感官评价茶叶品质的不足之处(主观性太强)。同时结合香气成分的相对含量，利用CA和PCA进一步分析可将不同产区和发酵类型的茶叶区分开来。这一方法的建立为茶叶品质评估提供了准确和可靠的审评依据，为茶叶的生产、加工以及消费者提供控制和评鉴的依据。本发明为茶叶的品质审评鉴定(特别是基于香气成分的产地判别)提供了一种新的有效的评估和控制的方法。本发明方法操作简单易行、成本低、环保，能对茶叶的质量评估和控制提供一种高效、客观、规范化的方法。
在一个实施方案中，本申请涉及一种区分不同产地和发酵类型乌龙茶的方法，包括以下步骤：
(1)将各乌龙茶样品粉碎为茶粉并进一步制备为用于顶空固相微萃取的样品；
(2)用全自动顶空固相微萃取法(HS-SPME)，使用PDMS/DVB/CAR萃取纤维头萃取茶粉中的香气成分；
(3)将萃取头中的香气成分解吸附，并通过气相色谱-质谱法(GC-MS)进行分离和鉴定，得到质谱数据；
(4)将所述质谱数据在标准谱库中进行检索，进行定性和定量分析，得到香气成分各组分的相对含量；
(5)利用所述香气成分各组分的相对含量，并结合香气成分各组分的CA和PCA化学计量学方法，将不同产地和发酵类型的乌龙茶区分开。
在另一个的实施方案中，在步骤(2)中萃取30－90分钟，优选60分钟。在另一个的实施方案中，所述PDMS/DVB/CAR萃取纤维头是65μm的聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯/碳烯萃取纤维头，生产厂家为美国Supelco公司。在一个的实施方案中，在步骤(3)中解吸附2－4分钟，优选3.5分钟。在一个的实施方案中，所述标准谱库是NIST 08.L标准谱库，通过质谱匹配度和各组分的RI值进行定性，采用面积归一化法进行定量。该NIST 08.L标准谱库为购买厂家仪器安装时自带。CA和PCA化学计量学方法所使用的软件为SIMCA-P15(Umetrics公司)，该方法是把将所有茶叶的香气成分的相对含量作为变量导入化学计量学软件中进行分析。具体实施方法为基于GC-MS的分析结果，将所分析茶叶样品的香气成分含量矩阵表(A样品×B种组分)输入多元统计学软件SIMCA-P15中进行分析。其中PCA是在尽可能保留原始变量信息的基础上，降低维数，通过由原始变量线性组合的主成分来最大程度提取有用的信息。通过PCA可以看出样品与样品之间的关系，变量(香气成分)和变量之间的关系，在化学模式识别中用于分类和聚类。聚类分析(CA)，是根据“物以类聚”的道理，对样品或指标进行分类的一种多元统计分析方法，它讨论的对象是大量的样品，要求能合理地按各自的特性来进行分类，没有任何模式可供参考或依循，即是在没有先验知识的情况下进行的。
在一个实施方案中，在所述CA和PCA化学计量学方法中，采用小波光谱滤波法对所述香气成分各组分的相对含量进行预处理，以清除无效数据，得到一系列变量。在进一步的实施方案中，对所述变量进行降维处理，以产生新的变量用于进一步的分析。在另一实施方案中，在所述CA和PCA化学计量学方法中，采用小波光谱滤波法对所述香气成分各组分的相对含量进行预处理，以清除无效数据，得到一系列变量，并对所述变量进行降维处理，以产生新的变量用于进一步的分析。在另一个实施方案中，在所述CA化学计量学方法中涉及距离的计算，该计算采用欧式距离算法进行。在CA和PCA化学计量学方法中对数据进行的上述预处理，降维分析，以及欧式距离算法的采用使得本发明能够较好地实现本发明的方法，相比SIMCA-P15软件中的各参数的默认值，得到更好的茶叶区分结果。
在一个实施方案中，茶粉是采用高速多功能粉碎机粉碎的，以40目过筛。在另一个的实施方案中，步骤(1)中的用于顶空固相微萃取的样品如下制备：称取各茶样的茶粉，放入顶空瓶中，加入烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间1-3min，然后放置顶空的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡5-15min，优选10min。在另一个的实施方案中，步骤(3)中GC条件为：HP-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃；载气为高纯氦气，纯度≥99.999％，柱流量1.0mL/min；升温程序:初始温度50℃，保持5min，以3℃/min升至210℃，保持3min，再以15℃/min升至230℃,不分流进样；MS条件为：离子源EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，转接口温度280℃，质量扫描范围m/z 35～500，溶剂延迟时间为2.8min。
具体而言，本申请公开了一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法区分不同产地和发酵类型乌龙茶的方法，具体步骤如下：
(1)材料准备：选择具有代表性的不同产地和发酵类型的乌龙茶样品，生产于2013年。
(2)样品制备：将PDMS/DVB/CAR萃取纤维头在GC进样口250℃老化60min。准确称取各茶样的茶粉2g，放入20mL顶空瓶中，加入5mL烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间2min。然后放置顶空的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡10min后，自动进样器(G6500转盘式自动进样器，带顶空固相微萃取装置，生产于美国CTC公司)将萃取头***顶空瓶顶空部位萃取60min，取出后立即***气相色谱进样口，解吸附3.5min，同时启动仪器收集数据；
(3)成分鉴定：将GC-MS(7890A-5975C GC-MS联用仪，生产厂家为美国Agilent公司)分析得到的质谱数据在NIST 08.L标准谱库(该谱库为购买厂家仪器安装时自带)进行检索，结合质谱匹配度和各组分的RI值进行定性，同时采用采用面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量；
(4)数据分析：将GC-MS分析所得的茶叶样品的香气成分含量矩阵表(A样品×B种组分)输入多元统计学软件SIMCA-P15中进行PCA和CA的分析，结果能很好的把不同发酵类型和产地的乌龙茶区分开；
所述步骤(2)中萃取纤维头为65μm的聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯/碳烯，购于美国Supelco公司；
所述步骤(2)中茶粉是采用高速多功能粉碎机粉碎的，以40目过筛；
所述步骤(2)中GC条件为：HP-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃；载气为高纯氦气，纯度≥99.999％，柱流量1.0mL/min；升温程序：初始温度50℃，保持5min，以3℃/min升至210℃，保持3min，再以15℃/min升至230℃,不分流进样。MS条件为：离子源EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，转接口温度280℃，质量扫描范围m/z35～500，溶剂延迟时间为2.8min。
本发明与传统的茶叶品质感官审评法相比其显著优点在于：
(1)结合近现代先进的分析设备和化学计量学方法来更准确的对茶叶的香气成分及属性特征进行评估；
(2)拓展了茶叶感官审评的方法学研究，建立和完善不同茶叶的评价指标体系；
(3)规范茶叶感官审评的术语以及可操作的量化措施，控制茶叶感官审评中可能存在的人为误差；
(4)为不同发酵类型、不同产区的茶叶的区分建立了一个可靠的区分模型，为茶叶品质特征的鉴定提供一个重要的标准。
附图说明
图1：实施例1中所用福建乌龙茶和台湾乌龙茶样品的GC-MS图谱。
图2：实施例1中所用福建乌龙茶和台湾乌龙茶样品的分类图。该分类图基于PCA分析得到。
图3：实施例1中所用福建乌龙茶和台湾乌龙茶样品的聚类图。该聚类图基于CA分析得到。
图4：实施例2中所用轻度发酵乌龙茶和重度发酵乌龙茶样品的GC-MS图谱。
图5：实施例2中所用轻度发酵乌龙茶和重度发酵乌龙茶样品的分类图。该分类图基于PCA分析得到。
图6：实施例2中所用轻度发酵乌龙茶和重度发酵乌龙茶样品的聚类图。该聚类图基于CA分析得到。
图7：实施例3中所用福建产的铁观音和福建产的其他乌龙茶样品的GC-MS图谱。
图8：实施例3中所用福建产的铁观音和福建产的其他乌龙茶样品的分类图。该分类图基于PCA分析得到。
图9：实施例3中所用福建产的铁观音和福建产的其他乌龙茶样品的聚类图。该聚类图基于CA分析得到。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本文发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。以下实施例中的实施方案可以进一步组合或者替换，本领域中专业技术人员对本文的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。
实施例1：一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法来区分不同产区乌龙茶的方法，具体步骤如下：
(1)材料准备：5个乌龙茶样品来自于福建省，编号为FO1-FO5，2个乌龙茶样品来自于台湾地区，编号为TO1-TO2，所有茶叶的生产年份均为2013年。
(2)样品制备：将PDMS/DVB/CAR萃取纤维头在GC进样口250℃老化60min。准确称取各茶样的茶粉2g，放入20mL顶空瓶中，加入5mL烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间2min。然后放置在顶空进样器的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡10min后，自动进样器将萃取头***顶空瓶顶空部位萃取60min，取出后立即***气相色谱进样口，解吸附3.5min，同时启动仪器收集数据。
(3)成分鉴定：GC-MS图谱见图1。将GC-MS(7890A-5975C GC-MS联用仪，生产厂家为美国Agilent公司)分析得到的质谱数据在NIST 08.L标准谱库进行检索，结合质谱匹配度和各组分的RI值进行定性，同时采用采用面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量。7个乌龙茶中一定鉴定出71种香气化合物，所鉴定出来的化合物涵盖了有机化学分类中的醇类、碳氢化合物、醛类、酮类、酯类、酸类和含氮化合物等。两个不同产区的乌龙茶香气组成较类似，其中主要包括橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚、植醇和茉莉酮酸甲酯等。
(4)数据分析：将GC-MS分析所得的茶叶样品的香气成分含量矩阵表(7样品×71种组分)输入多元统计学软件SIMCA-P15中进行PCA和CA的分析。我们的结果发现福建乌龙茶和台湾乌龙茶之间实现了较好的区分，在PCA的主成分得分图上，台湾的乌龙茶聚在了左边，福建的乌龙茶聚在了右边(见图2)；在CA聚类图上，福建乌龙茶和台湾乌龙茶分属于两大分支，它们分别聚在了不同的类别(见图3)。我们的结果表明，尽管两种不同产地的乌龙茶在香气组成及含量上较相似，但是PCA和CA还是能对实现它们之间较好的区分和各自的聚类。
实施例2：一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法区分不同发酵类型乌龙茶的方法，具体步骤如下：
(1)材料准备：5个轻度发酵的乌龙茶样品来自于福建省，编号为QO1-QO5。3个重度发酵的乌龙茶来自于福建、广东和台湾地区，编号为ZO1-ZO3，生产年份均为2013年。
(2)样品制备：将PDMS/DVB/CAR萃取纤维头在GC进样口250℃老化60min。准确称取各茶样的茶粉2g，放入20mL顶空瓶中，加入5mL烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间2min。然后放置在顶空进样器的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡10min后，自动进样器将萃取头***顶空瓶顶空部位萃取60min，取出后立即***气相色谱进样口，解吸附3.5min，同时启动仪器收集数据。
(3)成分鉴定：GC-MS图谱见图4。将GC-MS(7890A-5975C GC-MS联用仪，生产厂家为美国AGILENT公司)分析得到的质谱数据在NIST 08.L标准谱库进行检索，结合质谱匹配度和各组分的RI值进行定性，同时采用采用面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量。所有的8个乌龙茶样品中共鉴定出香气成分103种，鉴定出的成分中包括醇类、碳氢化合物、酯类、酮类、酚类、内酯类、酸类和含氮化合物。其中主要包括橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚、植醇和茉莉酮酸甲酯等。
(4)数据分析：将GC-MS分析所得的乌龙茶样品的香气成分含量矩阵表(8样品×103种组分)输入多元统计学软件SIMCA-P15中进行PCA和CA的分析。我们的结果发现重度发酵的乌龙茶和轻度发酵的乌龙茶之间实现了较好的区分，在PCA的主成分得分图上，轻度发酵的乌龙茶聚在了左边，重度发酵的乌龙茶聚在了右边(见图5)。在CA聚类图上，重度发酵的乌龙茶和轻度发酵的乌龙茶分属于两大分支，它们分别聚在了不同的类别(见图6)。我们的结果表明，尽管两种不同发酵类型的乌龙茶在香气组成及含量上较相似，但是PCA和CA还是能对实现它们之间较好的区分和各自的聚类。
实施例3：一种利用全自动顶空固相微萃取结合气相色谱质谱和化学计量学方法来区分福建产的铁观音和福建产的其它乌龙茶的方法，具体步骤如下：
(1)材料准备：4个铁观音样品来自于福建省，编号为FT1-FT4。另外两个乌龙茶样品也来自福建，分别是黄金桂和大红袍，编号为FO1-FO2，生产年份均为2013年。
(2)样品制备：将PDMS/DVB/CAR萃取纤维头在GC进样口250℃老化60min。准确称取各茶样的茶粉2g，放入20mL顶空瓶中，加入5mL烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间2min。然后放置在顶空进样器的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡10min后，自动进样器将萃取头***顶空瓶顶空部位萃取60min，取出后立即***气相色谱进样口，解吸附3.5min，同时启动仪器收集数据。
(3)成分鉴定：GC-MS图谱见图7。将GC-MS(7890A-5975C GC-MS联用仪，生产厂家为美国AGILENT公司)分析得到的质谱数据在NIST 08.L标准谱库进行检索，结合质谱匹配度和各组分的RI值进行定性，同时采用采用面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量。在所有的6个乌龙茶样品中，共鉴定出香气成分94种，鉴定出的成分中包括醇类、碳氢化合物、酯类、酮类、酚类、内酯类、酸类和含氮化合物。其中主要包括橙花叔醇、α-法呢烯、吲哚、植醇和茉莉酮酸甲酯等。
(4)数据分析：将GC-MS分析所得的乌龙茶样品的香气成分含量矩阵表(6样品×94种组分)输入多元统计学软件SIMCA-P15中进行PCA和CA的分析。我们的结果发现福建产的铁观音和福建产的其它乌龙茶之间实现了较好的区分，在PCA的主成分得分图上，福建产的铁观音聚在了左边，福建产的其它乌龙茶聚在了右边(见图8)。在CA聚类图上，福建产的铁观音和福建产的其它乌龙茶分属于两大分支，它们分别聚在了不同的类别(见图9)。我们的结果表明，尽管福建产的铁观音和福建产的其它乌龙茶在香气组成及含量上较相似，但是PCA和CA还是能对实现它们之间较好的区分和各自的聚类。
Claims (10)
1.一种区分不同产地和发酵类型乌龙茶的方法，包括以下步骤：
(1)将各乌龙茶样品粉碎为茶粉并进一步制备为用于顶空固相微萃取的样品；
(2)用全自动顶空固相微萃取法，使用PDMS/DVB/CAR萃取纤维头萃取茶粉中的香气成分；
(3)将萃取头中的香气成分解吸附，并通过气相色谱-质谱法(GC-MS)进行分离和鉴定，得到质谱数据；
(4)将所述质谱数据在标准谱库中进行检索，进行定性和定量分析，得到香气成分各组分的相对含量；
(5)利用所述香气成分各组分的相对含量，并结合香气成分各组分的CA和PCA化学计量学方法，将不同产地和发酵类型的乌龙茶区分开。
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(2)中萃取30－90分钟，优选60分钟。
3.权利要求2所述的方法，其中所述PDMS/DVB/CAR萃取纤维头是65μm的聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯/碳烯萃取纤维头。
4.权利要求1所述的方法，其中在步骤(3)中解吸附2－4分钟，优选3.5分钟。
5.权利要求1所述的方法，其中所述标准谱库是NIST 08.L标准谱库，通过质谱匹配度和各组分的RI值进行所述定性分析，采用面积归一化法进行所述定量分析。
6.权利要求1所述的方法，其中茶粉是采用高速多功能粉碎机粉碎的，以40目过筛。
7.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的用于顶空固相微萃取的样品如下制备：称取各茶样的茶粉，放入顶空瓶中，加入烧沸的蒸馏水冲泡，立即密闭瓶口，冲泡时间1-3min，优选2分钟，然后放置顶空的孵化器中，转速250r/min，在80℃平衡5-15min，优选10min。
8.权利要求1-7任一项所述的方法，其中步骤(3)中GC条件为：HP-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度250℃；载气为高纯氦气，纯度≥99.999％，柱流量1.0mL/min；升温程序:初始温度50℃，保持5min，以3℃/min升至210℃，保持3min，再以15℃/min升至230℃,不分流进样；MS条件为：离子源EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，转接口温度280℃，质量扫描范围m/z 35～500，溶剂延迟时间为2.8min。
9.权利要求1所述的方法，其中在所述CA和PCA化学计量学方法中，采用小波光谱滤波法对所述香气成分各组分的相对含量进行预处理，以清除无效数据，得到一系列变量，并对所述变量进行降维处理，以产生新的变量用于进一步的分析。
10.权利要求1所述的方法，其中在所述CA化学计量学方法中涉及距离的计算，该计算采用欧式距离算法进行。
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