CN109161546B

CN109161546B - 一种核酸适配体及其在检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的应用

Info

Publication number: CN109161546B
Application number: CN201811099367.8A
Authority: CN
Inventors: 李鹏飞; 余庆; 刘明珠; 李菲; 覃仙玲; 吴思婷; 肖贺贺; 陈波
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2038-09-20
Also published as: CN109161546A

Abstract

本发明公开了一种ssDNA核酸适配体及其在卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTCGGTCGGGTGGTTGGGGTGGGTGGTCGGTTTTTAAGCTGTGTCATTGTCCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’(SEQ ID NO:1)。本发明的ssDNA核酸适配体对卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体结构稳定、易修饰，便于合成和保存，可对卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌进行快速准确的检测和诊断。

Description

一种核酸适配体及其在检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的应用

技术领域

本发明涉及一种ssDNA核酸适配体及其筛选方法、检测方法和应用，特别是涉及一种ssDNA核酸适配体及其在检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的应用。

背景技术

我国作为水产养殖大国，水产养殖量占世界水产品养殖总量的70％。然而，近年来细菌性病原的暴发及流行对我国的水产养殖行业造成巨大经济损失。在广西等华南沿海地区，溶藻弧菌是引起海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一，其引起的鱼病发病迅速、死亡率高、流行面广，对着华南地区水产养殖业发展具有严重威胁。目前国际上对鱼类细菌性疾病的诊断主要采用传统观察法、免疫学检测方法、分子生物学技术等。但这些方法存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵、精确度不高等问题，不能在现场快速对溶藻弧菌进行准确检测和诊断。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水生生物致病菌快速检测技术，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失至关重要。

指数富集的配基***进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment technology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，该技术使用容量高达10¹⁴-10¹⁵的随机寡核苷酸文库，在体外经过多轮筛选最终获得能够特异性识别靶物质的单链寡核苷酸，即核酸适配体。核酸适配体具有易筛选获得、成本低、易修饰、稳定性强、高特异性识别并结合靶物质等诸多优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌进行准确检测和诊断的问题。

本发明的目地在于提供一种可特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTCGGTCGGGTGGTTGGGGTGGGTGGTCGGTTTTTAAGCTGTGTCATTGTCCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’(SEQ ID NO:1)。

进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上任一位置能进行磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化反应。

更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、羟基荧光素中的一种或多种。

本发明的另一目地在于提供一种上述ssDNA核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：

步骤1：合成以下序列所示的单链DNA文库和引物：

随机文库Library50：

5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC；

5’引物：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；

3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’；

步骤2：取10nmol上述随机文库溶解于500μl PBS中，在92℃下恒温水浴5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并除去上清，取10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库；

步骤3：取100ul筛选得到的识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库进行PCR扩增，具体的扩增条程序为：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min；

步骤4：取100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中扩增所得的双链DNA在常温下孵育20min，使用磁性分离器吸取磁珠并除去上清，用2mL PBS洗涤磁珠后，加入200μl的200mMNaOH溶液，常温反应10min，并利用磁性分离架回收磁珠，留取上清液；

步骤5：取步骤4所得上清液加入无菌水洗涤后除盐柱进行盐分分离，在重力作用下自然滴完，向收集到的液体中加入500μl PBS，得到含有DNA单链文库的溶液；

步骤6：取步骤5中得到的DNA单链文库代替步骤2中的随机文库，并将步骤2-5重复8次；

步骤7：取步骤6的DNA文库于92℃恒温水浴中加热5min，然后迅速进行冰浴，冰浴10min，取处理后的DNA单链文库的溶液与嗜水气单胞菌在冰上孵育1h；待孵育结合完成后，离心并收集上清液，将上清溶液与溶藻弧菌活菌在冰上孵育0.5-2h；待孵育结合完成后，离心移除上清，取10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，并在92℃下恒温水浴10min，在12000g的条件下离心1-20min，并收集上清液，所述上清液即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体库；

步骤8：取步骤7中所得上清溶液，依次按照步骤3、步骤4、步骤5、步骤7、步骤2、步骤3、步骤4和步骤5的实验操作顺序重复8次，最终所得溶液为ssDNA核酸适配体。

本发明的另一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体的卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的快速检测方法(AFMP)，包括以下步骤：

步骤1：对ssDNA核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nM的ssDNA核酸适配体混合，并在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清；待孵育结合后，清洗待测样品，混匀在200μl PBS溶液中，使用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测待测样品中是否有卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌。

本发明还有一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体在检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的用途。

本发明通过SELEX技术筛选得到的核酸适配体，与现有的蛋白抗体相比具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白抗体所不具备的特点，包括无免疫原性；制备周期短，重现性好；分子量小，便于体外化学合成；便于标记；易于对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代；序列稳定易于运输和保存等。采用本发明的基于核酸适配体的卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的快速检测方法对溶藻弧菌进行检测时，操作简单迅速，可用于开发相关的快速检测试剂盒。这对于溶藻弧菌的快速检测具有重要意义，在水产致病菌溶藻弧菌的检测领域有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中ssDNA核酸适配体的流式细胞仪检测荧光强度对比图；

图2为本发明实施例1中ssDNA核酸适配体分别与哈维氏弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和溶藻弧菌的结合情况对比图；

图3为本发明实施例2中ssDNA核酸适配体分别特异性识别四株不同的溶藻弧菌(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)和哈维氏弧菌的检测结果图；

图4为本发明实施例3SEQ ID NO:1核酸适配体的二级结构预测图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

实施例1ssDNA核酸适配体的制备方法如下：

步骤1：合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物

随机文库Library50：

5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC

5’引物：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；

3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’；

步骤2：将10nmol上述随机文库溶解在500μl PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速***冰中，冰浴10min，将处理后的随机文库与溶藻弧菌活菌在冰上孵育1h；孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别溶藻弧菌的核酸适配体库；

步骤3：取100ul筛选得到的识别溶藻弧菌的核酸适配体库进行PCR扩增，具体的扩增条程序是：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min。第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，得到扩增产物；

步骤4：将100μl链酶亲和素标记的磁珠与步骤3中PCR扩增所得的双链DNA在常温下孵育20min，利用双链DNA上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mL PBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入200ulNaOH溶液(200mM)，常温反应10min，利用磁性分离架回收得到上清；除盐柱用10mL无菌水洗涤后，将上清液加入除盐柱，靠重力作用自然滴完。加入500μl PBS，收集到含有DNA单链文库的溶液；

步骤5：将步骤4中得到的DNA单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复步骤2-4所示的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程8次；

步骤6：在第二轮及第二轮以后筛选中，用嗜水气单胞菌为对照，将步骤5后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的DNA文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与嗜水气单胞菌活菌在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与溶藻弧菌活菌进行冰浴结合；孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤溶藻弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的高特异性识别溶藻弧菌的核酸适配体库；

步骤7：将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的PCR扩增和步骤4的单链DNA文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞仪检测所得文库对溶藻弧菌识别能力的增强情况，直至8轮筛选后，文库对溶藻弧菌识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测溶藻弧菌的ssDNA核酸适配体，序列为

5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTCGGTCGGGTGGTTGGGGTGGGTGGTCGGTTTTTAAGCTGTGTCATTGTCCGAAGGACGCAGATGAA GTCTC-3’(SEQ ID NO:1)。

实施例1ssDNA核酸适配体的AFMP检测方法如下：

步骤1：对实施例1ssDNA核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：将200nM羟基荧光素(FAM)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库溶于500μlPBS中，然后与溶藻弧菌活菌在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清，用10mLPBS离心洗涤三次，最终将溶藻弧菌混匀在200μl PBS中，用于流式细胞仪检测50000个细胞。根据荧光值的变化检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌。如图1所示，1st、3rd、5th、6th、7th、8th、9th分别为实施例1中流式细胞仪检测羟基荧光素(FAM)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮筛选文库与卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的结合情况。

实施例2

按实施例1的步骤构建基于SEQ ID NO:1核酸适配体的卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的快速检测方法(AFMP)并对4株不同的溶藻弧菌进行检测。

如图3所示，上述快速检测方法(AFMP)能够特异性识别四株不同的溶藻弧菌(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)，而对对照组的哈维氏弧菌没有发生明显的识别。

实施例3

利用MFOLD软件在线预测核酸适配体的二级结构。

SEQ ID NO:1核酸适配体的二级结构预测结果如图4所示，核酸适配体形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例4

取用实施例1所得ssDNA核酸适配体，进行AFMP试剂盒组装，形成一种用于诊断鱼类是否被溶藻弧菌侵染的的AFMP检测试剂盒。

基于图1、2、3的结果，可以证明本发明实施例1所示的ssDNA核酸适配体经过生物素、酶、异硫氰酸荧光素、羟基荧光素等荧光物质或发光材料标记修饰后，仍可与溶藻弧菌进行特异性结合，都可用于卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的检测。

本发明实施例1通过SELEX技术筛选得到的ssDNA核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本发明实施例的ssDNA核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于AFMP检测试剂盒中，且本发明实施例1的ssDNA核酸适配体相比于蛋白抗体具有制备周期短、重现性好、分子量小的特点，便于体外合成，在卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的检测领域有良好的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西科学院

<120> 一种核酸适配体及其在卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的应用

<130> 2018

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gacgcttact caggtgtgac tcgtcggtcg ggtggttggg gtgggtggtc ggtttttaag 60

ctgtgtcatt gtccgaagga cgcagatgaa gtctc 95

Claims

1.一种ssDNA 核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA 核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTCGGTCGGGTGGTTGGGG

TGGGTGGTCGGTTTTTAAGCTGTGTCATTGTCCGAAGGACGCAGATGAA GTCTC - 3’。

2.根据权利要求1所述的ssDNA 核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA 核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

3.根据权利要求2所述的ssDNA 核酸适配体，其特征在于，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的ssDNA 核酸适配体，其特征在于，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羧基四甲基罗丹明、羟基荧光素中的一种或多种。

5.一种应用如权利要求1所述ssDNA 核酸适配体的卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：对ssDNA 核酸适配体进行生物素标记；

步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nM的ssDNA 核酸适配体混合，并在冰上孵育结合40min，1000g离心去上清；待孵育结合后，清洗待测样品，混匀在200μlPBS溶液中，使用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测待测样品中是否有卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌；

所述应用不包括在疾病诊断中的应用。

6.如权利要求1所述ssDNA 核酸适配体在检测卵形鲳鲹源致病性溶藻弧菌中的用途，所述应用不包括在疾病诊断中的应用。