CN109161479A - 一种防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及果树医药领域，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法，所述药物包括主剂和辅料，所述主剂包括从苹果树中分离得到的有病原拮抗作用的内生菌发酵液及芸苔素内酯，辅料包括蜂蜡、食用油和吐温20。制备时，称取蜂蜡在恒温磁力搅拌器上进行磁力搅拌，待蜂蜡彻底溶化后加入食用油继续磁力搅拌；充分混匀后缓慢加入主剂继续搅拌，缓慢加入吐温20充分混合均匀后停止加热，边搅拌边冷却，随着温度降低，不断提高转速，制得成品药物。本发明药物对苹果腐烂病原菌具有较强的抑制作用、伤口组织可快速愈合，且成本低、可操作性强。

Description

一种防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及果树医药领域，具体涉及一种防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法。
背景技术
苹果腐烂病是我国北方苹果树重要病害，主要危害6年以上的苹果树，造成树势衰弱，枝干枯死，死树甚至毁园。
目前防治苹果腐烂病多采用化学试剂，虽然见效快、防治效果好，但长期使用化学杀菌剂不但会导致病原菌对其产生抗药性，还会造成农药残留和环境污染。因此，筛选经济高效、环境友好的生防菌，对进一步促进“低毒高效”的苹果树腐烂病防控模式的构建具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服上述缺陷，提供防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法。
植物内生菌是植物病害生物防治的天然资源菌，具有理论研究价值和开发应用前景。内生菌的研究始于19世纪中期，内生菌“endophyle”一词由Be barry首先提出。近几年来，内生菌对植物病害的生物防治作用及开发应用引起了植物学家、植物病理学家、微生物学家以及生态学家的广泛关注和重视。本发明利用从苹果树茎部、叶片、枝条和果实中分离得到的生防内生菌，研究苹果生防内生菌对苹果腐烂病的防治效果，利用微生物内生菌研究苹果腐烂病防治新方法，可以避免传统防治方法造成的环境污染和农药残留等问题，也为植物病害的防治提供新思路。
本发明的技术方案：一种防治苹果树腐烂病的药物，包括从苹果树中分离得到的对苹果树腐烂病有病原拮抗作用的内生菌发酵液；所述内生菌获得方法如下：
将果园中无腐烂病的健康苹果树的茎叶和果实用70％酒精浸泡3-5s，然后用1.0％次氯酸钠消毒10-20min，再用无菌水冲洗3-5次；再次进行表面消毒处理并用无菌水漂洗3-5次，将最后一次冲洗液作为对照涂布于平板以检测表面消毒是否彻底；
取表面消毒彻底的茎叶组织和苹果，将茎叶组织切成小块，苹果果实部分在经灭菌后的研钵中研磨成汁，无菌操作下分别接种在灭菌后的PDA固体培养基中，28℃无菌培养48h，然后采用平板划线法将组织块周围长出的菌落进行分离纯化，得到苹果内生菌；
采用平板对峙法，测定经过分离纯化后的内生菌对苹果腐烂病病原菌的抑菌活性：将活化后的苹果腐烂病病原菌菌落用打孔器打成直径为6mm的菌饼，置于PDA平板中央，用同样的方法在距其2cm处接种已经分离纯化的内生菌，每个平板接四个菌饼，在28℃下培养；以只接种苹果腐烂病病原菌的平板为对照，每处理做3个重复；待对照平板上长满菌丝时，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率，菌株生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％；
采用平板对峙法，从苹果树茎部、根部、叶片中分离的56株侯选菌株中，筛选12株有一定抑菌活性的内生菌，其中对苹果腐烂病菌的抑菌活性最强2个菌株命名为菌株T-07和T-09，选择这2株菌株作为最终的供试菌株；
采用平板对峙法探究所筛选的内生菌菌株T-07和T-09之间的拮抗性能，结果表明内生菌菌株T-07和T-09之间没有明显拮抗作用，可以混合使用，且混合后两者相互协同，抑制效果比单独菌株更好。
进一步的，所述内生菌发酵液经过离心和乙酸乙酯萃取。
进一步的，还包括生长素类物质，所述生长素类物质和内生菌发酵液混合形成主剂。
进一步的，所述生长素类物质为芸苔素内酯。
进一步的，还包括辅料，所述辅料包括蜂蜡、食用油和吐温20。
进一步的，按重量比，蜂蜡45-55份，食用油15-25份，芸苔素内脂0.1-0.3份，内生菌发酵液7-9份，吐温20为40-60份。
进一步的，按重量比，蜂蜡50份，食用油20份，芸苔素内脂0.2份，内生菌发酵液7.8份，吐温20为50份。
本发明还公开了一种前面所述防治苹果树腐烂病的药物的制备方法，按前面所述比例制备，包括：
(1)制备主剂，按照前面所述制备内生菌菌株，制备内生菌发酵液，并与芸苔素内酯混合形成主剂；
(2)称取蜂蜡置于烧杯中，在恒温磁力搅拌器上进行磁力搅拌，控制温度60-67℃，转速75-80r/min，并保持10min，使蜂蜡溶化，待蜂蜡彻底溶化后，停止加热，待容器内温度降至30℃-40℃时，加入食用油继续搅拌；
(3)边搅拌边观察混合物状态，再缓慢加入吐温20，充分混合均匀后停止加热，边搅拌边冷却至15℃，将其充分混匀后缓慢加入主剂，使之混合成为最终的膏状物，即制得成品药物。
进一步的，所述内生菌发酵液制备方法包括：
a将在4℃下保存的内生菌菌株转接到PDA液体培养基中活化3次，将菌株按照10％的接种量接种到PDA液体培养基中，25-29℃，180r/min培养4d；
b培养完毕后，分别将其培养液分装并用低温高速冷冻离心机在2-5℃，8-12min，6000r/min的条件下离心三次，每次取上清液，然后用一次性针孔式微孔滤器(0.22μm，50mm，水系，混合纤维)过滤，即得到内生菌的无菌离心液；
c将步骤b制备的无菌离心液以3500r/min离心9-12min，然后取上清液，将上清液用无水乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取液合并。
本发明与现有技术相比的有益效果：本发明经筛选对苹果腐烂病病原菌具有较强的抑制作用的苹果内生菌发酵液，和与之配用的生长素类物质、适宜药膏状制剂的辅料，以及相应简约的制作工艺，使所得药膏可以有效防治果树腐烂病，并可促进病疤的快速愈合，满足果树腐烂病防治的技术要求。制备方法成本低且可操作性强。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
一种防治苹果树腐烂病的药物，包括从苹果树中分离得到的对苹果树腐烂病有病原拮抗作用的内生菌发酵液；所述内生菌获得方法如下：
将果园中无腐烂病的健康苹果树的茎叶和果实用70％酒精浸泡3-5s，然后用1.0％次氯酸钠消毒10-20min，再用无菌水冲洗3-5次；再次进行表面消毒处理并用无菌水漂洗3-5次，将最后一次冲洗液作为对照涂布于平板以检测表面消毒是否彻底；
取表面消毒彻底的茎叶组织和苹果，将茎叶组织切成小块，苹果果实部分在经灭菌后的研钵中研磨成汁，无菌操作下分别接种在灭菌后的PDA固体培养基中，28℃无菌培养48h，然后采用平板划线法将组织块周围长出的菌落进行分离纯化，得到苹果内生菌；
采用平板对峙法，测定经过分离纯化后的内生菌对苹果腐烂病病原菌的抑菌活性：将活化后的苹果腐烂病病原菌菌落用打孔器打成直径为6mm的菌饼，置于PDA平板中央，用同样的方法在距其2cm处接种已经分离纯化的内生菌，每个平板接四个菌饼，在28℃下培养；以只接种苹果腐烂病病原菌的平板为对照，每处理做3个重复；待对照平板上长满菌丝时，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率，菌株生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％；
采用平板对峙法，从苹果树茎部、根部、叶片中分离的56株侯选菌株中，筛选12株有一定抑菌活性的内生菌，其中对苹果腐烂病菌的抑菌活性最强2个菌株命名为菌株T-07和T-09，选择这2株菌株作为最终的供试菌株；
采用平板对峙法探究所筛选的内生菌菌株T-07和T-09之间的拮抗性能，结果表明内生菌菌株T-07和T-09之间没有明显拮抗作用，可以混合使用，且混合后两者相互协同，抑制效果比单独菌株更好。
进一步的，所述内生菌发酵液经过离心和乙酸乙酯萃取。
进一步的，还包括生长素类物质，所述生长素类物质和内生菌发酵液混合形成主剂。
进一步的，所述生长素类物质为芸苔素内酯。
进一步的，还包括辅料，所述辅料包括蜂蜡、食用油和吐温20。
进一步的，按重量比，蜂蜡45-55份，食用油15-25份，芸苔素内脂0.1-0.3份，内生菌发酵液7-9份，吐温20为40-60份。
进一步的，按重量比，蜂蜡50份，食用油20份，芸苔素内脂0.2份，内生菌发酵液7.8份，吐温20为50份。
一种前面所述防治苹果树腐烂病的药物的制备方法，按前面所述比例制备，包括：
(1)制备主剂，按照前面所述制备内生菌菌株，制备内生菌发酵液，并与芸苔素内酯混合形成主剂；
(2)称取蜂蜡置于烧杯中，在恒温磁力搅拌器上进行磁力搅拌，控制温度60-67℃，转速75-80r/min，并保持10min，使蜂蜡溶化，待蜂蜡彻底溶化后，停止加热，待容器内温度降至30℃-40℃时，加入食用油继续搅拌；
(3)边搅拌边观察混合物状态，再缓慢加入吐温20，充分混合均匀后停止加热，边搅拌边冷却至15℃，将其充分混匀后缓慢加入主剂，使之混合成为最终的膏状物，即制得成品药物。
进一步的，所述内生菌发酵液制备方法包括：
a将在4℃下保存的内生菌菌株转接到PDA液体培养基中活化3次，将菌株按照10％的接种量接种到PDA液体培养基中，25-29℃，180r/min培养4d；
b培养完毕后，分别将其培养液分装并用低温高速冷冻离心机在2-5℃，8-12min，6000r/min的条件下离心三次，每次取上清液，然后用一次性针孔式微孔滤器(0.22μm，50mm，水系，混合纤维)过滤，即得到内生菌的无菌离心液；
c将步骤b制备的无菌离心液以3500r/min离心9-12min，然后取上清液，将上清液用无水乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取液合并。
实施例一：
本例内生菌提取物药膏用于苹果树腐烂病的防治。
药膏配比为：蜂蜡50g、食用油20g、含内生菌发酵液萃取液的混合药液8g(芸苔素内脂0.2g，内生菌发酵液7.8g)、吐温20用量为50g。
制备方法为：称取蜂蜡50g置于烧杯中，在恒温磁力搅拌器上进行磁力搅拌，控制温度60-67℃，转速75-80r/min，并保持10min，使蜂蜡溶化，待蜂蜡彻底溶化后，停止加热，待容器内温度降至30℃-40℃时，加入加入食用油20g并继续搅拌；继续搅拌，边搅拌边观察混合物状态，再缓慢加入50g吐温20，充分混合均匀后停止加热，边搅拌边冷却至15℃。将其充分混匀后缓慢加入主剂，使之混合成为最终的膏状物，即制得成品药物。
验证实验：实验选择在苹果树离体枝条上进行，在枝条上用烫伤接种法接种苹果腐烂病病原菌后再涂抹本试验产品，对照组为不加内生菌萃取液与芸苔素内脂的膏状物，黑暗保湿培养7-10天后观察并测量病斑大小，计算防病效果。
表1-1本例防治苹果树腐烂病效果
注：表中数值表示平均抑菌率±标准偏差
由上表可知，本申请药物可用于防治苹果树腐烂病。
防治效果对比实验：
实验选择在苹果树枝条上进行，在枝条上接种苹果腐烂病病原菌后再涂抹本试验产品，对照药剂为市售的老村长牌苹果腐烂病药膏，黑暗保湿培养7-10天后观察并测量病斑大小，观察病斑大小，计算防病效果。
表1-2本例防治苹果树腐烂病与市售药膏对比效果
注：表中数值表示平均抑菌率±标准偏差
愈伤效果对比实验：实验选择在苹果树枝条上进行，在枝条上接种苹果腐烂病病原菌后再涂抹本试验产品，对照药剂为市售苹果腐烂病药膏老村长，黑暗保湿培养7-10天后观察并测量病斑大小，观察愈伤组织的生长状况。其效果如表3所示：
表1-3本例愈伤宽度
注：表中数值表示平均病斑大小±标准偏差
由上可见：
1.本实施例药膏，可用于苹果树的腐烂病的防治；
2.本实施例药膏，防治苹果树腐烂病的效果优于市售的老村长药膏；
3.本实施例药膏，对苹果树腐烂病疤愈合效果优于市售的老村长药膏。
实施例二：
本实施例中药膏的成分配比为：蜂蜡45g、食用油15g、含内生菌发酵液萃取液的混合药液9g(芸苔素内脂0.2g，内生菌发酵液8.8g)、吐温20用量为40g。本实施例中药膏的制备方法与实施例一相同。
与实施例一操作相同，分别做验证实验、防治效果对比实验和愈伤效果对比实验，实验数据如下。
表2-1本例防治苹果树腐烂病效果
表2-2本例防治苹果树腐烂病与市售药膏对比效果
表2-3本例愈伤宽度
由上可见：
1.本实施例药膏，可用于苹果树的腐烂病的防治；
2.本实施例药膏，防治苹果树腐烂病的效果优于市售的老村长药膏；
3.本实施例药膏，对苹果树腐烂病疤愈合效果优于市售的老村长药膏。
实施例三：
本实施例中药膏的成分配比为：蜂蜡55g、食用油25g、含内生菌发酵液萃取液的混合药液9.3g(芸苔素内脂0.3g，内生菌发酵液9g)、吐温20用量为60g。本实施例中药膏的制备方法与实施例一相同。
与实施例一操作相同，分别做验证实验、防治效果对比实验和愈伤效果对比实验，实验数据如下。
表3-1本例防治苹果树腐烂病效果
表3-2本例防治苹果树腐烂病与市售药膏对比效果
表3-3本例愈伤宽度
由上可见：
1.本实施例药膏，可用于苹果树的腐烂病的防治；
2.本实施例药膏，防治苹果树腐烂病的效果优于市售的老村长药膏；
3.本实施例药膏，对苹果树腐烂病疤愈合效果优于市售的老村长药膏。
实施例四：
本实施例中药膏的成分配比为：蜂蜡48g、食用油18g、含内生菌发酵液萃取液的混合药液7.1g(芸苔素内脂0.1g，内生菌发酵液7g)、吐温20用量为45g。本实施例中药膏的制备方法与实施例一相同。
与实施例一操作相同，分别做验证实验、防治效果对比实验和愈伤效果对比实验，实验数据如下。
表4-1本例防治苹果树腐烂病效果
表4-2本例防治苹果树腐烂病与市售药膏对比效果
表4-3本例愈伤宽度
由上可见：
1.本实施例药膏，可用于苹果树的腐烂病的防治；
2.本实施例药膏，防治苹果树腐烂病的效果优于市售的老村长药膏；
3.本实施例药膏，对苹果树腐烂病疤愈合效果优于市售的老村长药膏。
实施例五：
本实施例中药膏的成分配比为：蜂蜡52g、食用油22g、含内生菌发酵液萃取液的混合药液7.5g(芸苔素内脂0.3g，内生菌发酵液7.2g)、吐温20用量为55g。本实施例中药膏的制备方法与实施例一相同。
与实施例一操作相同，分别做验证实验、防治效果对比实验和愈伤效果对比实验，实验数据如下。
表5-1本例防治苹果树腐烂病效果
表5-2本例防治苹果树腐烂病与市售药膏对比效果
表5-3本例愈伤宽度
由上可见：
1.本实施例药膏，可用于苹果树的腐烂病的防治；
2.本实施例药膏，防治苹果树腐烂病的效果优于市售的老村长药膏；
3.本实施例药膏，对苹果树腐烂病疤愈合效果优于市售的老村长药膏。

Claims (9)

1.一种防治苹果树腐烂病的药物，其特征在于，包括苹果树中分离得到的对苹果树腐烂病有病原拮抗作用的内生菌发酵液，所述内生菌获得方法如下：
将果园中无腐烂病的健康苹果树的茎叶和果实用70％酒精浸泡3-5s，然后用1.0％次氯酸钠消毒10-20min，再用无菌水冲洗3-5次；再次进行表面消毒处理并用无菌水漂洗3-5次，将最后一次冲洗液作为对照涂布于平板以检测表面消毒是否彻底；
取表面消毒彻底的茎叶组织和苹果，将茎叶组织切成小块，将苹果果实部分在灭菌后的研钵中研磨成汁，无菌操作下分别接种在灭菌后的PDA固体培养基中，28℃无菌培养48h，然后采用平板划线法将组织块周围长出的菌落进行分离纯化，得到苹果内生菌；
采用平板对峙法，测定经过分离纯化后的内生菌对苹果腐烂病病原菌的抑菌活性：将活化后的苹果腐烂病病原菌菌落用打孔器打成直径为6mm的菌饼，置于PDA平板中央，用同样的方法在距其2cm处接种已经分离纯化的内生菌，每个平板接四个菌饼，在28℃下培养；以只接种苹果腐烂病病原菌的平板为对照，每处理做3个重复；待对照平板上长满菌丝时，测量菌落直径，计算菌落生长抑制率，菌株生长抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％；
采用平板对峙法，从苹果树茎部、根部、叶片中分离的56株侯选菌株中，筛选12株有一定抑菌活性的内生菌，其中对苹果腐烂病菌的抑菌活性最强2个菌株命名为菌株T-07和T-09，选择这2株菌株作为最终的供试菌株；
采用平板对峙法探究所筛选的内生菌菌株T-07和T-09之间的拮抗性能，结果表明内生菌菌株T-07和T-09之间没有明显拮抗作用，可以混合使用，且混合后两者相互协同，抑制效果比单独菌株更好。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于：所述内生菌发酵液经过离心和乙酸乙酯萃取。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：还包括生长素类物质，所述生长素类物质和内生菌发酵液混合形成主剂。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于：所述生长素类物质为芸苔素内酯。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：还包括辅料，所述辅料包括蜂蜡、食用油和吐温20。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：按重量比，蜂蜡45-55份，食用油15-25份，芸苔素内脂0.1-0.3份，内生菌发酵液7-9份，吐温20为40-60份。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：按重量比，蜂蜡50份，食用油20份，芸苔素内脂0.2份，内生菌发酵液7.8份，吐温20为50份。
8.一种权利要求6或7任一项所述防治苹果树腐烂病的药物的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备主剂，按照权利要求1所述制备内生菌菌株，制备内生菌发酵液，并与芸苔素内酯混合形成主剂；
(2)称取蜂蜡置于烧杯中，在恒温磁力搅拌器上进行磁力搅拌，控制温度60-67℃，转速75-80r/min，并保持10min，使蜂蜡溶化，待蜂蜡彻底溶化后，停止加热，待容器内温度降至30℃-40℃时，按比例加入食用油继续搅拌；
(3)边搅拌边观察混合物状态，再缓慢加入吐温20，充分混合均匀后停止加热，边搅拌边冷却至15℃，将其充分混匀后缓慢加入主剂，使之混合成为最终的膏状物，即制得成品药物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述内生菌发酵液的制备方法包括：
a将在4℃下保存的内生菌菌株转接到PDA液体培养基中活化3次，将菌株按照10％的接种量接种到PDA液体培养基中，25-29℃，180r/min培养4d；
b培养完毕后，分别将其培养液分装并用低温高速冷冻离心机在2-5℃，8-12min，6000r/min的条件下离心三次，每次取上清液，然后用一次性针孔式微孔滤器(0.22μm，50mm，水系，混合纤维)过滤，即得到内生菌的无菌离心液；
c将步骤b制备的无菌离心液以3500r/min离心9-12min，然后取上清液，将上清液用无水乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取液合并。
CN201810930984.1A 2018-08-15 2018-08-15 一种防治苹果树腐烂病的药物及其制备方法 Pending CN109161479A (zh)

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